Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Bu prosedürün genel amacı, dentat girusun tek hücrelerini etiketlemek ve değiştirmek ve gelişimlerini takip etmektir. Bu, ilk olarak embriyonik günde, 15.5 veya 18.5'te beynin bir yarım küresine DNA enjekte edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, enjekte edilen DNA'nın gelişmekte olan dentat girus bölgesine elektropore edilmesidir.

Daha sonraki beyin kesitleri vibratör kullanılarak hazırlanır ve beyin dilimleri 14 güne kadar kültürde tutulur. Son adım, uygun antikorlar kullanılarak beyin dilimlerinin immünofloresan boyanmasıdır. Sonuç olarak, gelişmekte olan dentat girusun modifiye granül hücrelerindeki değişiklikleri göstermek için konfokal immünofloresan mikroskobu kullanılır.

Bu yöntem, farklı beyin bölgelerindeki belirli nöronal hücrelerin gelişiminde belirli genlerin rolü gibi nörobiyoloji alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Olgumuzda BC 11 B transkripsiyon faktörü girus gelişiminde rol oynamaktadır. Embriyoları içeren ötenazi yapılmış bir farenin rahmini diseke ederek işleme başlayın.

Buz üzerinde 15 ila 20 mililitre soğuk tam HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, her embriyoyu uterus boynuzundan ayırmak için bir makas kullanın. Daha sonra diseksiyon mikroskobu altında soğuk tam HBSS içeren ikinci bir Petri kabına yerleştirin, uterus kas duvarını kesin.

Embriyoyu yumurta sarısı torbasından ve plasentadan dikkatlice serbest bırakın. Ondan sonra. Ön limlerin hemen üzerindeki embriyoları 60 derecelik bir açıyla kesmek için bir çift bağ makası kullanın.

Deney embriyoların genotiplenmesini gerektiriyorsa, genomik DNA izolasyonu için bir doku örneği toplayın. Ardından kafayı temiz ve kuru bir Petri kabına aktarın. Baş 60 derecelik bir açıyla kesildiği için, sırt tarafı yukarı yerleştirildiğinde bir tarafa eğilmelidir.

Şimdi yarımkürenin ortasına, bgma'ya yakın bir iğneyi dikkatlice yerleştirin. Pico spritzer'ın pedalına basarak yaklaşık iki ila üç mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin. Üç, darbe başına 10 ila 15 milisaniye boyunca 30 pound basınç kullanarak.

Darbeler arasında bir saniye olacak şekilde beş ila sekiz darbe uygulamak. Elektrotları yerleştirmeden önce, embriyo O.'nun kafasına birkaç damla tam HBSS uygulayın.Daha sonra elektrotları, negatif terminal aynı tarafta olacak şekilde yerleştirin, enjekte edilen ventrikül ve pozitif elektrot, enjekte edilen ventrikülün karşı tarafında, embriyonun başının kulağının altında. Daha sonra, 50 voltluk beş darbe uygulayın.

Elektroporasyondan sonra. Embriyonun başını 15 ila 20 mililitre soğuk tam HBSS çözeltisi içeren bir tabağa yerleştirin. Embriyonun kafasındaki cildi soyun.

Daha sonra kafatasının orta hattındaki beyinciğin ortasında küçük bir kesi yapın. Yaylı makası insizyona yerleştirin ve sagital sütür boyunca uzunlamasına kesin. Kafatasını soyun ve beyni ondan ayırın.

Bu arada, %4 LMP aros'u soyulabilir bir kalıba dökün ve oda sıcaklığında soyun. Küçük bir kepçe spatula ile beyni tam HBSS'den çıkarın ve HBSS'nin fazlalığını ince kağıt mendil veya kimyasal mendil ile boşaltın. Tüm beyni nazikçe agar güllerinin içine yerleştirin ve ince bir iğne ile konumunu ayarlayın.

Agar gülü katılaşana ve blok bölümlere ayrılana kadar kalıbı buz üzerinde tutun. Şimdi LMP agros bloğunu kesin ve süper yapıştırıcı kullanarak numune aşamasına yapıştırın. Yapıştırıcı kuruduktan sonra, numune aşamasını vibratörün tampon tepsisine aktarın.

Blok çözeltiye daldırılana kadar buz gibi soğuk tam HBSS ile doldurun. Kesit almaya hazırlanmak için vibratörü uygun ayarlara getirin. İstenilen dokuyu içeren bölümleri arka beyinden başlayarak yavaş hızda kesin ve beyinden beş ila yedi bölüm toplayın.

Daha sonra bölümleri beş mililitre buz gibi soğuk, tam HBSS içeren altı kuyulu temiz bir kültür kabına aktarın ve tüm bölümler toplanana kadar buz üzerinde tutun. Daha sonra membran eklerini 1.8 mililitre dilim kültür ortamı içeren altı oyuklu bir plakaya yerleştirin. Bölümlerin oryantasyonunu kolaylaştırmak için bölümleri zarın üzerine yerleştirmeden önce zarı 100 mikrolitre tam HBSS ile çapraz şekilde nemlendirin.

Daha sonra, bölümleri zarın üzerine aktarın. Bir zar üzerine en fazla beş bölüm yerleştirin ve bölümleri birbiriyle örtüştürmeyin. Bir pipet kullanarak zardaki fazla HBSS'yi alın.

Kültür kabını in vitro olarak 11 veya 14 gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin ve ortamın yarısını her gün değiştirin. Bu aşamada, kültür süresinin ilk 20 saati boyunca ortama çoğalan hücreleri etiketlemek için bromo deoksiüridin gibi reaktifler ekleyin. Bu adımda, zarı bölümlerin yönüne göre kesmek için temiz ve keskin bir neşter bıçağı kullanın.

Bölümleri zarla birlikte bir mililitre% 4 PFA içeren 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve bölümleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, her yıkamada 15 dakika boyunca bir XPBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, bölümleri gece boyunca dört santigrat derecede geçirgen çözelti ile ertesi gün hafif çalkalama ile inkübe edin, bölümleri uygun birincil antikorlar, seyreltilmiş ve geçirgen çözelti ile gece boyunca veya hafif çalkalama ile dört santigrat derecede 48 saat inkübe edin.

Daha sonra, bölümleri bir XPBS ile 15 dakika boyunca üç kez yıkayın ve uygun ikincil antikorlar, seyreltilmiş ve geçirgen çözelti ile gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bölümleri bir XPBS ile 15 dakika boyunca bir kez yıkayın, ardından 10 dakika boyunca dappy boyama yapın, bölümleri her biri 15 dakika boyunca bir XPBS ile üç kez yıkayın ve mikroskop slaytlarına aktarın. İmmün montajı ekleyin ve nazikçe.

Bölümlerin üzerine bir lamel yerleştirin. Slaytları gece boyunca dört santigrat derecede kurutun ve konfokal mikroskopi ile analiz etmeden önce oje ile kapatın. Burada gösterilen, GFP'yi eksprese eden DNA'nın bir hemisfere enjeksiyonu ve ardından elektroporasyondan 18.5. günde immüno boyamadır.

Bu görüntü, DPI boyamayı gösterir, GFP boyaması bu görüntüde gösterilir ve birleştirilmiş görüntü burada gösterilir. Bu şekil, BCL 11 B'nin X utero ile mozaik delesyonunu, elektroporasyonu ve ardından organotipik dilimi göstermektedir. Kültür kesitleri, GFP ve NeuroD'yi tanıyan antikorlar kullanılarak immüno boyandı, GFP ve BCL L 11 B'yi gösteren iç kısımlar. Daha yüksek büyütmede boyama, Cree rekombinaz eksprese eden hücrelerde BCL 11 B ekspresyonunun kaybını gösterir.

İşte GFP, nöro D ve GFP nöro D pozitif hücrelerin istatistiksel analizi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört embriyo için iki buçuk saat yapılabilir. Bu prosedürü denerken, dokuyu dikkatli bir şekilde tutmayı ve kontaminasyonu önlemeyi unutmamak önemlidir.