Name: Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Öğrenin fare hipokampal dokusunda ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürü ile tek hücreleri etiketleme ve gen düzenlemesini inceleme yöntemini. Bu teknik nörogelişim süreçlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft'tan SB'ye (BR-2215; SFB 497/A9).

NOT: Tüm hayvan deneyleri Alman yasalarına uygun olarak yürütülmüştür ve Tübingen devlet daireleri tarafından onaylandı. Mikropipetler, Çözümler ve Membran 1. Hazırlık <ol><li> Mikropipetler hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki program ile bir mikropipet çektirmenin kullanarak cam mikropipetler çekin: Heat: 540, Pull: 125, Hız: 20 ve Gecikme: 140. iğne uzunluğu miktarda 5,5 cm. </li><li> Bir microgrinder kullanılarak Konik iğneleri 4 mm, uygun bir uç boyutu elde edildi. Ipuçları zarar görmemesi için bir kutu ya da 15 cm Petri kabındaki iğneler saklayın. </li></ol></li><li> Çözümler hazırlanması <ol><li> Plazmid DNA Çözelti <ol><li> Üreticinin protokolüne göre bir Endotoksin serbest Maxi prep kiti kullanarak istenen cDNA, konstrüktünü ihtiva eden plazmid DNA hazırlanması. </li><li> DNA (GFP başak vektör olmaksızın) 3 ug / ul nihai konsantrasyona kadar çözelti veya 4 ayarlama ug /ul endotoksinde (GFP başak vektörünün 1 ug) Hızlı Green (nihai konsantrasyon% 0.05) ihtiva eden Tris-EDTA tampon maddesi boşaltın. </li></ol></li><li> Laminin Stok çözümü <ol><li> 1 ml&#39;lik bir son hacme kadar steril su içinde laminin, 1 mg eritin. -80 ° C&#39;de 100 ul alikotları ve mağaza hazırlayın. </li></ol></li><li> Poli-L-Lizin Stok Çözeltisi <ol><li> 1 mg / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar steril su, 50 ml poli-L-lisin, 50 mg eritin. -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve mağaza hazırlayın. </li></ol></li><li> Hank Dengeli Tuz Çözeltisi doldurun (Tam HBSS) <ol><li> CaCl2, 10 mi, 100 mM MgSO 4 10x HBSS 100 mi, 1 M HEPES tamponu, 2.5 ml (pH 7.4), 1 M, D-glikoz, 30 mi, 100 mM, 10 ml birleştirilerek tam HBSS hazırlayın ve 4 1 ml M NaHCO 3. 4 ° C&#39;de 1 L ve saklamak için steril su ekleyin. NOT: Otoklav tüm çözümler 1 M HEPES tampon bekliyoruz ve 1 M D-glikoz, fil vardırter sterilize. </li></ol></li><li> Dilim Kültür Orta <ol><li> Bazal Orta Eagle 35 ml tam HBSS 12.9 mi (1.2.4), 1 M, D-glikoz, 1.35 ml, 200 mM L-glutamin, 250 ul ve 500 ul ekleyerek dilim kültür ortamı hazırlayın penisilin-streptomisin 50 ml&#39;lik bir nihai hacim elde etmek. 4 ° C&#39;de bir son% 5 konsantrasyon ve saklamak için at serumu ekleyin. </li></ol></li><li> Düşük bir erime noktası (SAT) Agaroz <ol><li> Agaroz yüksek güçte 1-2 dakika boyunca bir mikrodalga fırın içinde ısıtılması ve ardından tam HBSS, 50 ml (1.2.4) LMP 2 g ekleyerek% 4 LMP agaroz çözelti hazırlayın. 39 ° C - 37 ° C&#39;deki bir su banyosu içinde, bu çözüm tutun. 4 ° C ve yeniden de çözüm saklayın. </li></ol></li><li> Paraformaldehyde Çözüm <ol><li> Bir çeker ocak içinde 1 x PBS, 100 ml paraformaldeid 4 g ekleyerek% 4 paraformaldehit (PFA) solüsyon hazırlanır. 60 ° C&#39;ye ısıtın çözeltisi ve çözelti C olana kadar, 1 N NaOH ile bir kaç damlaemizle. </li></ol></li><li> Permeabilizasyon Çözüm <ol><li> 4 ° C&#39;de% 0.3 Triton X-100 ve mağaza içeren 1x PBS 300 ml BSA, 9 g eritin. Uzun süreli depolama için% 10 sodyum azid ekleyin. </li></ol></li></ol></li><li> Membran Ek&#39;lerin Kaplama <ol><li> 12 ml&#39;lik bir son hacme kadar laminin stok çözeltisi (1.2.2) ve steril su içinde poli-L-lisin stok çözeltisi (1.2.3) bir alikotu bir kısım seyreltin. </li><li> Steril su içeren her 2 ml 6 yuvalı plakalara membran geçme yerleştirin. Zarın üzerine kaplama solüsyonu 1 ml ilave edilir ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra membran steril su ve kuru, 1 ml ile üç kez ekler yıkayın. Kuru 6 oyuklu bir plaka içerisinde dört hafta boyunca 4 ° C&#39;de aynı gün ya da mağaza Kaplanmış zar, monte edilmelidir. </li></ol></li></ol> 2. DNA Enjeksiyon ve E15.5 Elektroporasyon ve E18.5 Embriyolar <ol><li&gt;% 5 izofluran ile doyurulmuş ve bir buharlaştıncıya bağlı bir anestezi bölmesi içine yerleştirilerek dişi fare şeklindeki bir saat anestezisi. 1 L / dakikalık bir hızda, izofluran ve oksijen sirküle. 2-4 dakika ya da fare pençeleri arasında sıkıştırarak test edildiği bilinçsiz kadar kutuya hayvan tutun. </li><li> Embriyonik gün servikal dislokasyon (E) 15.5 18.5 veya tarafından bilinçsiz fare Euthanize. Embriyoları 13 içeren rahim inceleyin ve soğuk komple HBSS 15-20 ml içeren bir Petri kabı içine yerleştirin. NOT: Bu noktadan itibaren, buz üzerinde embriyo ve dokuları tutmak. </li><li> Soğuk tam HBSS içeren ikinci bir Petri kabı içine uterin boynuz ve yerden her embriyo ayırmak için bir makas kullanın. </li><li> Bir mikroskop altında, rahim kas duvarı ve ince forseps (# 55) ve bir makas kullanarak plasentayı sever. Dikkatle sarısı kesesi embriyo serbest bırakın. </li><li> Decapitat Bonn bir makas kullanınSadece 60 ° açıyla ön ayakları üzerinde e embriyolar. Deney embriyoların genotipleme gerektiriyorsa, genomik DNA izolasyonu için bir doku numunesi (kuyruk küçük bir parça) toplar. </li><li> Temiz ve kuru bir Petri kabı baş aktarın. Kafası 60 ° açı decapitated olmuştu Çünkü sırt tarafı yukarı yerleştirildiğinde, baş bir tarafa eğin gerekir. </li><li> Bregmaya hemisfer yakın ortasına dikkatli bir iğne yerleştirin (Şekil 1A, B). 5-8 bakliyat uygulayarak, darbe başına 10-15 milisaniye süresince basınç 30 £ kullanarak Picospritzer III pedala basarak DNA çözüm (3 veya 4 ug / ul at) yaklaşık 2-3 ul enjekte edilir. puls süresi ve sayısı, daha fazla zaman gerektiren küçük açıklıklar iğne açıklığının çapına bağlıdır. Her darbe arasındaki aralık 1 sn tutarlar. </li><li> Elektrotlar yerleştirerek önce EMBR kafasına tam HBSS birkaç damla uygulamakyo. &quot;Negatif&quot; terminali enjekte ventrikül ve embriyonun kafasının (Şekil 1C, D) kulak altına enjekte ventrikül karşı tarafında &quot;pozitif&quot; elektrod ile aynı tarafta kalacak şekilde elektrotlar yerleştirin. 50 V 5 bakliyat uygulayın <ol><li> E 18.5 için E 15.5 için 3 mm elektrotları ve 5 mm elektrotları kullanın. </li></ol></li></ol> Beyin 3. Diseksiyon <ol><li> Elektroporasyondan sonra, ince forseps bir çift yardımı ile baş deri soyulabilir. Yay makas kullanılarak kafatasının orta hat beyincik ortasında küçük bir kesi yapmak. </li><li> Kesi içine yaylı makas yerleştirin ve sagital sütür boyunca uzunlamasına kesin. Kafatasını kalkmasına ve ince forseps kullanarak kafatası beyni ayırın. 15-20 ml soğuk komple HBSS çözeltisi içine bütün beyin aktarın. </li><li> Bu arada,% 4 LMP agaroz dökünAyrılabilen uzak kalıp içine, bir su banyosu içinde 37-39 ° C&#39;de tutuldu. </li><li> Küçük kepçe spatula ile tam HBSS dışarı beyin alın ve ince doku kağıt veya Kimwipes kullanarak HBSS aşırı boşaltın. </li><li> Agaroz içine yavaşça bütün beyin yerleştirin ve ince bir iğne ile konumunu ayarlamak. Agaroz katılaşmış ve blok (koronal bölümleri için koku ampuller kadar gelin) kesitli kadar buz üzerinde kalıp tutun. </li></ol> 4. Vibratome Kesit ve Dilim Kültür <ol><li> LMP agaroz blokları Trim ve &#39;süper tutkal&#39; kullanarak numune aşamasına tutkal onları. Tutkal sonra kuru transfer vibratome tampon tepsiye örnek aşamasıdır ve blok çözeltisi batırılır kadar HBSS tamamlamak soğuk buz ile doldurun. NOT: kesit önce% 70 etanol ile tüm enstrüman ve ekipman yüzeyleri sterilize edin. </li><li> Takip gibi yeni bir bıçak kullanarak 250 mikron kalınlığında vibratome bölümleri hazırlayın. <ol><li> Blok wi TrimAşağıdaki ayarları inci; Frekans - 60 Hz, genlik - 0.7 mikron, hız 16-18 mm / sn. Yavaş hızda (9 mm / sn) yukarıdaki ayarlarla istenilen doku içeren bölümleri kesin. Beyin gelen kesit başlayarak, beyin 5-7 bölümleri toplamak. </li><li> Bükük spatula yardımı ile HBSS tamamlamak ve tüm bölümleri (Şekil 1E) tahsil edilene kadar buz üzerinde tutmak soğuk buz 5 ml içeren bir temiz 6 kuyu kültür çanak bölümleri aktarın. </li></ol></li><li> Bölümlerin yönelimleri için, zar üzerinde bölümleri yerleştirmeden önce tam HBSS 100 ul ile çapraz bir şekilde membran ıslatın. </li><li> (Membran üzerine bölümüne itmek için forseps kullanabilir sonra forseps ile bölümün bir köşesini pick up ve spatula üzerine çekin ve) membran üzerine bükülmüş bir spatula kullanarak bölümleri aktarın. Bir zar üzerinde beş bölümden kadar yerleştirin ve (forseps kullanarak Şekil 1F düzenlemek). Birbirleri ile bölümleri üst üste etmeyin. <ol><li> Bir pipet kullanarak zarın kapalı HBSS fazlalığı alın. Burada kullanılan özel membranları ve çerçeveye bağlı olarak doku temas ancak orta kapsamadığı sağlar doku kültür plakasının içine yerleştirilir. </li></ol></li><li> Dilim kültür ortamında (1.2.5) (Şekil 1G, lH), 1.8 ml su ihtiva eden bir 6 yuvalı plaka halinde membran geçme yerleştirin. 11 DIV veya 14 DIV için% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de kültür kaplarına inkübe edin. Yarım orta (0,9 ml), her ikinci gün değiştirin. NOT: Bu aşamada, bromodeoksiüridin gibi reaktifler ekleyerek (BrdU 10 uM nihai konsantrasyon) Etiketleme kültür zaman, ilk 20 saat boyunca ortama hücreler proliferasyon için. </li></ol> İmmünofloresan Boyama Ardından Bölüm 5. Sabitleme <ol><li> Kesmek için temiz ve keskin neşter bıçağı kullanın ve yönüne bağlı olarak membranlar Döşemebölümler. </li><li> % 4 PFA (1.2.7) 1 ml ihtiva eden bir 24 yuvalı plaka zar ile birlikte bölümleri aktarın. 15 dakika her biri için 1 x PBS ile 3 kez yıkanmasından sonra, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bölümler inkübe edin. Hafifçe çalkalama ile 4 ° C&#39;de permeabilizasyon çözeltisi ile bölümleri O / N inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, permeabilizasyon çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun primer antikorlar ile bölümleri inkübe O / N veya yumuşak çalkalama ile 4 ° C&#39;de 48 saat karıştırıldı. </li><li> 1x PBS ile 15 dakika boyunca bölümleri 3 kez yıkayın ve permeabilizasyon çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorlar ile 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Sekonder antikor ile inkübe edildikten sonra, 10 dakika süre ile DAPI lekelemesi yoluyla, ardından 15 dakika boyunca 1 x PBS ile bir kez bölümleri yıkayın. </li><li> 15 dakika her biri için bölümleri 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve slaytlar mikroskop transfer. ImmunoMount ekleyin ve yavaşça bölümlerin üstüne bir lamel. 4 ° C ve se de slaytlar O / N kurulayınoje ile ark. NOT: Her zaman 4 ° C&#39;de slaytlar tutun. <ol><li> Konfokal mikroskopi (Şekil 1I) tarafından dilim kültürleri analiz. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li>
<li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+dentate+gyrus%3A+what+we+are+learning+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants.</a> Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).</li>
<li>Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+transcriptional+control+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis.</a> Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+dentate+gyrus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis.</a> Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li>
<li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+of+Bcl11b%2FCtip2+in+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> Embo J. 31, 2922-2936 (2012).</li>
<li>Pilaz, L. J., Silver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+mitosis+in+the+developing+mouse+embryonic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Hand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-62 (2005).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), 19(2002).</li>
<li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J Vis Exp. (2), (2007).</li>
<li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li>
<li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmoplakin%3A+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li>
<li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants%3A+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

hipokampus öğrenme ve hafızada önemli bir işleve sahiptir. dentat girus da nöron gelişimi sırasında aynı zamanda yetişkinlik boyunca sadece oluşur iki beyin bölgelerinden biridir. Doğum sonrası ve bir çok yaygın faktörleri söz konusu eden benzer bir şekilde, yetişkin hipokampal nöron ilerler. Bu faktörlerin düzenleyici mekanizmaların tanımlanması da yeni tedaviler ve önleyici tedbirlere yol açacaktır nörodejeneratif hastalıkların anlaşılmasında çok yararlı olacaktır. Bu bilgiyi edinmek için bir tek hücre manipüle ve Org...

hipokampus bir hafıza ve öğrenmede önemli rol yanı sıra duygusal davranış oynar. Bir ana işlevi sinir sisteminin yüksek plastisite gerektiren uzun süreli belleğe kısa süreli hafıza konsolidasyon oluşur. hipokampus dentat girus giriş bilgileri için birincil ağ geçidi gibi davranır ve yetişkinlik 1,2 genelinde de devam eden nöron iki beyin bölgelerinden biri olduğunu. Hipokampal yapının geliştirilmesi geç embriyojenez sırasında ve özellikle de ilk 3-4 hafta postnatal 3 sırasında meydana gelir. Dentate erken gelişimi sırasında kök hücre havuzu yetişkin nöron 4 yanı sıra postnatal için gerekli kurdu olan gyrus. Gelişmekte nöronlar postnatal yanı sıra yetişkin nöron sırasında olgunlaşmamış ve nihayet olgun nöron progenitör hücrelerin çeşitli aşamalardan kök hücreden, çeşitli aşamalardan geçer. Nöron ifadesi farklı aşamalarındaBelirli genler hipokampal devresi 5,6 içine olgunlaşmasını ve yeni nöronların entegrasyonu sağlamak için gereklidir. Bu genlerin çoğunun ifade desen ve fonksiyon tanımlayan izin fare genetik ve immünohistokimyasal olarak fenotip analizinin yanı sıra moleküler yöntemler kullanılarak. Ilave mikroarray analizi gibi kromatin immunoprecipitation (ChIP) potansiyel doğrudan ve dolaylı hedef genlerin 7,8 hakkında bilgi verdi. Ancak, kıvrımlarının gelişiminde özellikle hipokampal gelişim düzenleyici mekanizmaları ile ilgili pek çok açık sorular, hala vardır. Aşağı veya yukarı-regülasyonu faiz ve / veya hedef genlerin ve gelişim sırasında kaderlerini takip geninin spesifik genlerin hücre az sayıda manipülasyon izin gerekli bir sistem nasıl düzenlendiği ileri fikir edinmek için. Utero elektroporasyon shRNAs, ilgi veya Cre recombina genlerinin cDNAse böyle bir araç sağlar. Elektroporasyon için kullanılmalıdır arzu edilen DNA ya da küçük RNA&#39;ların sentezleme plazmidlerin varlığını sağlamak. Bu yaklaşım çok başarılı nedeniyle derin beyin tabakalarında hipokampal yapıların konumuna dentat girus gelişimini inceleyen bir daha zorlu bir yaklaşım kortikal gelişimini 9,10 okuyan uygulanan, ancak mesafesindedir. Organotipik dilim kültür ardından Ex utero elektroporasyon bu sorunu aşmak 11,12 bir yaklaşımdır. Aksine utero elektroporasyon değil bütün embriyo ancak kafa nedenle hipokampus ve dentat girus doğru shRNA / DNA doğrudan daha uygun bir şekilde elektrotlar yerleştirmek için izin kullanılan mi. Grubumuz başarıyla dentat girus gelişimi 8 sırasında transkripsiyon faktörü Bcl11b rolünü incelemek için ex utero elektroporasyon istihdam. Bcl11b r tarafından dentat girus gelişiminde ikili bir rolü vardırimmünohistokimya ile gösterilmiş olduğu üzere, progenitör hücre çoğalması aynı zamanda farklılaşma egulating. Bundan başka, bu işlemlerde Bcl11b katılımı için bir mekanizma olarak tanımlamak için, Polleux grubunun 11,12 protokoller, protokol bölümünde aşağıda anlatıldığı gibi dentat girus çalışma ayarlanmıştır. İlk yaklaşımda soru Bcl11b özerk nöronal hücre farklılaşması hücre düzenleyen olup olmadığını ele alındı. İkinci bir yaklaşım Desmoplakin, Bcl11b doğrudan hedef gen, Bcl11b fenotip kurtarmak için yeterli olup olmadığı incelenmiştir.

<table><tbody><tr><td>Alevli / Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Instruments Company (ABD)</td> <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>İnce Cam Pipetler</td><td>Warner Instruments</td><td>G100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroöğütücü</td><td>Narishige, Japonya</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Anestezik Braket ünitesi</td><td>Harvard Aparatı</td><td>PY2 34-0412</td><td></td></tr><tr><td>Halovet Buharlaştırıcı</td><td>Harvard Aparatı</td><td>PY2 34-0398</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac Sistemi</td><td>Harvard Aparatı</td><td>PY2 34-0387</td><td></td></tr><tr><td>IMS Fluosorber</td><td>Harvard Aparatı</td><td>PY2 34-0415</td><td></td></tr><tr><td>Anestezi Odası</td><td>Harvard Aparatı</td><td>PY2 34-0460</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>BEX Company</td><td>CUY21 DÜZENLE</td><td></td></tr><tr><td>Disk elektrotlu cımbız</td><td>BEX Company</td><td>LF650P3</td><td>3 mm elektrotlar için E15.5</td></tr><tr><td>Disk elektrotlu cımbız</td><td>BEX Company</td><td>LF650P5</td><td>E18.5</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>P/N 052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>HM 650 V Titreşimli Bıçaklı Mikrotom, 230 V</td><td>Thermo Scientific</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Carl Zeiss Mikroskopi Gmbh</td><td>Stemi SV8</td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Sp5II</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu çanak</td><td>BD Falcon</td><td>#353502</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu çanak</td><td>CELLTAR</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü ekleri</td><td>BD Falcon</td><td>#353090</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>#L2020</tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>Sigma</td><td>#P5899</td><td></td></tr><tr><td>Yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra İnce Bonn Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Dumont #55</td><td>11255-20 Inox</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>41010-26</td><td></td></tr></tbody></table> arası

fare hipokampal doku ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültür

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Fare genetiği, gelişim sırasında belirli genlerin rolünü belirleyen güçlü bir araç sunar. Elde edilen fenotiplerin immünohistokimyasal ve moleküler yöntemlerle analiz edilmesi, potansiyel hedef genler ve sinyal yolakları hakkında bilgi sağlar. Spesifik düzenleyici mekanizmaları daha da aydınlatmak için, belirli bir dokunun sadece az sayıda hücresinin aşırı ekspresyonu, ablasyonu veya belirli genlerin yeniden eklenmesi yoluyla manipüle edilmesine izin veren ve gelişim sırasındaki kaderlerini takip eden bir sistem gerekir. Bunu başarmak için hipokampal yapıların, özellikle dentat girusun ex utero elektroporasyonu, ardından organotipik dilim kültürü böyle bir araç sağlar. Mozaik delesyonları oluşturmak için bu sistemin kullanılması, ilgilenilen genin progenitör hücre proliferasyonu veya nöronal farklılaşma gibi hücre özerk gelişimsel süreçlerini düzenleyip düzenlemediğini belirlemeye izin verir. Ayrıca, silinen geni veya hedef genlerini yeniden tanıtarak fenotiplerin kurtarılmasını kolaylaştırır. In utero elektroporasyonun aksine, ex utero yaklaşımı, dentat girus gibi beynin daha derin katmanlarını başarılı bir şekilde hedefleme oranını artırır. Genel olarak, ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürü, endojen koşulları yansıtan yarı doğal bir ortamda düzenleyici mekanizmaları incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Transkripsiyon faktörü Bcl11b ablasyonu projenitör hücre çoğalması ve azaltılmış dentat girus boyutu ve hücre sayısı ile sonuçlanan nöronal farklılaşma kayıplarına neden olur. Ayrıca mutant nöronlar öğrenme ve bellek bozukluğu 8 neden hipokampal devresine entegre başarısız. Eski utero elektroporasyon kullanılmıştır bu süreçlerde Bcl11b düzenleyici mekanizma (lar) ile ilgili soruları cevaplamak için. Soru hitaben Bcl11b hücre-özerk E15.5 Bcl11b flox / flox hipok...

Burada, hipokampal gelişim sırasında belirli genlerin düzenleyici mekanizmalarını incelemek için bir araç sağlayan bir protokol sunuyoruz. Ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürünün kullanılması, tek hücrelerde ilgilenilen genlerin ekspresyonunun yukarı ve aşağı regülasyonuna izin verir ve gelişim sırasında kaderlerini takip eder.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Bu prosedürün genel amacı, dentat girusun tekil hücrelerini işaretleyip modifiye etmek ve gelişimlerini takip etmektir. Bu işlem, öncelikle embriyonik gün 15,5 veya 18,5'te beynin bir hemisferine DNA enjekte edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise, enjekte edilen DNA'nın gelişmekte olan dentat gyrus bölgesine elektroporasyonla aktarılmasıdır.Sıradaki beyin kesitleri bir vibratör kullanılarak hazırlanır ve beyin dilimleri 14 güne kadar kültürde tutulur. Son adım, uygun antikorlar kullanılarak beyin dilimlerinin immünofloresan boyamasının yapılmasıdır. Nihayetinde, gelişmekte olan dentate gyrus'un modifiye granül hücrelerindeki değişiklikleri göstermek için konfokal immünofloresan mikroskopi kullanılır.Bu yöntem, farklı beyin bölgelerindeki belirli nöronal hücrelerin gelişiminde spesifik genlerin rolü gibi nörobiyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bizim durumumuzda, girus gelişimindeki BC 11 B transkripsiyon faktörü incelenmiştir. İşleme, embriyoları içeren ötanize edilmiş bir fare rahmini disseke ederek başlayın.Bunu, buz üzerinde 15 ila 20 mililitre soğuk complete HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, her bir embriyoyu uterus korn

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-culture-mouse-hippocampal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz periferik sinir akıbet ekimi ve zaman atlamalı görüntüleme için gebeliğin orta fare embriyo Organotipik dilim hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Kaynak: Keener, D. G., et al. Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü İnhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültüründe Tek Hücreli Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. (2020).Bu video, fare hipokampal dilim kültürleri içindeki nöronlara plazmit DNA'yı sokmak için tek hücreli elektroporasyon sürecini göstermektedir. Prosedür, nöronal zarı geçici olarak geçirgen geçirgen hale getirmek ve gen transferini kolaylaştırmak için hassas pipet konumlandırma, basınç ayarlamaları ve elektroporasyon...

Fare Hipokampal Dilim Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon Yoluyla Gen İfadesi

Bu video, bir dizi in vitro hipokampal dilim kültürü boyunca hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlardaki genlerin tek hücreli elektroporasyonu için protokolü göstermektedir. Teknik, hücre otonom mekanizmaları ve transsinaptik protein etkileşimleri dahil olmak üzere nöronların spesifik moleküler ve fizyolojik fonksiyonlarını incelemek için yararlıdır.

Organotipik Beyin Dilimi Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon: Beyin Hipokampal Dilimlerinde Hedeflenen Nöronların İçine Plazmitleri Vermek İçin İn Vitro Bir Teknik

Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam...

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Öğrenin fare hipokampal dokusunda ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürü ile tek hücreleri etiketleme ve gen düzenlemesini inceleme yöntemini. Bu teknik nörogelişim süreçlerini anlamaya yardımcı olur.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Daha fazla video keşfet