Name: Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin, otomatik yaralama cihazı kullanarak tam kalınlıklı üç boyutlu deri eşdeğeri oluşturmayı ve steril koşullarda standart yaralar üretmeyi. Bu yöntem, yara iyileşmesi ve cilt biyolojisi araştırmalarında insan hücreleriyle çalışma imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, otomatik yaralama cihazının yapımıyla ilgili işbirliği için Fraunhofer ISC'ye teşekkür eder. Proje, Fraunhofer'in şirket içi projesi "Märkte von Übermorgen" (SkinHeal) tarafından kuruldu.

NOT: protokol 24 tam kalınlıkta deri eşdeğerleri üretimi için tasarlanmıştır. Dermal fibroblastlar ve epidermal keratinositler İnsan 21,22 Aydınlatılmış onam önceden elde edildi. Daha önce yayınlanmış protokole göre deri biyopsi izole edilmiş ve çalışma Julius-Maximilians-Üniversitesi Würzburg insan araştırma kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır (182 oy / 10). Dermal Bileşeni 1. Üretimi <ol><li> 6 mg / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar% 0.1 asetik asit ile kollajen çözülür. Jel nötrleştirme çözeltisi için, 232,5 mi 2x DMEM, 7.5 ml cenin buzağı serumu, 7.5 ml 3 M HEPES, 2.5 ml kondroitin sülfat (5 mg / ml) karıştırın. Buz üzerinde jel nötrleştirme çözeltisi ve kolajen çözeltisi tutun. Insert / deri eşdeğeri başına jel 500 ul hesaplayın. NOT: jel nötrleştirme çözeltisi kolajen çözeltisi Prepa iki parça ile karıştırılacaktır Adıkolajen çift miktarı yeniden. </li><li> 24 plaka içine 24 ekler yerleştirin. </li><li> 10 ml DMEM, 270 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj insan dermal fibroblastları (HDF) yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. X g, 270 ° C&#39;de 5 dakika için gerekli HDF bir miktar (500 ul kollajen jel başına 5 x 10 4 hücrelerinde) ve santrifüj hücreleri ekstrakte edin. </li><li> 4 ml hava kabarcıkları üretmeden jel nötralizasyon çözümü soğutulmuş HDF tekrar süspansiyon dikkatlice Süpernatantı ve. Bu aşamada itibaren kollajen jeller erken katılaşmasını önlemek için mümkün olduğunca hızlı çalışması için emin olun. </li><li> Kolajen çözeltisi, 8 ml çözelti yeniden süspanse edin. </li><li> Çok aşamalı-pipet ile kollajen-hücre-karışımı alın ve her insert hızlı karışımın 500 ul doldurun. Bir kuluçka makinesi içinde 20 dakika süreyle inkübe edin jeller (37 ° C,% 5 CO2) jelleri jöle için. </li><li> Oyuk başına 2 ml&#39;lik Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)% 10 fetal dana serumu (FCS) içinde jeller daldırınve bir kuluçka makinesi içinde 24 saat (37 ° C,% 5 CO2) için kuluçkalayın. </li></ol> İnsan epidermal Keratinositler 2. eklenmesi (HEK) <ol><li> 24 saat sonra, orta çıkarın. 50 ug / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar ultra-saf su ile fibronektin insan proteinini çözülür. Fibronektin çözeltisi 25 ul eşdeğer her dermal örtün. Bir kuluçka makinesi içinde, 30 dakika süre ile inkübe jeller (37 ° C,% 5 CO2). </li><li> Bu arada, 10 mi KGM-2&#39;de HEK tekrar süspansiyon ve KGM-2 5 + uyumlu% FCS ile 1 x 10 6 hücre / ml hücre konsantrasyonu ayarlanır. Her jel üzerinde Tohum 1 x 10 5 HEK. Inkübatörde 45 dakika boyunca (37 ° C,% 5 CO2) hücre yapışmasının sağlanması için jeller inkübe edin. </li><li> Kuluçka makinesi içinde, KGM-2 + uyumlu,% 5 FCS ve kültür olması (37 ° C,% 5 CO2) ile jeller batırın. </li></ol> Tam Kalınlıkta Deri Benzerleri 3. Kültür (FTSE) <ol><li> 6-7 gün boyunca kültür ftseFCS konsantrasyonu (% 5,% 2, ve% 0 FCS) inen. Bir sonraki alt FCS konsantrasyonu ile 2-3 günde orta değiştirin. Bunun için, tam orta kaldırmak ve taze ortam içinde 1.6 ml ilave ediniz. </li><li> 7. günde, tam ortam maddesinin ayrılması. NOT: Bunu yaparken pipet ucu ile FTSE yüzeyine dokunmayın. </li><li> Her steril forseps ile 6 plaka 1 kuyuya eklemek yerleştirin. FTSE yüzeyini ıslak değil sağlanabil- iyi başına 1.5 ml hava ikmal orta ekleyin. Ilave 14 gün boyunca 2-3 günde bir değiştirilen ortam içinde. NOT: orta dolum seviyesi FTSE menisküsüne kadar. </li></ol> 4. Histolojik analiz <ol><li> Tespit ve FTSE parafin-gömme <ol><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca dokular taze 24 yuvalı plakalar içinde uçlar aktarmak ve de 1.6 mi, her ila% paraformaldehid 4 eklenerek dokular tamir ve inkübe, kültür ortamı çıkarın. Dikkat! Paraformaldehyd toksik, davlumbaz altında manipüle. TransferBir doku gömme kaset FTSE. Su ile yıkama ile geri kalan fiksatif çıkarın ve artan etanol konsantrasyonu kullanılarak doku dihidrat. </li><li> Orta dikey bir kesik yoluyla deri eşdeğer bölün. Aşağı kesilmiş yüzeyleri ile bir parafin dolu metal taban kalıp iki adet yerleştirin. Bir destek olarak, kalıbın üst doku kaseti ekleyin. </li><li> Uygun mikroskop lamı üzerine slaytlar monte, 3-5 mikron dilim kesin ve straitening için 40 ° C su banyosunda onları yüzer. Iyice kuru dilim. </li></ol></li><li> Hematoksilen &amp; Eosin (H &amp; E) ve immunohistokimyasal (İHK) boyama <ol><li> Talep rafa kayar ve 60 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin. Parafin erimiş olduğundan emin olun. Leke standart bakış boyama gibi H &amp; E ile dilimleri rehidre. </li><li> H &amp; E boyama için etanol% 50, 4x deiyonize su, 1x Hematoksilin, 1x HCI-e 1x, etanol ile 2x, etanol ile 3x, ksilolde ile% 70% 96 4x cam boyama cuvettes hazırlamak-metanol (13.7 mi, 1 M HCI reklam 200 ml% 50 etanol), 1x kullanma suyu, 1x eozin ve 2 x 2-propanol (100 ml deiyonize su içinde 1 g eosin). </li><li> Yer ksilol I 10 dakika ve deparaffinize ve slaytlar rehydrate xylol II 10 dakika slaytlar. Daldırma etanol,% 50 etanol% 70, 3 x 3x, etanol ile% 96 I, 3 x 96% II 3x kayar. Deiyonize su slaytlar döndürün. Hematoksilen boyası, HCI-etanol daldırma 2x ayırt etmek. Iyonu giderilmiş su içinde durulayın. Blueing için, yer sekme suda 5 dakika slaytlar. Eozin boyama, yer eozin 1 dakika kayar ve deiyonize su içinde daha sonra yıkanır. Dehidrasyon için, daldırma slaytlar etanol,% 96 etanol içinde% 70, 2 x 2 x ve 2-propanol II, 5 dakika için, 2-propanol I, 5 dakika için koyun, ksilol içinde 5 dakika I ve ksilol II 5 dak. H &amp; E boyama sonra, hücre çekirdekleri kırmızı lekeli mavi, sitoplazma ve hücre dışı matriks içinde lekeli. </li><li> Antijen alımı için, ksilen ile parafin kaldırmak ve boyama için dilimleri rehydrate. Yer dilimleriDüdüklü tencereyi önceden ısıtılmış 10 mM, 20 dakika sitrat tamponu (pH 6) için deparafinize ve rehidre dilimleri yemek ve. </li><li> Bir sıvı itici slayt işaretleyici kalem veya elmas kalemle yıkama tamponu yerleştirin slaytlar (PBS tampon +% 0.5 Polisorbat 20) ve daire dilimleri. </li><li> Bir nem odasında slaytlar yerleştirin. Her bir dilim üzerine 100 ul% 3 hidrojen peroksit çözeltisi ilave edilerek, endojenez peroksidazı bloke eder. Dikkat! Cilt ve göz temasında Çok tehlikeli. Kişisel koruyucu ekipman ile taşıyınız. Yıkama yıkama tamponu slaytlar. </li><li> Birincil antikor uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Yıkama Yıkama tamponu ile üç kez kayar. Burada, numuneler karanlıkta tutulmalıdır. </li><li> Bağlayıcı spesifik bir antijen-antikor tespiti için biyotin-streptavidin algılama sistemi kullanın. </li><li> 1 dakika boyunca Hematoksilen çekirdekler Counterstain. Kurutmak ve slaytlar monte edin. </li><li> Bir ters mikroskop kullanılarak görüntü örnekleri. </li></ol></li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Otomatik Yaralama Cihazı Kullanımı yaralanma (AWD) <ol><li> % 70 etanol ve ultraviyole ışık ile çalışma alanını dezenfekte ile AWD hazırlayın. Istenilen büyüklükte sondaj kafası emin olun (örneğin, 1 mm) eklenmiştir. </li><li> Steril forseps kullanarak otoklava numune taşıyıcı plakanın belirlenen alanlara cilt eşdeğerleri yerleştirin. Sondaj başının altındaki sokete örnek taşıyıcı plaka yerleştirin. </li><li> Spin hızı: aşağıdaki gibi yaralama parametrelerini ayarlamak için kontrol yazılımını kullanın 15,000 rpm; penetrasyon: 1,5 mm; tahrik: 100 Hz. Bu parametreler, her bir numune tipi için tanımlanması gerekir. Transferi AWD parametreleri yaralandı. </li><li> Prosedürü yaralama başlayın. Soket örnek taşıyıcı plakasını çıkarın. Aktarım steril forseps kullanarak kültürü için kullanılan ekler geri FTSE yaralandı. </li><li> Rejenerasyon araştırılması için kuluçka makinesi içinde yaralı ftse kültürü (37 ° C,% 5 CO2) devam edin. Alternatively, herhangi bir zamanda, histolojik analiz için modeller kullanmaktadır. </li></ol>

<ol><li>Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin%3A+an+indispensable+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The skin: an indispensable barrier.</a> Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).</li>
<li>Guo, S., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting wound healing.</a> J Dent Res. 89, 219-229 (2010).</li>
<li>Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wound+healing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Clin%22%5BJournal%5D)">The wound healing process.</a> Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).</li>
<li>Cory, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch-wound+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scratch-wound assay.</a> Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).</li>
<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).</li>
<li>Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+in+vitro+model+of+tissue-engineered+human+skin+to+study+keratinocyte+attachment+and+migration+in+the+process+of+reepithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization.</a> Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).</li>
<li>Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+bilayered+living+skin+construct+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a bilayered living skin construct for clinical applications.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).</li>
<li>Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+3D+organotypic+cultures+using+human+neonatal+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells.</a> Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).</li>
<li>Boyce, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+substitutes+from+cultured+cells+and+collagen-GAG+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers.</a> Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).</li>
<li>El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+PEGT%2FPBT+as+a+dermal+scaffold+for+skin+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering.</a> Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).</li>
<li>Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+growth+regulation+in+fibroblast+cocultures+via+a+double+paracrine+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism.</a> J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).</li>
<li>Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+burn+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro burn wound model.</a> Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).</li>
<li>Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+wound+model+based+on+the+co-culture+of+human+dermal+microvascular+endothelial+cells+and+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts.</a> Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).</li>
<li>Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+model+of+partial+thickness+scald+burns+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A standardized model of partial thickness scald burns in mice.</a> J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).</li>
<li>Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+type%2C+but+neither+race+nor+gender%2C+influence+epidermal+permeability+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function.</a> Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).</li>
<li>Pilcher, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+collagenase-1+expression+requires+an+epidermal+growth+factor+receptor+autocrine+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism.</a> J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).</li>
<li>Blank, I. H., Miller, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+the+epidermis+from+the+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of the epidermis from the dermis.</a> J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).</li>
<li>El Ghalbzouri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+facilitate+re-epithelialization+in+wounded+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents.</a> Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).</li>
<li>Vaughan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+laser-wounded+skin+equivalent+model+to+study+the+effects+of+aging+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Res%22%5BJournal%5D)">A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro.</a> Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).</li>
<li>Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+model+of+wound+healing+based+on+transplanted+tissue-engineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin.</a> Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).</li>
<li>Bell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstitution+of+living+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The reconstitution of living skin.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).</li>
<li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+%27simplified%27+skin%3A+control+of+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Nitro hücrelerde genellikle hücreler plastik yüzeylere yapışan iki boyutlu hücre kültürlerinde, yayılır. Bununla birlikte, bu kültür koşulları hücrelerinin in vivo büyümek olan fizyolojik üç boyutlu koşulları yansıtmamaktadır. Üç boyutlu koşulları altında, hücreler, doğal hücre-hücre ve hücre-matris bağlanmalarının ve üç boyutlu olarak yer değiştirmektedir. Hücre göçü ve matriks üretimi yara iyileşmesinin temel unsurları olarak özellikle in vivo durumun benzerlik iyileşme deri yara, anlamlı ve...

Deri vücudun en büyük organıdır. Bu dış çevre ve iç organlar arasında bir bariyer oluşturur. Ayrıca, cilt sıvı kaybı, çevresel etkilere, yaralanma ve enfeksiyonlara karşı vücudu korur ve vücut ısısını 1 düzenlemeye yardımcı olur. Nedeniyle açıkta bir konumda, cilt genellikle mekanik, termal veya kimyasal travma etkilenir. Cilt kendini tamir genellikle yetenekli olmasına rağmen, böyle bir enfeksiyon, oksijenlenme ve venöz yeterlilik gibi birden fazla yerel faktörler bozulmuş yara iyileşmesi yol açabilir. Yara iyileşmesi de obezite, alkolizm, sigara, ilaç, beslenme ve diyabet gibi hastalıklar gibi sistemik faktörler tarafından müdahale edilebilir. 2 (i) iltihaplı faz, (ii) proliferatif ve (iii) yeniden modelleme aşaması: yara iyileşmesi süreci 3 evreye ayrılabilir. Cilde hasar üzerine, karmaşık bir sinyal kademeli yara kapanmasına neden başlar. 3Yaralanma sonrası yara kanama ve bir kan pıhtısı meydana gelir. Fibroblastlar kan pıhtısı içine taşımak ve daha sonra yılda yenilenmiş yeni doku ile değiştirin. Biyolojik süreçler altta yatan deri onarım mevcut anlayış sınırlıdır. Küçük hayvan ve domuz modelleri yara iyileşmesini incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu sonuçlar, doğrudan türe özgü farklılıklar nedeniyle insanlarda transfer edilemez. Bu in vivo modellerde ek olarak, yara iyileşmesi bazı yönlerini 4 Bu çizilmeye modeller oldukça standardize edilir. Ölümsüzleştirdi hücre hatları veya primer hücrelerde dayalı in vitro tek tabaka kültürlerinin çizilmemesi yoluyla bir yara durumu taklit ederek ele alınabilir, ancak yeterince yansıtmıyor kompleks in vivo olarak fizyoloji. 5, iki-boyutlu bir model yanı sıra, üç-boyutlu bir insan derisi eşdeğer dermatolojik araştırmaları için geliştirilmiştir. Bu modellerin dermal kısmı ge vardırnerated decellularized dermis, 6 kollajen hidrojeller, 7,8 glikosaminoglikanlar 9 veya sentetik malzemelerden dahil olmak üzere çeşitli iskele kullanarak. 10 bu deri eşdeğerleri istihdam, epitelyal-mezenkimal etkileşimleri 11 rolünü yeniden epitelizasyon, fibroblast ve keratinositler arasındaki hücresel karışma Farklı büyüme faktörlerinin etkisi incelenebilir. Ayrıca, bu modeller fibroblastlar yaralı bölgeye göç ve nasıl kemotaktik faktörler doku yenilenmesini nasıl etkilediği hakkında yeni bilgiler elde etmek için yararlıdır. 12 Yara iyileşmesi modelinin kendisinde değil, sadece üretim zor olmakla birlikte, aynı zamanda, bir modelde yüksek ölçüde standardize edilmiş yara sorunludur kurmak. Ortak teknikler yaralar çizik testleri, 13 yanıklara, 14 teyp aşınma, 15 termal yaralanma, 16 emme kabarcıklar, 17 sıvı azot, 18 lazerler, 19 olan oluşturmak için </sup&gt; neşter, 18 meshers 6 ve biyopsi yumruklar. Bu yöntemlerin çoğu 20 aynı tuzaklar var. Elle uygulanan yaralanmalar standartlaştırmak ve çoklu testler arasında yeniden zordur. Boyut, şekil ve yaranın derinliği çalışmalar arasında değişir ve böylece araştırma verilerinin kalitesini bozar. tanımlı cilt yaralanması için lazer kullanımı nispeten kolay standardize ancak yanık yaraları taklit bir duruma yol açar edilebilir. Lazer tarafından uygulanan ısı nekrotik dokunun yol açabilir protein denatürasyonu, trombosit agregasyonu veya damarların daralmasına neden olabilir. Alternatif bir yaklaşımda, bize steril koşullar altında tanımlanmış ve hassas deri yaraları oluşturmak için izin veren bir otomatik yaralama cihazı (AWD) geliştirdi. Derinlik ve hız penetrasyonu olarak matkap ucu devir gibi yaralanması parametreleri ayarlanabilir. Bu çalışmada, biz evde geliştirilen tam kalınlıkta deri eşdeğerleri ile AWD kombine (ftGangatirkar ve arkadaşları tarafından yayınlanmış bir protokol ile karşılaştırılabilir SE). 8 deri eşdeğerinde dermal katman, hidrojel bir kollajen gömülü, insan dermal fibroblastları (HDF), oluşmaktadır. Dermal katmanda, insan epidermal keratinositler (HEK) numaralı seribaşı bulunmaktadır. Hava-sıvı arayüzü iki hafta içinde HEK birçok hayati hücre katmanları ve stratum corneum oluşan bir epidermis kurmak. Bu modelin oluşturmasının yanı sıra, bu çalışma FTSE tanımlanmış ve hassas yaralar oluşturmak üzere AWD kullanımını göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Tripsin EDTA (1:250) DPBS</td><td>PAA</td><td>L11-003'te</td> %<td>0,5 %0,05</td></tr> <tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu</td><td>Salin Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen (% 0.1 asetik asit içinde 6 mg / ml)</td> <td>Evde</td><td></td><td></td>üretilen</tr><tr><td>Fibronektin İnsan Proteini, Plazma (50 & &mikro; g / ml)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Uçlar</td><td>Nunc</td><td>140627</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>140685</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Nunc</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>R. Langenbrinck</td><td>03-0070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Fibroblast kültürü (500 ml):</güçlü></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11965-092</td><td>%89 (445 ml)</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Bio & FCS satmak</td><td>. ADD.0500</td><td>%10 (50 ml)</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>%1 (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Keratinozit kültür ortamı (500 ml):</güçlü></td></tr><tr><td>Keratinosit Büyüme Ortamı 2</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-20111</td><td>%89 (445 ml)</td></tr><tr><td>Keratinosit Büyüme Ortamı 2 Takviye Paketi</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>%1 (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Jel nötralizasyon çözeltisi (250 ml):</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium, L-Glutamin</td><td>PAA</td><td>G0001,3010</td> ile yüksek Glikoz Tozu <td>%93 (232.5 ml)</td></tr><tr><td>Köpekbalığı kıkırdağından kondroitin sülfat sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>C4384-1g</td><td>%1 (2.5 ml)</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Bio & FCS satmak</td><td>. ADD.0500</td><td>%3 (7.5 ml)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H3375-1kg</td><td>%3 (7,5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Skin model submers medium (500&nbsp; ml):</güçlü></td></tr><tr><td>Keratinosit Büyüme Ortamı 2</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-20111</td><td></td></tr><tr><td>Keratinosit Büyüme Ortamı 2 Takviye Paketi</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Bio & FCS satmak</td><td>. ADD.0500</td><td>%5-%2 (25 ml-10 ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>%1 (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Cilt modeli hava-sıvı arayüz ortamı (500 ml):</güçlü></td></tr><tr><td>Keratinosit Büyüme Ortamı 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratinosit Büyüme Ortamı 2 Ek Paket</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td>sadece takviyeler ekleyerek: insülin, hidrokortizon, epinefrin, transferrin, CaCl2</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U / ml)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td>% <td>1 (5 ml)</td></tr> <tr><td>CaCl2 (300 mM)</td> <td>Sigma&nbsp;</td><td>C7902-500g</td><td>%0.62 (3.1 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Histoloji:</td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>CK14 antikoru</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>HPA023040-100 ve mikro; l</td><td></td></tr><tr><td>CK10 antikoru</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td></td></tr><tr><td>Filaggrin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab81468</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>H & E boyama: < / güçlü ></td></tr> <tr><td>Mayer ve akut; s Haemalaun</td><td>AppliChem</td><td>A0884,2500</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296325-4X2L</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-4X2.5L</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eozin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009-5G</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanolol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Montaj Ortamı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1289-10ML</td><td></td></tr></tbody></table>

Üç-boyutlu tam kalınlığı deri Üretimi eşdeğer ve otomatik yaralama

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

in vitro modeller, kutanöz yara iyileşme süreçlerini incelemek için uygun maliyetli ve etik bir alternatiftir. Ayrıca, insan hücrelerini kullanarak, bu modeller insan yara durumunu hayvan modellerinden daha iyi yansıtır. İki boyutlu modeller, hücresel göç ve proliferasyon gibi süreçleri araştırmak için yaygın olarak kullanılsa da, yara iyileşmesi hakkında daha derin bir bilgi edinmek için daha karmaşık modellere ihtiyaç vardır. Uygun bir model sistemin yanı sıra, farklı test çalışmaları arasında karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için hassas ve tekrarlanabilir yaraların oluşturulması çok önemlidir. Bu çalışmada, yara iyileşmesi çalışmasına eşdeğer üç boyutlu tam kalınlıkta bir cildin oluşumu gösterilmiştir. Modellerin dermal kısmı, sıçan kuyruğu kollajen tip I hidrojel içine gömülü insan dermal fibroblastından oluşur. İnsan epidermal keratinositleri ile inokülasyonu ve bunun sonucunda hava-sıvı arayüzünde kültürü takiben, modellerin üzerinde çok katmanlı bir epidermis oluşturulur. Yara iyileşme sürecini incelemek için ayrıca steril bir atmosferde standartlaştırılmış yaralar oluşturan otomatik bir yaralama cihazı geliştirdik.

izole edilmiş bir HDF ve HEK morfolojisinde ve tipik markerlerin ekspresyonu bakımından farklılık gösterir. Hek morfolojisi bir Arnavut kaldırımı morfolojisi ile tarif edilebilir ise Hdf, tipik mil-şekil morfolojisi gösterdi. Hücreler FTSE için bunları kullanmadan önce immünohistokimyasal boyama (Şekil 1) ile karakterize edilmiştir. Hdf vimentin (Şekil 1A), fibroblastlar için bir marker için olumludur. İlköğretim Hek derece erken farklılaşma proteini sitokeratinin-14 (Şekil 1B)<...

Bu protokolün amacı, doğal cilde benzeyen üç boyutlu tam kalınlıkta bir cilt eşdeğeri oluşturmaktır. Özel olarak yapılmış bir otomatik yaralama cihazı ile, sterilitenin korunması altında hassas ve tekrarlanabilir yaralar oluşturulabilir.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bu prosedürün genel amacı, doğal cilde benzeyen üç boyutlu tam katmanlı bir cilt eşdeğeri oluşturmak ve otomatik bir yaralama cihazı kullanarak steril koşullar altında kesin ve tekrarlanabilir yaralar meydana getirmektir. Bu işlem, öncelikle primer insan dermal fibroblastlerinin bir kolajen bir hidrojeline gömülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, primer insan epidermal keratinositleri fibronectin ile kaplanmış hidrojelin üzerine yerleştirilir.Ardından model, önce daldırma koşullarında, daha sonra ise hava-sıvı ara yüzeyinde kültüre edilir; böylece dermal bir bileşen ve çok tabakalı bir epidermisten oluşan, üç boyutlu tam kalınlıkta bir deri eşdeğeri oluşturulur. Son olarak, steril bir ortamda standart bir yara oluşturulur. Nihai olarak, yaralı tam kalınlıkta deri eşdeğerinin histolojik yapısını değerlendirmek için immünohistokimyasal boyama ve mikroskopi kullanılır.Bu tekniğin hayvan modelleri gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, tam kalınlıktaki deri eşdeğerinin primer insan hücrelerinden oluşmasıdır. Böylece, otomatik yaralama cihazı ile birlikte standardize edilmiş yaralar oluşturabiliriz; dolayısıyla otomatik yaralama cihazı, insanlaştırılmış bir ortamda deri yara iyile

generation-three-dimensional-full-thickness-skin-equivalent-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, melanom ilerlemesini incelemek için in vitro 3D organotipik cilt rekonstrüksiyonları oluşturmak için ayrıntılı protokol açıklanmaktadır. Bu cilt modeli, in vivo organların hem mimarisini hem de çok hücreli karmaşıklığını taklit eder.

Organotipik Tam Cilt Rekonstrüksiyonlarının Oluşturulması: İnsan Derisi Örneklerini Kullanarak 3D Cilt Modeli Oluşturma Prosedürü

Vaskülarizasyon başarılı doku mühendisliği yaklaşımları anahtarıdır. Bu nedenle, güvenilir teknolojileri doku yapıları vasküler ağların gelişimini değerlendirmek için gereklidir. Burada görselleştirmek ve in vivo damarlanmayı ölçmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem mevcut.

A Tam Cilt Hata Modeli Biyomateryallerin vaskülarizasyonunu değerlendirin<em&gt; In Vivo</em

Memeli gelişimi sırasında, erken gebelik derisi yaraları iz bırakmadan iyileşir. Burada, E16.5 (yara izi) ve E18.5 (yara izi bırakan) fare embriyolarının kutanöz dorsumunda güvenilir ve tekrarlanabilir bir fetal skarsız yara iyileşmesi modelini detaylandırıyoruz.

Scarless Yara Repair Fare Fetal Cilt Modeli

Bu makale, klinik uygulamalarda, özellikle kutanöz yara yönetiminde kullanılmak üzere uyumlu, cilt benzeri bir elektronik sistem ve protokoller üretmek ve karakterize etmek için yöntemler sunmaktadır.

Kantitatif, Deri Yara Yönetimi için bir konformal Cilt benzeri elektronik Sistemi İmalat ve Karakterizasyonu

Bu makalenin amacı, epidermal keratinositlerden ve devitalize insan dermisinden genetik olarak değiştirilmiş insan organotipik derisinin nasıl oluşturulacağına dair kapsamlı ve ayrıntılı bir protokol sağlamaktır.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

protokol yeni bir yöntem, insan doku ayrıştırmak ve kollajen sünger ile birlikte, deri lezyonlarının tedavisinde kullanıma hazır insan biyo-kompleksleri doğuran otolog mikro greft oluşturmak açıklar. Bundan başka, bu sistem, mekanik ayrıştırma sonra farklı zamanlarda mikro greft hücre canlılığı korur.

Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Bu protokol, üç boyutlu yeniden oluşturulmuş insan epidermisini tekrarlanabilir ve sağlam bir şekilde yetiştirmek için basit bir yöntemi açıklar. Ek olarak, epidermal bariyer modelinin yapı-işlev ilişkisini karakterize eder. Yeniden inşa edilen insan epidermisinin proinflamatuar uyaranlar üzerine biyolojik tepkileri de sunulmaktadır.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

Bu protokolün amacı, uzun vadeli kültür için erişilebilir ve basit teknikler kullanarak damarlı insan derisi eşdeğerlerinin neslini ve hacimsel analizini tanımlamaktır. Mümkün olduğu ölçüde, adımların gerekçesi, araştırmacılara araştırma ihtiyaçlarına göre özelleştirme olanağı sağlamak için açıklanmıştır.

Kendi Kendine Monte Edilmiş Vaskülerleştirilmiş İnsan Derisi Eşdeğerlerinin Üretimi

Burada, mikromakine mikroakışkan bir platform kullanarak üç boyutlu basitleştirilmiş ve farklılaşmamış bir cilt modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Paralel akış yaklaşımı, hepsi şırınna pompaları tarafından kontrol edilen, üstteki epitel hücrelerinin tohumlaması için bir dermal bölmenin yerinde birikmesini sağlar.

Mikromakine Mikroakışkan Platformda Basitleştirilmiş Üç Boyutlu Çip Üzerinde Cilt Modeli Üretimi

Burada, bir hücre kültürü laboratuvarında rutin araştırmalar için çeşitli 3D cilt modellerini tanıtmak için ucuz ve basit prosedürler sunuyoruz. Araştırmacılar, ticari olarak mevcut modellere güvenmeden ihtiyaçlarına göre uyarlanmış modeller oluşturabilirler.

Çok Sayıda Uygulama için Cilt Modelleri Oluşturma - İki Boyutlu (2D) Monokültürden Üç Boyutlu (3D) Çoklu Kültüre

Öğrenin, otomatik yaralama cihazı kullanarak tam kalınlıklı üç boyutlu deri eşdeğeri oluşturmayı ve steril koşullarda standart yaralar üretmeyi. Bu yöntem, yara iyileşmesi ve cilt biyolojisi araştırmalarında insan hücreleriyle çalışma imkanı sunar.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

Daha fazla video keşfet