Name: İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar Toxoplasma gondii Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Öğrenin ileri genetik yöntemiyle Toxoplasma gondii'nin makrofajlarda IFN-γ bağımlı hücre otonom bağışıklıktan kaçınma genlerini nasıl tanımlandığını. Bu araştırma yeni tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

T. gondii mitokondrisini tespit eden antikor için Dr. Peter Bradley'e özel teşekkürler. Çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü Hibe AI072028 tarafından desteklendi ve DGM'ye AI107431 ve tropikal tıp çalışmaları için New York Tıp Koleji'ne cömert bir bağışta bulundu.

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Açıklanan protokol fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar ve T. izole etmek için ileri genetik aktivasyonunu kullanan olmayan bir önyargılı bir yaklaşım sağlar yeteneklerini bir kusur ile gondii mutantlar enfekte makrofajlar aktivasyonunu hayatta kalmak için. mutantlar aşağıdaki makrofaj aktivasyon fenotip tipik iki geniş kategorilerden birine girer: 1) parazitler sağlam görünen, fakat PV başına 1 parazitin ötesine çoğaltmak için başarısız; 2) parazitler bozulmuş görünür ve ferah, amorf PV&#39;ler...

Toxoplasma gondii (T. gondii) zorunlu hücre içi, protozoa patojendir. Bu toksoplazmozis etkeni, bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde bir sağlık tehlikesi olduğunu. Ayrıca Cryptosporidium ve Cyclospora dahil insanları enfekte diğer apicomplexan patojenlerin model sistemidir. Toksoplazmozis en yaygın parazit bradyzoite veya Ookist sahne ile kontamine yiyecek veya su yenmesi yoluyla elde edilir. Yemeye bağlı olarak bu aşamalar konakçı hücreler içinde replike ve sistematik olarak yaymaktadır parazitin tachyzoite aşamasına dönüştürün. T-hücreleri, IFN-γ ve daha az bir ölçüde, nitrik oksit 1-4&#39;e, enfeksiyonun kontrol edilmesi için önemlidir, ancak takizoit bir bölümü olarak, hastalık yok etme yeteneğine sahip değildir doku kistlerinin içinde korunur bradyzoite aşamasına dönüştürmek Uzun ömürlü bir kronik enfeksiyon ile sonuçlanır. Aslında, hiçbir terapötik kronik kist s karşı etkili vardırHastalığın tage. Şiddetli toksoplazmozis birincil ve akut enfeksiyon hızla kopyalayan tachyzoite sahne özelliğine geri dönüştürme parazitin bradyzoite aşamasına nedeniyle kalıcı enfeksiyon reaktivasyonuna en sık olduğunu. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtının karşısında Erken yaşam parazit yeterli parazit numaralarını ulaşmak için, yanı sıra kronik enfeksiyon kurulmasını sağlamak için, uzak sitelere ulaşmak için izin önemlidir. T. gondii olasılıkla çoğaltmak ve enfeksiyon erken yaymak için onun yeteneğine katkıda konak savunma mekanizmaları ile mücadele stratejilerini gelişti. İlk olarak, T. gondii diğer hücre içi patojenlere 5-9 kıyasla konak hücrenin endositik ve ekzositik süreçler büyük ölçüde ayrılmış olan parazit işgali sırasında benzersiz bir PV oluşturur. Ayrıca, tüm başarılı hücre içi patojenler T. gibi gondii f hoşgörülü bir ortam yaratmak için konak hücreye değiştirirya da büyüme. Bu hücre aktivasyonunu 10-15 düzenleme için önemli olanlar da dahil olmak üzere, konakçı hücre transkripsiyon faktörlerinin değiştirerek yeniden programlama konakçı hücre gen ekspresyonunu içerir. ROP16 16-19 GRA15 20 GRA16 21 ve GRA24 22 tüm T ile enfekte olmuş konakçı hücrelerin kaskadlar transkripsiyon yanıtı düzenlemek ve hücre sinyal önemli olduğu gösterilmiştir gondii. Farklı fenotip ile parazit suşları arasındaki genetik haçlar kullanarak Son çalışmalar bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS) 16,19,23-26 kaçırma da dahil olmak üzere parazit genotip-bağımlı özellikleri altında yatan parazit genlerin belirlenmesi oldukça verimli olmuştur. Çok virulent Tip I genotip sıçangil IRGS kaçınmak için mekanizmalar geliştirmiştir ise farelerde, bağışıklıkla ilgili GTPazlar (IRGS) Tip II ve kontrol parazit III genotip için önemlidir. Ancak, parazit antimikrobiyal medya kaçmasına mekanizmaları gelişti olduğu da açıktırbu mekanizmaların bazıları IRGS ve buna ek olarak ları parazit genotipleri 27,28 boyunca muhafaza edilebilir. Buna ek olarak, çok az T. karşı hücre otonom bağışıklık kritik aracılarının hakkında bilinen İnsan toksoplazmozis sırasında gondii. Tachyzoite konukçu bağışıklık yanıtları ile tetiklenebilir dönüşüm bradyzoite için sırasında hücre otonom bağışıklık aracılarının direnç için önemli bir Parazit genler de hayatta kalmak için önemli olabilir. Örneğin, yüksek düzeyde nitrik oksit edilen enfekte olmuş makrofaj parazit kopyalanmasını bastırdığı, ancak, aynı zamanda kist üretimi 30-32 sonuçlanan dönüşüm bradyzoite için tachyzoite uyarabilir. ToxoDB T. için fonksiyonel bir genomik veritabanı gondii o topluluk açıklamaları da dahil olmak üzere yayınlanmış ve yayınlanmamış genomik ölçekli veri dizisi parazit genomunun için bilgi ve erişim sağlanması açısından alan için kritik bir kaynak olarak işlev, gen exp<html> ression ve proteomik verileri 33. Birçok Protozoal patojenlere benzer, genomun çoğunluğu potansiyel fonksiyonları içgörü sağlamak için gen homoloji dayalı hiçbir bilgi varsayımsal genlerin oluşur. Böylece, ileri genetik bağışıklık kaçırma, kist dönüşüm ve parazit patogenezinde yanı sıra farklı gelişim evreleri arasındaki dönüşüm için kritik diğer işlevler için önemli yeni parazit genleri tanımlamak için güçlü bir araçtır. Ileri genetik ek kuvveti bağışıklık kaçırma ve kist oluşumuna sahip patojenezindeki özgül görevler için önemli olan genler için bir parazit sorgulamak için göreceli olarak önyargılı bir yaklaşım olarak kullanılabilir olmasıdır. Mutasyon profil için yeni nesil dizileme son gelişmeler kimyasal ve sokma hem mutajenezin 34-37 kullanarak ileri genetik çalışmalar sorumlu parazit genlerin belirlenmesi için seçim yöntemi yaptık. ntent &quot;&gt; Özellikle de dirençli kist aşamasında karşı aktif olabilir bu. Bu amaçla doğru, in vitro kemirgen parazite karşı hücre özerk bağışıklık mekanizmalarının etkinliğini artırmak için kullanılabilir T. gondii güvenlik açıklarını tespit etmek önemlidir makrofaj enfeksiyonu ve aktivasyon modeli, özellikle saf makrofajlarda edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu, ancak şu T. gondii, uygunluk olumsuz parazit mutasyonlara tanımlamak amacıyla geliştirilmiştir. Bu makrofaj ekran için T. gondii, sokma mutantlan bir kütüphane sorgulamak için kullanılmıştır, sonuçta nitrik oksit 27,28 direnç için önemli bir T. gondii, genlerin belirlenmesi. enfekte makrofajlar, nitrik oksit, özellikle belirgin bir duyarlılık aktivasyonuna bozulmuş dirençli T. gondii, mutantlarının bir panelinin izolasyon, tespit için ekranın yardımcı oldu direnç için önemli parazit genlerkemirgen IRGS 28 için açıklanan direnç mekanizmaları dışında diğer hücre özerk bağışıklığın arabulucular için. Araya sokulan mutajenez teorik olarak rastgele her paraziti klonu mutasyonlar ve mutasyon site daha kolay tanımlama sınırlı sayıda üretilmesi açısından kimyasal mutagenez fazla avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, T plasmid ekleme genomik yerinin tanımlama gondii sokma mutantlan, uygulamada, bir çok durumda 37 şaşırtıcı bir şekilde zor olmuştur. Bir genin bir plasmid yerleştirilmesi aynı zamanda, tipik olarak, tek nükleotid değişiklikleri ile sonuçlanan kimyasal mutagenez aksine bir genin işlevini bozması muhtemeldir. Birden fazla tek nükleotid polimorfizmini oluşturur Ancak, kimyasal mutagenez, N-etil-N-nitroso üre (TRK) ya da etilmetan sülfonat (EMS) ya sahip (araya sokulan mutajenez ile karşılaştırıldığında, parazit genomunun büyük bir kısmının, daha yüksek bir yetenek sunabilir mutant 34 başına 10 -100) tahmin, 38. Ayrıca, tüm genom profili son gelişmeler mümkün mutasyona uğramış bir parazitin 34,38 tanımlanmış fenotip sorumlu en olası aday genleri tanımlamak için yeni nesil sıralama kullanmaya yaptı. Ne olursa olsun mutagenez yaklaşımı, makrofaj aktivasyonu direnç parazit geninin rolü onay sonuçta moleküler Koch önermeleri yerine getirmek için gen silme ve tamamlanmasını gerektirir. parazit ve makrofaj hem genetik manipülasyonu vasıtasıyla bir genin işlevini incelemek yeteneği T. ileri genetik ile tanımlanan genlerin çoğu önemlidir gondii, hem de diğer patojenler halen bilinen fonksiyonlar ile başka proteinler için bir dizi homolojisi için çok az varsayımsal genler olarak karakterize edilir. Bu yazı, bir mutant içinde kesintiye uğramış gen, bir bilinen ya da direnç için önemli olup olmadığını tespit etmek için kullanılabilir, genel bir yaklaşımın ana hatlarıHücre özerk dokunulmazlık bilinmeyen aracısı. Ev sahibi antimikrobik faktörler ilk analiz, vahşi tip ve uyarılabilir nitrik oksit sintaz (iNOS), gp-91 pHOx (NADPH oksidaz) özel gen silme olanlara karşı vahşi tip farelerden makrofajlar mutant parazitlerin yaşam değerlendirilerek yapılır ve Belirli bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS). Belirlenen parazit genler nitrik oksit, reaktif oksijen ara veya bağışıklıkla ilgili GTPases 28 sırasıyla veya bilinmeyen bağışıklık mekanizması dahil olup olmadığını direnç için önemli olmadığını gösterecektir. Mevcut protokolde tarif edildiği, IFN-γ ve LPS, her iki ile enfekte makrofajlar, aktivasyonu, öncelikle nitrik oksidin 28 direnç için önemli parazit genin izolasyonu ile sonuçlanır. makrofaj aktivasyonunun yokluğunda nitrik oksit neden farmakolojik ajan (nitrik oksit donörleri) tarafından tanımlanan genlerin çoğu yeniden önemli olduğunu gösterdinitrik oksit yerine makrofaj aktivasyonu 28 ile ilişkili ek arabulucular ile uyum içinde nitrik oksit direncin. Bir ve iki in vitro enfekte olmuş kemik iliğinden türetilmiş makrofaj aktivasyonu takiben spor defektli parazit mutantlarını izole etmek için tasarlanmış bir ön genetik ekran tarif Adım. Bir parazit, çoğaltma azaltır, ancak tam olarak vahşi tip T replikasyonunu inhibe etmez makrofaj aktivasyonu için kullanımı deneysel olarak IFN-γ ve LPS&#39;nin dozu belirlemek için bir doz titrasyon analizi tarif Adım Parazit mutantların kütüphanenin oluşturulması için kullanılan gondii ebeveyn suşu. İkinci adım 96 oyuklu plakalar içinde makrofajlar mutant klonların ileri genetik ekran tarif etmektedir. Üçüncü adım, her mutant kusur parazit yaşam etkileyip etkilemediğini, çoğaltma değerlendirmek ve 96 gözlü levhalar bir taramada tespit edilen her bir mutantın fenotipi teyit etmek için bir yaklaşım anahatlarımakrofaj aktivasyonuna karşılık olarak ya da kist üretimi. Dördüncü adım, parazit mutan özellikle hassas olan bağışıklık mediatörleri tanımlamak üzere, belirli antimikrobiyal yollarındaki delesyonu olan farelerin kemik iliği türevli makrofajlar kullanımını tarif eder. Adım beş enfekte farelerin beyinlerinde kist üretiminin tarafından değerlendirilir gibi bir parazit mutant da in vivo patogenezinde tehlikeye olup olmadığını belirlemek için bir yaklaşım özetlemektedir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Hiklon</td><td>SH3008101</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29101& productId=3255471& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= ÜRÜN& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Termo</td><td>SH3091003</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=11737973& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= ÜRÜN& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hidroklon DPBS</td><td>Termo</td><td>SH3002802&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=2434305& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hidroklon L-glutamin</td><td>Termo</td><td>SH3003401&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=3311957& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Pen strep</td><td>Thermo SV30010</td><td>&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668 6& catalogId=29104& matchedCat No=SV30010& fromSearch=1& searchKey=SV30010& highlightPro ductsItemsFlag=Y& endecaSearch Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Kimden& tasarruf= 0.0& xrefEvent=1407777949003_0 & searchType=PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Hanks BSS</td><td>Termo</td><td>SH3003002</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=3064595& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= ÜRÜN& hasPromo=0</td></tr><tr><td>LPS</td><td>LİSTESİ biyolojikler</td><td>201</td><td>http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords =LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4</td></tr><tr><td>IFN-&#947;</td><td>Pepro Tech Inc</td><td>50-813-664</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652& productId=2988494& catalogId=29 104& matchedCatNo=50813664& fromSearch=1& searchKey=murine+ifn+pepro+tech& highlightProductsItemsFlag =Y& endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Kimden& tasarruf =0,0& xrefEvent=1407778210608_ 12& searchType=PROD& hasPromo =0</td></tr><tr><td>Oda slaytları</td><td>Thermo</td><td>177402</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=2164545& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= ÜRÜN& hasPromo=0</td></tr><tr><td>96 kuyulu optik plakalar</td><td>Thermo</td><td>165306</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=3010670& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= ÜRÜN& hasPromo=0</td></tr><tr><td>96 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Fisher</td><td>353072</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=3158736& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= ÜRÜN& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Doku kültürü flast T25</td><td>Fisher</td><td>156367</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039 67& catalogId=29104& matchedCat No=12565351& fromSearch=1& searchKey=156367& highlightProdu ctsItemsFlag=Y& endecaSearchQu ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Kimden& tasarruf =0,0& xrefEvent=1407778974800_ 0& searchType=PROD& hasPromo =0</td></tr><tr><td>Ted Pella EM sınıfı formaldehit</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td>http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=3425922& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= ÜRÜN& hasPromo=1</td></tr><tr><td>Alexa 488 - protein konjugasyon kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A20181</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235</td></tr><tr><td>keçi serumu</td><td>MP Biyomedikal</td><td>ICN19135680</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=2133236& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& crossRefData =ICN19135680=2& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Vectashield montaj ortamı</td><td>Vector Labs</td><td>H1200</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428</td></tr><tr><td>FITC ile konjuge dolichos</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1031</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188</td></tr><tr><td>LAMP1'e karşı Antikor</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bank</td><td>http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Life Teknolojiler</td><td>L-7526</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product</td></tr><tr><td>C57BL6 fareler</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>664</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html</td></tr><tr><td>gp91 phox nakavt fareler</td><td>Jackson Labaoratories</td><td>2365</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html</td></tr><tr><td>iNOS nakavt fareleri</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>2609</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html</td></tr><tr><td>sodyum nitroprussid</td><td>ACROS Organics</td><td>AC21164-0250&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=2627727& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= ÜRÜN& hasPromo=1</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>ACROS Organics</td><td>AC32865-0250</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Kimlik=29104& productId=2252389& DIS Türü=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= ÜRÜN& hasPromosyon=1</td></tr><tr><td>Monoklonal fare anti-Toxoplasma gondii Ab</td><td>Fitzgerald Industries International</td><td>10T19A</td><td>http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947</td></tr></tbody></table>

İleri genetik tanımak makrofajlar kullanılarak ekranlar<em&gt; toxoplasma gondii</em&gt; genler önemli direnç için ifn-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toksoplazmozun etkeni olan toxoplasma gondii, zorunlu bir hücre içi protozoon patojendir. Parazit, hemen hemen her sıcak kanlı omurgalı hücre tipini istila eder ve çoğalır. Bir konak hücrenin parazit istilası sırasında, parazit, içinde çoğaldığı fagositozdan bağımsız olarak konak hücre zarından kaynaklanan bir parazitohoröz vakuol (PV) oluşturur. IFN'ye bağımlı doğuştan gelen ve hücre aracılı bağışıklık, enfeksiyonun nihai kontrolü için önemli olsa da, nötrofiller, monositler ve dendritik hücreler dahil olmak üzere doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, parazitin enfeksiyonun erken dönemlerinde sistemik yayılması için araçlar olarak da hizmet edebilir. Enfekte makrofajlarda aktivasyonu takiben uygunluk kusuru olan parazit mutantlarını, ancak naif makrofajlarda normal invazyon ve replikasyonu tanımlamak için ileri bir genetik ekranda, konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkisini, bu durumda makrofajları kullanan bir yaklaşım tanımlanmıştır. Böylece ekran, makrofaj aktivasyonunun etkilerine direnme yeteneklerinde belirli bir kusuru olan parazit mutantlarını izole eder. Makale, enfekte makrofajların aktivasyonunu takiben mutant parazitlerin iki geniş fenotipini tanımlamaktadır: parazit stazı ve parazit bozunması, genellikle amorf vakuollerde. Parazit mutantları daha sonra, hücre otonom bağışıklığının indüklenmiş aracılarına direnç için özellikle önemli olan sorumlu parazit genlerini tanımlamak için analiz edilir. Makale, teorik olarak, spesifik antimikrobiyal mediatörlere direnç için önemli olan parazit genlerini hedeflemek için değiştirilebilen ileri genetik ekran için genel bir yaklaşım sunmaktadır. Ayrıca, parazit mutantının duyarlı olduğu spesifik makrofaj antimikrobiyal mediatörlerini değerlendirmek için bir yaklaşımı da açıklar. Enfekte makrofajların aktivasyonu, kronik enfeksiyonu sürdüren taşizoitten bradisotit aşamasına parazit farklılaşmasını da teşvik edebilir. Bu nedenle, tanımlanan parazit geninin kronik enfeksiyon oluşumundaki önemini değerlendirmek için metodoloji sunulmuştur.

Toxoplasma gondii naif makrofajlar serbestçe çoğaltır ve 6-12 saat parazit suşu bağlı arasında iki katına zaman vardır. 1 aktif kemik iliği kökenli makrofajlar karşı naif temsilcisi parazitleri göstermektedir. Şekil 2 HFF parazitlerin genel morfolojisi gösterir 2, 4, 8, 16 ve 32 parazitler / PV hücreler ev sahipliği. Mevcut protokolde, parazit naif makrofajlar istila ve enfekte makrofajlar için güçlü aktivasyon uyaran, LPS ve IFN-teslim öncesinde doğmakta parasitophorus çarpıtm...

İleri genetik, hücre otonom bağışıklığına direnç için önemli olan hücre içi patojenlerdeki genleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Mevcut yaklaşım, bağışıklık kaçışı için önemli olan yeni Toxoplasma gondii genlerini tanımlamak için doğuştan gelen bağışıklık hücrelerini, özellikle makrofajları kullanır.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

forward-genetics-screens-using-macrophages-to-identify-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Somatik Hücre Nükleer Transferi (SCNT) üzerinden epigenetik yeniden programlama önceden tanımlanmış T hücre reseptör (TCR) özgüllükleri fare modelleri oluşturmak için bir araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu transnuclear fareler, endojen endojen organizatörü kontrol altında lokus karşılık gelen TCR ifade eder.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir...

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Enfekte THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm...

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Bu protokolde, Amaxa Nucleofector 96 kuyulu Mekik Sistemini kullanarak murin makrofaj hücre hatlarını siRNA'larla verimli bir şekilde transfekte etmek, makrofajları lipopolisakkarit ile uyarmak ve inflamatuar sitokin üretimi üzerindeki etkileri izlemek için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Stres direnci uzun ömürlü özelliklerinden biridir ve genetik yönetilmeye bilinmektedir. Burada, uzun ömürlü çalışmaları için fare modelleri geliştirmek için hangi ES hücreleri stres direnci kazandıran mutasyonlar taranması için tarafsız bir yüksek verimli bir yöntem geliştirdi.

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Detaylar, Toxoplasma gondii'de bir ilaca direnç genini tanımlamak için bütün genom dizisi tabanlı bir genetik harita ile QTL haritalamasının nasıl kullanılacağı ve bunun, bir genomik hedefi verimli bir şekilde düzenleyen CRISPR / Cas9 sistemi ile nasıl doğrulanabileceği üzerine sunulmaktadır; bu durumda Ilaç direnci geni.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Bir kemokinin in vivo makrofaj alımı üzerindeki etkisini test etmek için, yerinde hibridizasyondaki tüm montaj, kemokinin ektopik ekspresyonunu saptamak için kullanıldı ve makrofajları etiketlemek için immünboyama kullanıldı. Makrofaj göçünün gerçek zamanlı gözlemi için canlı görüntüleme kullanıldı.

Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli

Bu protokol, makrofaj ve T hücre satırlarındaki darbe denemelerini basitleştirmek için floresan muhabirleri ve hücre sıralamasını kullanır. Bu basitleştirilmiş knock-in deneyleri için iki plazmid kullanılır, yani CRISPR / Cas9- ve DsRed2 ifade eden plazmid ve bağışıklık hücrelerindeki Rosa26 lokusunda kalıcı olarak entegre edilen EBFP2'yi ifade eden homolog bir rekombinasyon donör plazmid.

MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Öğrenin ileri genetik yöntemiyle Toxoplasma gondii'nin makrofajlarda IFN-γ bağımlı hücre otonom bağışıklıktan kaçınma genlerini nasıl tanımlandığını. Bu araştırma yeni tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar Toxoplasma gondii Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık (Video) | JoVE Journal

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar

Daha fazla video keşfet