Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

Bu prosedürün genel amacı, doğal cilde benzeyen üç boyutlu tam kalınlıkta bir cilt eşdeğeri oluşturmak ve otomatik bir yaralama cihazı kullanarak steril koşullar altında kesin ve tekrarlanabilir yaralar oluşturmaktır. Bu, ilk olarak birincil insan dermal fibroblastlarının bir kollajen bir hidrojel içine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, birincil insan epidermal keratinositleri, fibronektin kaplı hidrojelin üstüne oturtulur.

Daha sonra model batık koşullar altında kültürlenir ve daha sonra bir hava sıvı arayüzü altında, bir dermal bileşen ve çok katmanlı bir epidermisten oluşan üç boyutlu tam kalınlıkta bir cilt eşdeğeri oluşturulur. Son olarak, steril bir ortamda standart bir yara oluşturulur. Sonuç olarak, immünohistokimyasal boyama ve mikroskopi, yaralı tam kat cilt eşdeğerinin histolojik yapısını değerlendirmek için kullanılır.

Bu tekniğin, örneğin hayvan modelleri gibi mevcut yöntemlerin ana avantajı, tam kalınlıktaki deri eşdeğerinin birincil insan hücrelerinden oluşmasıdır. Bu nedenle, otomatik yaralama cihazı ile birlikte standartlaştırılmış yaralar oluşturabiliriz, böylece otomatik yaralama cihazı, insancıllaştırılmış ortamda cilt yara iyileşme süreçleri hakkında bilgi sağlayabilir. Kemik doku mühendisliği gibi sistemlerimize de uygulanabilir.

Bu yöntem, biyolojik süreçler, altta yatan cilt onarımı ve epidermal ve dermal bileşen arasındaki hücresel karışma gibi yara iyileşmesinin temel sorularını yanıtlamaya yardımcı olabilir. Başlamak için, kollajeni% 0.1 asetik asit ile mililitre başına altı miligramlık bir nihai konsantrasyona çözün. 232.5 mililitre iki X dmm, 7.5 mililitre FCS, 7.5, mililitre üç molar hees ve mililitre başına 2.5 mililitre beş miligram karıştırarak jel nötralizasyon çözeltisi hazırlayın.

Kondroitin sülfat, 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirilir, insan dermal fibroblastlarını veya HDFS'yi ayırır ve hücre süspansiyonlarını beş dakika boyunca santrifüjler. 270 G'de hücreleri sayın ve beş dakika boyunca 1.200.000 HDF'lik bir Eloqua'yı santrifüjleyin. 270 G'de, snat'ı çıkarın ve hava kabarcıklarına neden olmadan HDF'yi dikkatlice yeniden süspanse etmek için dört mililitre soğutulmuş jel nötralizasyon çözeltisi kullanın.

Daha sonra çözeltiyi sekiz mililitre kollajen çözeltisi ile tekrar süspanse edin. Ardından, çok adımlı bir pipet kullanın ve her bir parçaya 500 mikrolitre kolajen hücre karışımı ekleyin. 24 oyuklu plakada, jellerin katılaşmasına izin vermek için jelleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra kuyu başına iki mililitre DMM artı% 10 FCS kullanın. Jelleri batırmak için, jelleri 24 saat inkübe edin. İnsan fibronektin proteinini mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona çözmek için ultra saf su kullanın.

Dermal eşdeğer jelleri 24 saat inkübe ettikten sonra ortamı çıkarın. Her dermal eşdeğerini kaplamak için 25 mikrolitre fibronektin çözeltisi kullanın ve jelleri 30 dakika inkübe edin. Bu arada, insan epidermalini, keratinositlerini veya HKS'yi kgm iki artı% 5 FCS ile litre tohum başına 1 milyon hücre, her jelin üzerine 100.000 topuk nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin.

Daha sonra, hücrelerin yapışmasını sağlamak için jelleri 45 dakika inkübe edin, kgm iki hazır ve% 5 FCS hücreleri daldırın ve inkübasyona devam edin. İki ila üç gün inkübe ettikten sonra, ortamı %2 FCS ile değiştirin ve ardından iki ila üç gün sonra FCS'siz orta replasman yapın. Yedinci gün, ortamı tamamen çıkarın.

Her bir parçayı altı oyuklu bir plakanın bir oyuğuna yerleştirmek için steril forseps kullanın. Daha sonra kuyucuk başına 1,5 mililitre hava ikmal ortamı ekleyin. FTSC'nin yüzeyini ıslatmamaya dikkat edin.

Ortamı 14 gün daha olmak üzere her iki ila üç günde bir değiştirin. Steril forseps kullanarak çalışma alanını dezenfekte etmek için %70 etanol ve ultraviyole ışık kullanarak otomatik yaralama cihazını hazırlayın. Cilt eşdeğerlerini otoklav numune taşıyıcı plakasının belirlenmiş alanlarına yerleştirin.

Delme kafasının altındaki yuvaya bir numune taşıyıcı plaka yerleştirin. Yara parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlamak için kontrol yazılımını kullanın. Sıkma hızı 15.000 RPM penetrasyon, 1.5 milimetre.

Tahrik 100 hertz. Yaralama parametrelerini otomatik yaralama cihazına aktarın. Tamamlandığında yaralama prosedürüne başlayın.

Numune taşıyıcı plakayı soketten çıkarın ve yaralı FTSE'yi kültürleme için kullanılan ek parçaya geri aktarmak için steril forseps kullanın. Yaralı FTSE'yi deneysel değerlendirmeye kadar kuluçkaya yatırın. Modelleri herhangi bir zamanda histolojik analizi için kullanın.

İzole edilen HDFS ve HKS, FTSE için kullanılmadan önce immünohistokimyasal boyama ile karakterize edildi. HDF, fibroblastlar için bir belirteç olan menton için pozitiftir, primer HEK, erken farklılaşma proteini CYTOKERATIN 14'ü yüksek oranda eksprese eder, ancak neredeyse hiç geç keratinosit farklılaşma proteini CYTOKERATIN 10'u eksprese etmez. FTSE, batık ortam koşulları altında yedi gün boyunca kültürlendi, ardından hava sıvı arayüzünde 14 gün boyunca kültürlendi.

Bu süreçte, FTSC 21 gün içinde önemli ölçüde sözleşme yapar. HES, modellerin yüzeyi havaya maruz kalacak şekilde orta seviyeyi değiştirerek çoğalmaktadır. Ve kalsiyum konsantrasyonunu artırarak, HKS, keratinositlerin birkaç hayati hücre katmanından oluşan çok hücreli bir epidermise farklılaşmak üzere uyarılır.

D farklılaşması ve atriyum korneasının farklı durumlarında. FTSE'nin hematin ve eozin boyaması doğal insan derisi ile karşılaştırıldığında, FTSE'nin cildin histolojik mimarisini taklit ettiği ortaya çıkar. Kollajen bir hidrojeldeki HDF, vimentine karşı birincil antikorlarla boyanabilir.

Ek olarak, keratinositler, sitokeratin 14 pozitif hücrelerden ve geç farklılaşma belirtecinden oluşan bir epidermal tabaka oluşturur. SİTOKERATİN 10, süper bazal katmanlarda eksprese edilir. Ayrıca, St.Stratum cornium, geliştirildikten sonra RIN için olumludur.

Bu teknik, dermatoloji alanındaki araştırmacıların kutanöz yara iyileşmesini ve insan cildini yakından taklit eden standart bir in vitro kurulumu keşfetmelerinin yolunu açtı.