Name: Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu Ex Vivo Hücre Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Öğrenin insan deri biyopsilerinden T hücre izolasyonu ve akış sitometrisi analizi yöntemini. Bu protokol, canlı lenfositlerin elde edilmesi ve ekz vivo kültürü için etkili bir temel sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sedef hastalarının deri biyopsileri nazik Dr. Andreas Koerber bilimsel kullanım için yazılı veya sözlü aydınlatılmış onam sonra (Essen, Almanya Üniversitesi Dermatoloji bölümü) tarafından verilmiştir. XH da NSFC 61263039 ve NSFC 11101321 tarafından desteklenmektedir.

NOT: sağlıklı bireylerden deri biyopsileri, bilimsel kullanım için yazılı veya sözlü aydınlatılmış onam sonra elektif plastik cerrahisi geçiren bireylerin karın cilt leftover elde edilmiştir. insan derisinin kullanımı onaylanmış ve oldu Radboud üniversite tıp merkezi, Nijmegen, Hollanda ve Almanya&#39;nın Essen Üniversitesi insan araştırma Tıbbi Etik Komiteleri tarafından belirlenen yönetmeliklere uygun olarak. İnsan Cilt gelen Tek Hücre süspansiyonları 1. Hazırlık (a Flow-kabinede Çalışma Steril sonraki Hücre Kültürü ise Gerekli) <ol><li> Hücre kültürü ortamı hazırlayın: Resim serumu RPMI 1640 + Penisilin / streptomisin (ml nihai konsantrasyonları, 100 ünite / 100 ug / ml) ile + piruvat (0.02 mM) ve Glutamax (0.02 mM) ilave edildi. </li><li> Tüm kültür ortamı hazırlayın: kültür ortamı, adım 1.1 +% 10 insan toplanan serumdan (HPS) hazırlanmıştır; 4 ° C&#39;de saklayın. Bizden önce 20 ° C ± 2 orta getiring. </li><li> Bir 4mm yuvarlak biyopsi yumruk aleti kullanılarak deri biyopsisi elde edilir ve en fazla 4 saat veya 4 ° C AÇIK 20 ° C ± 2 de 1640 tam kültür ortamında saklayın. Laboratuvarda girişte en kısa sürede biyopsi işleyin. NOT: Derinin uzun depolama hücresi verim ve hücre canlılığı etkileyecektir. </li><li> mavi kapaklı ayrışma tüp Etiket ve etiketli tüpe 5 ml tam kültür ortamı ekleyin. </li><li> steril 6 oyuklu kültür plakasının (toplam 3 delikleri şeklinde), her oyuğa tam kültür ortamı içinde 2 ml ilave edilir. böylece üç durulama toplam elde, tek bir kuyunun içine biyopsi yerleştirmek durulayın, ikinci kuyunun onu taşımak ve bu adımı bir kez daha tekrar etmek steril araçlarını kullanın. </li><li> Steril Petri kabı iyi durulanmalıdır deri biyopsisi transfer biyopsi üstünde tam kültür ortamı 100 ul ekleyin ve dikkatlice bir paslanmaz çelik tek kullanımlık steril neşter kullanılarak deri altı yağ dokusu kazıyın. NOT: Tholan kritik bir adımdır. </li><li> Steril bir Petri kabı 4 küçük parçalar halinde her cilt biyopsisi kesin. Aktarım örnekleri (kadar tüp başına 4 mm biyopsi dört) tam kültür ortamı içinde 5 ml ihtiva eden hazırlanan ayrıştırma tüpüne. </li><li> Sıkıca kapaklı tüpler kapatın ve otomatik doku ayrıştırıcı kovanına ters takın. Tüm örnek malzeme rotor bölgede yer olduğundan emin olun. </li><li> &quot;Program m_spleen _01&quot; 56 sn için uygun döner hızında biyopsi ayırmak (birlikte bir program kartına cihazın dahili hafızasında veya tarafından sağlanan önceden tanımlanmış bir program) çalıştırarak ayrılma işlemini başlatın. </li><li> işlendikten sonra, dissociator gelen ayrılma tüpü ayırmak ve tüm ayrışmış madde tüpün dibinde toplanan olduğundan emin olun. </li><li> 37 ° C&#39;de çalkalanan bir su banyosu içerisinde ayrıştırma tüpüne kolajenaz IA (80 mg / ml) ul 150 ilave edin ve örnek inkübe60 dakika ° C. thedissociation tüpüne DNaz I, 100 ul (5 MU / ml) ekleyin, iyice karıştırın. Not: kolajenaz ya da hücre canlılığında değiştirecek uzun kuluçka süresi yüksek konsantrasyonlarda eklenmiştir. </li><li> Otomatik doku ayrıştırıcı kovana ayrışma tüp takın ve Biyopsiyi bir kez daha ayırmak &quot;programı m_ dalak _01&quot; çalıştırın. </li><li> bir 50 ml Falcon tüpü üzerine 70 um naylon hücre süzgecinden yerleştirin. hücre kümeleri / doku enkaz kaldırmak için bu hücre süzgeç ayrışmış örnek malzemeleri uygulamak. </li><li> Tüm kültür ortamı, 5 ml ile bir kez hücre süzgecinden yıkayın. 20 ° &#39;de santrifüje C ± 2, 10 dakika ve aspirat yüzer 450 x g. </li><li> Yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. tam kültür ortamı içinde 300 ul tekrar süspansiyon hücre peletleri. Tek hücre süspansiyonları daha fazla analiz için hazırdır; ex vivo hücre kültürü için protokollerle devam etme veya akış sitometri analizine. </li><li> Daha fazla i halindentracellular sitokin boyama, 37 ° C de 4 saat PMA (12.5 ng / ml), İyonomisin (500 ng / ml) ve Brefeldine A (5 ug / ml) ve hücreleri uyarır,% 5 CO2 kuluçka akış uygulamadan önce 4 saat sitometri analizi. </li></ol> Cilt Resident T hücrelerinin 2. Poliklonal Aktivasyon (Ex Vivo Hücre Kültürü) <ol><li> Yuvarlak dipli 96 gözlü plaka içine kısım 100 ul tek hücre süspansiyonları, (adım 1.15 hazırlandı). Not: 4 mm deri biyopsisi her biri için, elde edilen tek hücre süspansiyonları, 96 oyuklu bir plakanın en az iki kuyu ayrılabilir. </li><li> anti-CD3 / anti-CD28 mAb ile kaplanmış mikrotaneler (oyuk başına 25,000 boncuk), rekombinant insan sitokin rlL-2 (nihai konsantrasyon 25 U / ml) ve rlL-1β (nihai konsantrasyon 50 ng / ml) eklenir. </li><li> % 5 CO2,% 100 nem, 37 inkübe iyi olarak işaretlenmiş levha kapak kültürü plakası Kapak C inkübatör °. orta renk sarıya döndüğünde orta değiştirin. <br/&gt; Not: Açık bir hücre kolonisi hücre kültürünün 8 gün arasında gözlemlenebilir. </li></ol> 3. İlköğretim Sitometrisi Analizi / kültürlü Cilt Resident T hücrelerinin <ol><li> PBS +% 0.2 BSA: FACS tampon hazırlayın. </li><li> V-tabanlı 96 oyuklu bir plakaya ilgi hücreleri aktarın. 20 ° C ± 2, 2 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj ve aspire yüzer. </li><li> 100 ul PBS içinde pelletini. 20 ° C ± 2, 2 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj ve aspire yüzer. </li><li> (: PBS kullanarak 1000 sulandırma 1), 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca sabitlenebilir canlılığı boya konjüge hazırlanmış eFluorescence780 100 ul Leke hücreleri. 20 ° C ± 2, 450 2 dakika boyunca x g ve aspire yüzer FACS tamponu santrifüj 100 ul ekle. </li><li> , Gerekli hücre yüzey markörü mAb seçin örneğin: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10) ve CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), test edilen her mAb seyreltme faktörüne göre FACS tamponu kullanılarak mAb-karışım hazırlayın. olmayan leke numunesi ile birlikte antikor izotip kontrolü kullanarak kapı ayarlarını tanımlayın. </li><li> Her kuyuya hazırlanan mAb-karışımının 25 ul ekle. ışıktan korumak, 20 ° C ± 2 20 dakika kuluçkalayın. </li><li> 20 ° C ± 2, 450 2 dakika boyunca x g ve aspire yüzer FACS tamponu santrifüj 100 ul ekle. </li><li> Sadece hücre yüzey boyama gerektiren numuneler için, adım 3.16 ile devam edin. </li><li> hücre içi Foxp3 boyama durumunda: <ol><li> seyrelticiler 3 parça ile, konsantratın bir kısım karıştırılarak tespit ve permeabilizasyon tamponu hazırlayın. </li><li> 1x permeabilization tampon hazırlayın: sterilize H 2 O 1 kısım 10x permeabilization tamponu + 9 parça </li></ol></li><li> fiksasyon ve permeabili 100 ul pelet tekraryon tamponu, iyice karıştırın ve 4 ° C&#39;de inkübe 30 dakika ° C. </li><li> 450 2 dakika boyunca oda sıcaklığında xg, ve aspirat yüzer her şey, santrifüj 100 ul permeabilizasyon tamponu ekleyin. </li><li> permeabilizasyon tamponu bir kez daha hücreleri yıkayın. </li><li> Örnek için gerekli hücre içi mAb seçin, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) ve IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Test edilen her bir mAb seyreltme faktörüne göre% 2 normal sıçan serumu içeren permeabilizasyon tamponu kullanılarak mAb&#39;ler karışım hazırlayın. olmayan leke numunesi ile birlikte antikor izotip kontrolü kullanarak kapı ayarlarını tanımlayın. </li><li> Her kuyuya hazırlanan mAb karışımı 20 ul ekle. 4 inkübe ışıktan korumak, 30 dakika boyunca ° C. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, her kuyuya permeabilizasyon tampon 100 ul ilave edin. 20 ° C ± 2, 2 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj ve aspire yüzer. </li><li> Permeabilization Buffe hücreleri yıkayınr bir kez daha. microFACS tüpe 110 FACS tampon ul, ve transfer hücre süspansiyonları içinde süspanse pelet. NOT: Örnek 10 renkli akım sitometri kullanarak ölçüm için hazırdır. </li><li> Gerekli olan tam hücre sayısı halinde hemen akış sitometrisi kullanılarak ölçümler önce her numune içine florosferlerin iyi karıştırılmış düzgün süspansiyonu 10 ul ekle. </li></ol>

<ol><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vast+majority+of+CLA%2B+T+cells+are+resident+in+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li>
<li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c%2BBDCA-1%2B+dendritic+cells+and+CD163%2BFXIIIA%2B+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li>
<li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li>
<li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8%2B+T%28RM%29+cells+providing+global+skin+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li>
<li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1%2B+dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li>
<li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+%28AEB071%29+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li>
<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li>
<li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li>
<li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li>
<li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li>
<li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-infiltrating+CD8%2B+T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, verimli insan derisi biyopsi cilt yerleşik T hücrelerini izole etmek için bir protokol mevcut. Bu protokolün avantajı canlı lenfositlerinin nispeten yüksek sayılar izolasyon ve ilgili yüzey belirteçlerinin ifade. Belirlenen hücre alt edildi: CD11c + DH&#39;ler, CD4 + ve CD8 + T hücreleri ve Foxp3 + CD25 + hücreleri. Önemli olarak, izole edilmiş bir cilt yerleşik T hücrelerinin ex vivo kültür çok iyi uygulanabilir ve daha sonra fonksiyonel analiz içi...

cilt, vücut ve çevre arasındaki temel arayüz olarak, dış fiziksel, kimyasal ve yaralama, ultraviyole radyasyon ve mikro-organizmalar gibi biyolojik hakaretlerle karşı ilk savunma hattını sağlar. Cilt iki bölme, epidermis ve dermiş içerir ve Langerhans hücreleri, makrofajlar, dendritik hücreler (DC) ve yaklaşık 20 milyar bellek T hücreleri dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri, çeşitli tüm kan hacmi 1 &#39;de yaklaşık iki katı sayıda mevcut içerir 2. Verilerin artan vücut deri doku homeostazında sırasında ve çeşitli patolojik durumlarda, hem temel immünolojik fonksiyonu vardır görüşünü desteklemektedir. Normal deride yerleşik bağışıklık hücreleri immüno 3 yapmak için düşünülen ve sedef 4 gibi iltihaplı bozuklukların gelişiminde bir rol oynadığı gösterilmiştir. Psöriatik lezyonlu deride, CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin hem obs vardı sızmışerved ve CD4 ve CD8 oranı hastalığın durumu 5 bağlı olarak değişir gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücrelerin bu popülasyonlar, mevcut tekniklerin sadece birkaç hücre yalıtılmasını için çalışma zordur. İnsan derisinden T hücre izolasyonu için şu anda yaygın olarak kullanılan teknikler enzimatik tedavi ile mekanik cilt ayrışmasını birleştirir. İnsan deri biyopsileri yoğun Tripsin, kolajenaz ve / veya EDTA 6-8 gibi enzimler ile inkübe edilir. Cilt germe kuvvetleri ve mekanik ayrıştırma yüksek dirençli bir bariyer doku olduğu göz önüne alındığında, T hücre izolasyon kurulan yöntemleri bu hücre popülasyonlarının zor ve ex vivo hücre kültürü yapar çok az hücre ve canlı hücrelerin daha düşük sayıda üretilen meydan okuma. Burada, mechan birleştirerek sağlıklı ve ilgili her iki psoriatik insan cildi lenfositlerin izole edilmesi için bir tadil edilmiş yöntem raporenzimatik sindirim kolajenaz ile birlikte otomatik bir doku Dissociator yerine yoğun kıyma kurulan yöntemi kullanarak deri iCal&#39;ın ayrışma. DH&#39;ler ve T hücrelerini içeren çeşitli canlı immün hücre alt tek bir hücre süspansiyonunun hazırlanması sonra görülmüştür. Önemli yüzey markörlerinin CD3, CD4 ve CD8 salgılanma iyi korunmuştur. Bu şekilde hazırlanan hücreler, ex vivo hücre kültürleri veya akış sitometrik analizinde kullanım için hazırdır. Bu protokol başarıyla sedef hastalarının lezyonlu deride türetilmiş tek cilt biyopsisi (4 mm) analizi için istihdam edilmiştir. Sonuçlar cilt ikamet hasta T hücreleri sağlıklı gönüllülere 9 karşılaştırıldığında IL-17 ve IFNy gibi daha inflamatuar sitokinler üretilen gösterdi.

<table><tbody><tr><td>Tek Kullanımlık Biyopsi Punch</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık steril neşterler</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>nazikMACS C tüpü</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Mavi kapaklı, ayrışma tüpü olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>gentleMACS Ayrıştırıcı</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Otomatik doku ayrıştırıcı. Deri biyopsisinin ayrıştırılması için "program spleen_01" kullanılması.</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci&nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 ve mikro; m naylon</td></tr><tr><td>96 kuyulu U-alt plaka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Havuzlanmış Serum (HPS)</td> <td>evde hazırlanan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Tip 1-A, hücre kültürü için uygun</td></tr><tr><td>DNaz I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sabitlenebilir Canlılık Boyası (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Hücre fiksasyonundan önce ölü hücreleri boyayın; 1: 1.000'de PBS ile seyreltin</td></tr><tr><td>Fiksasyon / Geçirgenleştirme Konsantresi</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Fiksasyon / Geçirgenleştirme Seyreltici</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Geçirgenlik Tamponu (10x)</td> <td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Fare anti-insan CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>Klonu: HI30; seyreltme faktörü 1:50</td></tr><tr><td>FITC Fare anti-insan CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Klon: TUK4; seyreltme faktörü 1:50</td></tr><tr><td>PE Fare anti-insan CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Klon: MOC-1; seyreltme faktörü 1:50</td></tr><tr><td>ECD Fare anti-insan CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Klon: UCHT1; yüzey boyama için seyreltme faktörü 1:50; hücre içi boyama için seyreltme faktörü 1:25.</td></tr><tr><td>PC5.5 Fare anti-insan CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Klon: 13B8.2; seyreltme faktörü 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Fare anti-insan CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Klon: BU15; seyreltme faktörü 1:50</td></tr><tr><td>APC Fare anti-insan CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Klon: AD5-8E7; seyreltme faktörü 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Fare anti-insan CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Klon: B9.11; seyreltme faktörü 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Fare anti-insan CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Klon: J3-119; seyreltme faktörü 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Fare anti-insan CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Klon: BC96; seyreltme faktörü 1:50</td></tr><tr><td>&nbsp; PE Sıçan anti-insan CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>klon: HECA-452; seyreltme faktörü 1:</td></tr> <tr><td>eFluo450 Sıçan anti-insan Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Klon: PCH101; hücre içi boyama; seyreltme faktörü 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Fare anti-insan IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Klon: eBio64DEC17; hücre içi boyama; seyreltme faktörü 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Fare anti-insan IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Klon: 4S. B3; hücre içi boyama; seyreltme faktörü 1:400</td></tr><tr><td>Akış Sayımlı Florosferler</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Akış sitometrisi için boncuk sayma</td></tr></tbody></table>

fenotipik analizi ve İnsan cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; ex vivo</em&gt; hücre kültürü

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

İnsan derisi önemli bir bariyer işlevi vardır ve patojenlerin doku homeostazında ve korunmasına katkıda çeşitli bağışıklık hücrelerini içerir. Cilt erişimi nispeten kolay olduğundan, periferik immün düzenleyici mekanizmaları incelemek için ideal bir platform sağlar. aynı zamanda bağışıklık yerleşik sağlıklı deri Davranış immüno hücrelerin ancak, sedef hastalığı gibi iltihaplı deri hastalıklarının gelişiminde önemli bir rol oynar. Gelişmekte olan anlayışlar rağmen, çeşitli iltihaplı cilt hastalıkları altında yatan biyolojinin anlayışımız hala sınırlıdır. biyopsi yapılan deri numunelerinden izole kaliteli (tek) hücre popülasyonları için bir ihtiyaç vardır. Şimdiye kadar, izolasyon prosedürleri ciddi canlı hücre yeterli sayıda elde eksikliği ile engellenmiştir edilmiştir. İzolasyon ve sonraki analizler nedeniyle de elde etmek için geçerli ayrılma işlemleri nedeniyle mekanik ve kimyasal strese, immün hücre soyu belirteçleri kaybı etkilenmişTek hücre süspansiyonu. Burada, otomatik bir doku aynştıncı ve kollajenaz muamelesi ile mekanik deri ayrışmasını birleştirerek sağlıklı ve ilgili her iki psoriatik insan deri T hücrelerinin izole edilmesi için bir tadil edilmiş yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması üzerine, CD4, CD8, Foxp3 ve CD11c gibi en bağışıklık soy işaretlerinin ifadesi korur. Başarılı CD4 + T hücre izolasyonu ve sonraki fenotipik ve fonksiyonel analiz örnekleri gösterilmiştir.

Burada sunulan protokol, tek bir 4 mm deri biyopsisi kullanırken 760 ± 178.000 kadar 615 (± SEM, sağlıklı gönüllülerin cilt demek) ± 2.200 arasında insan derisinden canlı lenfositler (± SEM, sedef hastalarının lezyonlu deriye ortalama) verecektir. CD45 + hücrelerinin farklı CD4 + T hücreleri (~% 45), CD8 + T hücreleri (% 30) da dahil olmak üzere, sağlıklı bireylerin derisinden türetilen tek hücre süspansiyonları olarak tanımlanır ve CD11c + DH&#39;...

Deride yerleşik T hücrelerini insan derisi biyopsilerinden etkili bir şekilde izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, akım sitometrik analizi ve ex vivo kültür için yeterli sayıda canlı insan derisinde yerleşik lenfosit sağlar.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Bu prosedürün genel amacı, insan deri biyopsilerinden deri yerleşik T hücrelerini verimli bir şekilde izole etmektir. Bu işlem, öncelikle yuvarlak bir biyopsi punch'ı kullanılarak insan deri biyopsilerinin alınmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, her bir deri biyopsisi bir petri kabı içerisinde dört küçük parçaya bölünür.Ardından, tek hücre süspansiyonu elde etmek için deri dokusu mekanik ve enzimatik olarak ayrıştırılır. Son olarak, deri yerleşikli lenfositler akış sitometrisi ile analiz edilir ve ex vivo olarak kültüre edilir. Nihayetinde, immünboyama ve FACS analizi ile incelenebilecek yeterli sayıda canlı insan deri yerleşikli lenfosit izole edilebilir ve analiz edilebilir.Bu yöntem, dermatoloji ve cilt tümörü immünolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Örneğin, ciltteki yerleşik T hücrelerinin hastalığa nasıl katkıda bulunduğu gibi. Prosedürü, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Xuehui He uygulamalı olarak gösterecektir.Metin protokolüne uygun olarak kültür ortamını hazırladıktan sonra, steril altı kuyucuklu bir kültür plağının üç kuyucuğuna iki mililitre komple ortam ekleyin. Ardından, bir deri biyopsisi almak için dört milimetrelik yuvarlak biyopsi pensi kullanın. Biyopsiyi RPMI 1640 komple kültür ortamına yerleştirin ve dört saate kadar tezgah üzerinde veya gece boyunca dört santigrat derecede (°C) bekletin.Biyopsi inkübe olurken, mavi kapaklı bir disosiyasyon tüpünü etiketleyin ve içine beş mililitre komple kültür ortamı ekleyin. Ardından, biyopsiyi durulamak için steril aletler kullanarak onu birinci kuyucuğa yerleştirin. Dokuyu ikinci kuyucuğa aktarıp durulayın ve ardından aynı işlemi üçüncü kuyucukta bir kez daha tekrarlayın.İyice durulanan deri biyopsisini steril bir petri kabına aktarın ve örneğin üzerine 100 µL komple kültür ortamı pipetleyin. Ardından, deri altı yağ dokusunu dikkatlice kazımak için paslanmaz çelik tek kullanımlık steril bir neşter kullanın. Temiz, steril bir petri kabında, her bir deri biyopsisini dört küçük parçaya bölün.Ardından numuneleri, beş mililitre tam besi yeri içeren hazırlanmış disosiasyon tüpüne aktarın. Tüpün kapağını sıkıca kapatın ve otomatik doku disosiyatörünün koluna baş aşağı gelecek şekilde takın. Tüm numune materyalinin rotor alanında olduğundan emin olun.Ardından, M spleen zero one programını çalıştırarak disosiyasyon işlemini başlatın. Biyopsiyi 56 saniye boyunca uygun dönme hızında disose edin. İşlem tamamlandıktan sonra, disosiyasyon tüpünü disosiyatörden ayırın ve tüm disose materyalin tüpün dibinde toplandığından emin olun.Disosyasyon tüpüne 150 µL kollajenoz bir A ekleyin ve örneği 37 °C'deki çalkalayıcı su banyosunda 60 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, disosyasyon tüpüne 100 µL DNase ekleyin ve iyice karıştırın. Disosyasyon tüpünü otomatik doku disosyatörünün yuvasına yerleştirin ve biyopsiyi bir kez daha disose etmek için M spleen sıfır bir programını çalıştırın.Ardından, 50 mililitrelik bir falcon tüpünün üzerine 70 mikromolar naylon hücre süzgeci yerleştirin ve hücre kümeleri ile doku artıklarını uzaklaştırmak için ayrıştırılmış örnek materyallerini hücre süzgecine uygulayın. Hücre süzgecini bir kez yıkamak için beş mililitre komple besiyeri kullanın. Daha sonra, süpernatantı aspire etmeden önce filtratı 450 G ve 20 derece santigrat, artı veya eksi iki derece sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Yıkama adımını bir kez daha tekrarladıktan sonra, hücre peletlerini yeniden süspanse etmek için 300 µL komple kültür ortamı kullanın. Tek hücre süspansiyonları artık ileri analizler için hazırdır. Hücre içi sitokin boyaması gerçekleştirmek için, hücreleri stimüle etmek amacıyla PMA, ionomysin ve brefeldin A kullanın ve akış sitometrisi analizini gerçekleştirmeden önce 37 °C'de ve %5 CO2'de dört saat boyunca inkübe edin.Deri yerleşik T hücrelerinin poliklonal aktivasyonunu gerçekleştirmek için, tek hücre süspansiyonundan 100 µL'lik alıkotlar alarak yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Anti-CD3, anti-CD28 massa antikor kaplı mikroboncuklar, rekombinant insan sitokinleri IL-2 ve IL-1B ekleyin. Kültür plağını, üzerinde etiket bulunan ağırlıklı bir kapakla kapatın ve 37 °C'de, %5 CO2 ve %100 nem koşullarında inkübe edin.Ardından, besiyerinin rengi sarardığında besiyerini değiştirin. Hücre kültüründe sekizinci günde net bir hücre kolonisi gözlemlenebilir. FACS analizi gerçekleştirmek için ilgili hücreleri V tabanlı 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın.450 G'de ve 20 °C'de (artı veya eksi iki derece) iki dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı aspire edin. Hücreleri boyamak için, hazırlanan 100 µL floresan 780 konjuge sabitlenebilir canlılık boyasını kullanarak 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, 100 µL FACS tamponu ekleyin ve süpernatantı aspire etmeden önce santrifüj yapın. Daha sonra, metin protokolünde verilen listeden hücre yüzey belirteci monoklonal antikorlarını seçerek, antikor çözeltilerini hazırlamak için FACS tamponu kullanın. Kapı ayarlarını belirlemek için antikorların izotip kontrolünü boyanmamış bir örnekle birlikte kullanın.Şimdi, her bir kuyucuğa hazırlanan fare antikor karışımından 25 µL ekleyin ve ışıktan koruyun. 20 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. 100 µL FACS tamponu ekleyin, santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin.Metin protokolüne göre foxp3 boyaması için hazırlanan tamponları kullanarak, peletleri yeniden süspand etmek için 100 µL fiksasyon ve permeabilizasyon tamponu ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Ardından, her kuyucuğa 100 µL permeabilizasyon tamponu ekleyin ve süpernatantı aspire etmeden önce santrifüjleyin.Hücreleri bir kez daha yıkadıktan ve uygun antikorları seçtikten sonra, her bir kuyucuğa 20 µL hazırlanan monoklonal antikor karışımı ekleyin ve 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe etmeden önce ışıktan koruyun. Permeabilizasyon tamponu kullanarak hücreleri bir kez daha yıkayın. Ardından, peletleri yeniden süspande etmek için 110 µL FACS tamponu kullanın ve hücre süspansiyonlarını mikro FACS tüplerine aktarın.Son olarak, kesin hücre sayısının gerekli olduğu durumlarda, FACS ölçümleri yapılmadan hemen önce her örneğe iyi karıştırılmış homojen bir flurospheres süspansiyonundan 10 µL ekleyin. Burada gösterildiği üzere, sağlıklı bireylerin derisinden elde edilen tek hücre süspansiyonlarında CD4 pozitif T hücreleri, CD8 pozitif T hücreleri ve CD11c pozitif dendritik hücreler dahil olmak üzere farklı türde CD45 pozitif lökositler tanımlanmıştır.Buna karşılık, çok az sayıda B hücresi, NK hücresi veya makrofaj gözlemlenmiştir. Ayrıca, bu metodoloji insan deri biyopsilerinde CD4 pozitif CD25 pozitif foxp3 pozitif hücrelerin analizine olanak tanır. Örneğin, fiksasyon ve permeabilizasyon sonrası hücre içi boyama kullanılarak, CD25 pozitif T hücrelerinde foxp3 transkripsiyon faktörünün ekspresyonu gösterilebilir.Burada gösterildiği üzere, arka plan otofloresansından ve otofloresan hücre popülasyonundan kaçınmak için, lenfosit popülasyonunun kapılanması (gating) aşamasında brilliant violet 421 florokromuna konjuge edilmiş anti-human CD45 fare antikoru önerilir. Bu şekil, insan derisindeki yerleşik hücrelerin çoğunluğunun CD3 pozitif T hücreleri olduğunu göstermektedir. Hücre canlılık analizi için, canlı hücreleri ölü veya ölmekte olan hücrelerden ayırt etmek amacıyla fikse edilebilir bir canlılık boyası önerilir.Daha ileri fonksiyonel analizler için, psoriasis hastalarından alınan lezyonlu bölgeye ait tek bir dört milimetrelik deri biyopsisi kullanılarak, biyopsiden türetilen T hücrelerinin IL-17a ve interferon gamma ürettiği gösterilmiştir. Bu üretim, brefeldin A varlığında PMA ionomycin ile dört saatlik stimülasyonun ardından gerçekleşmiştir. Son olarak, bu şekil, psoriasis hastalarından alınan T hücrelerinin, psoriasis ile ilişkili sitokinler olan IL-17a ve interferon gamma üretme kapasitesinin çok daha yüksek olduğunu göstermektedir. İnsan dokusu ve laboratuvar ajanlarıyla çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın.Her zaman güvenlik önlemlerini dikkate alın.

lymphocyte-isolation-from-human-skin-for-phenotypic-analysis-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

T lenfosit göç homing lenfoid organlar, damar çıkış sırasında oluşur ve periferik dokularda girmeden. Burada, T lenfosit göçü analiz etmek için kullanılan bir protokol...

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu protokol, çeşitli normal ve malign insan dokularında bulunan CD45+ hücrelerinin (lenfositler/lökositler) kalitatif ve kantitatif değerlendirmesi için taze insan doku fragmanlarının hızlı enzimatik olmayan ayrışmasını tanımlar. Ek olarak, birincil doku homojenatından elde edilen süpernatant, daha fazla analiz veya deney için toplanabilir ve saklanabilir.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

Cilt, karmaşık bir bağışıklık hücresi ağına ev sahipliği yapar. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek ve deride bulunan farklı lökosit popülasyonlarını akış sitometrisi ile analiz etmek için hayvanın vücudunun farklı bölgelerinden fare derisinin sindirimi için etkili bir metodoloji açıklıyoruz.

Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

Bu protokolün amacı floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak insan lenfatik malformasyon kiste benzer damarları ve derisini astar lenfatik endotel hücreleri izole etmektir. Daha sonra hücre kültürü ve bu hücrelerin genişlemesi, genetik proteomik, işlevsel ve hücre farklılaşması çalışmaları için deney sofistike yeni bir düzeyde izin verir.

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Bu protokol, fare derisinin besin açısından zengin ortamda enzimatik sindirimini ve ardından lökositleri izole etmek için gradyan ayrımını tanımlar.  Bu şekilde türetilen hücreler, çeşitli alt uygulamalar için kullanılabilir. Bu, doku ayrışma makinelerine ve daha sert tripsin ve dispas bazlı doku sindirim protokollerine etkili, ekonomik ve gelişmiş bir alternatiftir.

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Burada, Plasmodium sporozoitlerinin intradermal enjeksiyonunu takiben fare derisinden miyeloid hücreleri izole etmek ve lenf düğümünü boşaltmak için bir protokol açıklıyoruz. Toplanan hücrelerin akış sitometrisi, cildi karakterize etmek ve parazite karşı drenaj lenf nodu inflamatuar yanıtını karakterize etmek için güvenilir bir test sağlar.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu yazıda insan derisinden papiller ve retiküler fibroblastların yalıtımına yönelik FACS tabanlı bir protokol açıklanmaktadır. Eksplant kültürler aracılığıyla yaygın olarak kullanılan izolasyon protokolüyle kaçınılmaz olan in vitro kültürünü bozur. Yayılımlı fibroblast alt setleri işlevsel olarak farklıdır ve dermis içinde diferansiyel gen ifadesi ve lokalizasyonu görüntüler.

Floresan-aktif hücre sıralama ile ınsan derisinden papiller ve Reiküler fibroblastların izolasyonu

Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Öğrenin insan deri biyopsilerinden T hücre izolasyonu ve akış sitometrisi analizi yöntemini. Bu protokol, canlı lenfositlerin elde edilmesi ve ekz vivo kültürü için etkili bir temel sunar.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu

Daha fazla video keşfet