Farelerde Kararlı Yüksek seviyeli Kemik İliği Kimerizm Yaratma için miyelosupresif Ajan olarak Busulfan

Bu prosedürün genel amacı, alıcı farelerin kemik iliği kompartmanını, yaygın olarak yeşil floresan protein eksprese eden donör farelerin kemik iliği hücreleriyle değiştirmektir. Işınlama olmaksızın; bu işlem, öncelikle alıcı fareye miyelosüpresif bir bileşik olan busalan'ın ardışık intraperitonal enjeksiyonları ile kondisyonlama yapılarak gerçekleştirilir.

Ardından, yaygın olarak yeşil floresan protein ifade eden donör bir farenin femur ve tibialarından kemik iliği hücreleri izole edilir. Son olarak, donör kemik iliği hücreleri, kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla kondisyonlanmış alıcı fareye nakledilir. Nihayetinde, nakil yapılan fareden kan toplanır ve kemik iliği şimerizminin düzeyini tahmin etmek için akış sitometrisi ile analiz edilir.

Bu tekniğin total vücut ışınlaması gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, total vücut ışınlamasının sitotoksik etkileri olmadan ve özel tesis ve ekipmanlara ihtiyaç duymadan yüksek derecede kemik iliği şimerizminin sağlanabilmesidir. Bu yöntem sadece kemik iliği kaynaklı hücrelerin merkezi sinir sisteminde birikiminin incelenmesine olanak tanımakla kalmaz, aynı zamanda hematopoetik soy gelişimi, immünobiyoloji ve lösemi gibi araştırma konularının çalışılmasında da kullanılabilir. Alıcı fareleri hazırlamak için, metin protokolüne göre seyreltilmiş busulfan hazırlayın ve alıcı farelere günlük kilogram başına 20 mg dozda IP enjeksiyon uygulayın.

Fareler, kurumsal kılavuzlara uygun olarak ötanize edildikten sonra, laminar akışlı kabin altında, fareye %70 ethanol püskürtün. Karın bölgesindeki deriyi kaldırın ve cerrahi makasla, ayağı tutarak ayak bileğine doğru bacak boyunca, karın boşluğundaki deriden başlayarak bir insizyon yapın. Deriyi ayak bileğinden kalçaya doğru sıkıca çekerek bacak dokusunu açığa çıkarın.

Ayağı nazikçe çekerken, kalça eklemini açığa çıkarmak için femur üzerindeki kas ve yağ dokularını temizleyin. Bacağı uzatmak için makasla pelvik kemiklere baskı uygulayın ve femura zarar vermemeye dikkat ederek femur başının hemen üzerinden kesin. Sterilitenin korunmasına yardımcı olmak için bacağı ayağından tutun ve femurda kalan dokuları makasla temizleyip kemik yüzeyini ovalamak için otoklavlanmış dokular kullanın.

Diz ekleminden keserek femur ve tibianın ayrımını yapın ve femuru PBS içeren bir kültür kabına yerleştirip buz üzerinde inkübe edin. Ardından, fibulanın tibiaya bağlandığı noktalardan keserek fibulayı çıkarın ve atın. Sonrasında tibianın temizliğini yapın.

Kırmızı iliğin bittiği yerden tibia kesilerek ayağı çıkarın ve tibiayı femur ile birlikte kültür kabına yerleştirip buz üzerinde inkübe edin. Femuru tutmak için pens kullanın ve cerrahi makasla kemiğin distal uçlarını dikkatlice tıraşlayın. Medüller boşluğu açığa çıkarmak için kemikten mümkün olduğunca az kısmını alın ve üç mililitre steril PBS kullanın.

Bir şırıngayı doldurun ve 23 gauge bir iğne takın. İğneyi medüller boşluğa dikkatlice batırın ve kemik iliğini steril bir kültür kabına boşaltın. Ekstraksiyon sonrası istenen tüm hücrelerin alındığından emin olmak için iğne ucunu kullanarak medüller boşluğu sıyırın.

Kırmızı kemik iliğinin artık görünmediğinden ve kemiğin beyaz göründüğünden emin olun. Tibiayı tutmak için pens kullanın ve cerrahi makasla, tibianın dize bağlı olduğu uç kısmı dikkatlice tıraşlayın. Medüller kaviteyi açığa çıkarmak için, bir şırıngayı üç mililitre steril PBS ile doldurun ve 25 gauge bir iğne takın.

İğneyi dikkatlice medüller kaviteye sokun ve kemik iliğini, femurlerden toplanan kemik iliği kabına boşaltın. Hücreleri ayrıştırmak için bir mililitrelik pipet ucuyla kemik iliğini nazikçe triture edin. Hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir sepet filtreden geçirerek steril 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Kalan hücreleri toplamak için kabı PBS ile durulayın ve tamponu filtre üzerinden santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe, toplam hacim 30 ila 40 mililitre olacak şekilde PBS ekleyin ve 450 ×g kuvvetinde, dört °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatantı uzaklaştırıp atın.

Pelleti üç mililitre eritrosit lizleme tamponu ile yeniden süspande edin ve buz üzerinde 8,5 dakika inkübe edin. Ardından, lizleme tamponunu etkisiz hale getirmek için yaklaşık 30 mililitre steril PBS ekleyin, santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Pelleti yeniden süspande etmek için bir mililitre steril PBS kullanın ve buz üzerinde muhafaza edin.

Küçük bir miktar hücre homojenatını PBS ile seyreltin ve hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. Hücre süspansiyonunu mililitre başına 8 × 10⁶ hücre olacak şekilde seyreltin ve enjeksiyona kadar buz üzerinde inkübe edin. Kemik iliği transplantasyonunu gerçekleştirmek için, seyreltilmiş hücre süspansiyonundan 300 µL'yi 0,5 mL'lik bir şırıngaya ekleyin.

Enjeksiyon yapılacak her bir fare için hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olun. Koşullandırılmış alıcı farelerin bulunduğu fare kafesini bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin ve lateral kuyruk venlerinin genişlemesini bekleyin. Alıcı bir fareyi uygun boyutlarda bir sabitleyiciye yerleştirin ve kuyruğu %70 ethanol emdirilmiş cerrahi gazlı bezle silin; kuyruğu sıkıca tutun ve iğnenin eğimli ucunu yukarıya gelecek şekilde lateral kuyruk venlerinden birine nazikçe yerleştirerek hücre süspansiyonunu enjekte edin.

Kanamayı durdurana kadar enjeksiyon bölgesine cerrahi gazlı bez tutun. Kemik iliği transplantasyonundan yaklaşık iki ila üç hafta sonra, fareyi yeni ve temiz bir kafese yerleştirmeden önce, fareyi bir tutma tüpüne yerleştirin ve lateral safen veni açığa çıkarmak için arka bacağındaki tüyleri tıraş edin. Ardından, bacağa ince bir tabaka vazelin uygulayın ve heparin kaplı bir kapiler tüp ile safen venini delmek için 25 gauge bir iğne kullanın.

Yaklaşık 50 µL kan toplayın, ardından kanamayı durdurmak için cerrahi gazlı bez kullanın. Kanama durduğunda fareyi kafesine geri koyun. Kanı, bir mL fax tamponu içeren bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin.

Tüpü ters çevirerek karıştırın ve buz üzerinde saklayın; kan örneklerini 900 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırıp attıktan sonra, peleti yeniden süspande etmek için 500 µL eritrosit liz temizeleme tamponu kullanın ve buz üzerinde 8,5 dakika inkübe edin. Ardından, liz tamponunu nötralize etmek için bir mililitre fax tamponu ekleyin ve 900 ×g'de beş dakika santrifüjleyin.

Metin protokolüne göre, ikinci kez liz ettiğiniz ve santrifüj ettiğiniz ardından peletin artık beyaz olduğunu kontrol edin. Eğer kırmızıysa, liz adımını üçüncü kez tekrarlayın. Peleti fax tamponunda süspande edin ve GFP pozitif hücrelerin oranını belirlemek için akış sitometrisi kullanın.

Bu grafik, kilogram başına 100 miligram busalan ile hazırlanan ve başarılı bir sinjenik kemik iliği nakli alan farelerin yanı sıra, kilogram başına 80 miligram busalan ile hazırlanan ve başarısız bir allojenik kemik iliği nakli alan farelerin periferik kanında haftalık olarak nicelendirilen kimerizm seviyelerini göstermektedir. Kemik iliği naklinden sonra genellikle üç ila dört hafta içinde %80'den yüksek kimerizm seviyeleri oluşur; burada gösterilenler, kemik iliği naklinden üç hafta sonra başarılı ve başarısız kemik iliği naklini gösteren temsili periferik kan verileridir. Bu akış sitometrisi verileri, kemik iliğinde yüksek derecede kimerizmin en az bir yıl boyunca korunduğunu ve araçla (vehicle) hazırlamanın kemik iliği kimerizmini indüklemek için yeterli olmadığını göstermektedir.

Kilogram başına 60 ila 100 miligram busulfan dozları kullanılarak elde edilen kemik iliği kimerizm seviyelerinde anlamlı bir fark olmasa da, GFP pozitif hücreler merkezi sinir sistemi içinde doza bağlı bir şekilde birikir. Bu şekil, vahşi tip bir farede ve nörodejeneratif bir hastalık olan amiyotrofist lateral skleroz fare modelinde daha fazla olmak üzere, omuriliğin lomber bölgesindeki GFP pozitif kemik iliği kaynaklı hücre birikimini göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, transplantasyon sonrası reddedilme olasılığını minimize etmek için aynı cinsiyetten sinjenik alıcı ve donör farelerin kullanılması önemlidir.

Kemik iliği kaynaklı hücrelerin merkezi sinir sistemine giriş mekanizmalarını incelemek için akış sitometrisi ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler kullanılabilir.