Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, bunu yapmak için entegre yöntemler kullanarak çevredeki çevre ile biyofilm etkileşimlerini karakterize etmektir. Glikoz içeren ve glikoz içermeyen ortamın bir akış hücresi boyunca pompalandığı ve bir glikoz gradyanı oluşturan çift girişli bir mikroakışkan akış hücresi sistemi inşa edilir. Bakteriler sisteme eklenir ve birkaç gün boyunca biyofilmlerin gelişmesine izin verilir.

Biyofilmler daha sonra solu taşınmasını karakterize etmek için 3D konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Biyofilmler içinde, floresan izleyiciler akış sistemine enjekte edilir ve biyofilm kolonilerinin etrafındaki akış alanını karakterize etmek için hızlandırılmış görüntüleme yapılır, floresan mikroboncuklar enjekte edilir ve hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirilir. Elde edilen verilerin çözünen madde taşınması ve partikül izleme analizi, bu yöntemin tek bir cihazda ve tek bir deney setinde çeşitli kimyasal ortamlar altında biyofilm süreçlerinin değerlendirilmesindeki faydasını göstermektedir.

Bu yöntemlerin temel avantajı, biyofilm ortam etkileşimlerinin birçok yönünün aynı anda değerlendirilmesine izin vermesidir. Burada bildirilen yöntemler, doğal ortamlarda veya biyofilm ile ilgili enfeksiyonlarda biyofilm oluşumu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Laminer akış başlığında çalışarak, bir posa PAO kolonisini, bir GFP ucunu, bir e coli, DH beş alfa kolonisini bir LB plakasından üç mililitre lb et suyu içeren ayrı tüplere aktarın.

Kültürleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ederken 225 RPM'de çalkalayın. Bu akış sistemi, akış odası içinde iki çözeltinin karıştırılmasıyla oluşturulan iyi tanımlanmış bir kimyasal gradyan altında biyofilm büyümesinin gözlemlenmesini kolaylaştıran çift girişli bir mikroakışkan hücreye dayanmaktadır. Akış sırasında, enine yönde düzgün bir konsantrasyon gradyanı oluşur.

Difüzyonun bir sonucu olarak, konsantrasyon profili girişe yakın diktir ve aşağı yönde daha rahattır. Deney günü, akış sistemini dikkatlice monte edin. İlk olarak, boruyu peristaltik pompaya sıkıştırın, ardından borunun bir ucunu 900 mililitre glikozlu FAB ortamı içeren orta boy bir şişeye ve diğer ucunu bir kabarcık tuzağına takın.

Glikoz içermeyen 900 mililitre fab içeren ikinci bir orta boy şişeyi ikinci bir kabarcık tuzağına bağlamak için bu işlemi tekrarlayın. Ardından, akış hücresi girişlerinin hemen önüne üç vanaları yerleştirin ve kabarcık tuzaklarının her birini akış hücresine bağlayın. Son olarak, akış hücresi çıkışını bir atık şişesine bağlayın.

Asılı hücrelerin kapak kızağına yerleşmesini sağlamak için akış hücresinin kapak kayma tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Akış sistemi monte edildikten sonra, sistemi doldurmak için her giriş için saatte 10 mililitre akış hızında peristaltik pompayı açın Orta fab ortamı ile sadece bir girişte sağlanan bir glikoz ile iki girişe verilir. Daha sonra, davlumbazda çalışarak, iki bakteri kültürünü, akış hücresini aşılamak için her bakteri için eşdeğer bir OD 600 0.01 ile bir mililitre steril suda bire bir oranında seyreltin, steril bir plastik şırınga kullanın 500 mikrolitre aşı üç valf aracılığıyla akış hücresi girişlerinin her birine.

Enjeksiyondan sonra, pompayı durdurun ve hücreler bağlandıktan sonra bakteri hücrelerinin bir saat boyunca kapak camına yapışmasına izin verin, pompayı her giriş için dakikada 0,03 mililitreye ayarlayın ve sistemin oda sıcaklığında üç gün boyunca akmasına izin verin ve bu süre zarfında bir biyofilm gelişir. Aradan üç gün geçtikten sonra. Görüntülemeye hazırlanırken akış hücresinin kapak camı tarafına bir ızgara çizmek için bir işaretleyici ve bir cetvel kullanın.

Bu, e coli'yi görüntülemek için lekeye karşı koymak için görüntüleme bölgelerinin bulunmasına yardımcı olacaktır. İlk olarak, karşı leke ışığa duyarlı olduğu için çalışma alanını karartmak için ışıkları söndürün. Bir mililitre seyreltilmiş hücre permean kırmızı floresan nükleik asit boyasını akış odasının yukarı akışındaki üç vanaya yavaşça enjekte etmek için bir şırınga kullanın.

Akışı durdurun. Akış hücresini karanlıkta 30 dakika boyunca durgun tutun. 30 dakika geçtikten sonra.

Akışa dakikada 0,03 mililitre ile devam edin ve bağlanmamış lekeyi 15 dakika boyunca yıkayın. Ardından akışı durdurun ve 63 x objektifli konfokal mikroskopi kullanarak biyofilmleri gözlemleyin. Burada gösterildiği gibi iyi ayrılmış biyofilm kolonileri ile iyi miktarda biyokütle içeren bir görüş alanı bulun.

Ardından, akış hücresi görüntüsü içindeki biyofilm gelişiminin uzamsal modellerini, akış hücresi girişi boyunca üç veya daha fazla uzunlamasına veya X mesafedeki biyofilmleri ve uygulanan beslenme gradyanına göre üç enine veya Y konumunda haritalamak için uygun kanallarda 3B görüntü yığınlarını yakalayın. Biyofilm içindeki çözün taşıma modellerini karakterize etmek için akış hücresi ile başlayın. Üç günlük biyofilm geliştirme sürecinin ardından, yine karanlıkta çalışmak.

Akışı duraklatmak için pompayı durdurun, enjeksiyon basıncını serbest bırakmak için kabarcık tuzaklarını açın. Ardından, akış hücresinin yukarısındaki üç vanalardan herhangi birine bir mililitre seyreltilmiş bilim kurgu izleyici çözeltisi enjekte etmek için bir şırınga kullanın. Bilim kurgu solüsyonunu enjekte ettikten sonra kabarcık tuzaklarını kapatın.

Bilim kurgu çözümünü akış hücresine iletmek için üç vanayı ayarlayın ve pompayı dakikada 0,03 mililitre hızında yeniden başlatın. Ardından, konfokal görüntüleme modunu 0,15 hertz kare hızıyla XYT olarak değiştirin. Boya penetrasyonunu sözlü olarak ifade etmek için yüksek bir zamansal çözünürlük tercih edilir, ancak hızlı tarama görüntü kalitesini düşürür.

Bu nedenle, görüntülemenin zamanını, çözünürlüğünü ve görüntü kalitesini dengelemek için tarama hızını ve çizgi ortalamasını ayarlayın. Görüntüleme parametreleri ayarlandıktan sonra, akışa devam etmek için pompayı yeniden başlatın. Dakikada 0.03 mililitre hızında, sci five aynı anda akış hücresine iletilecektir.

Hızlandırılmış konfokal görüntülemeyi başlatın. Hızlandırılmış görüntüleme tamamlandıktan sonra. Ekteki belgedeki talimatlara göre difüzyon analizi yapıldı.

Biyofilmlerin etrafındaki akış alanını karakterize etmek için, floresan bir mikrometre mikro boncukları sterilize edilmiş su içinde% 0.2'lik bir nihai katı konsantrasyonuna ve 0.5 mililitrelik bir nihai hacme seyreltin. Daha sonra mikro boncukların iyi dağıldığından emin olmak için girdap, akışı duraklatın ve ardından seyreltilmiş floresan mikro boncukları akış hücresine enjekte edin ve verin. Daha önce olduğu gibi, akış hızını saatte 0,01 mililitre olarak değiştirin.

Düşük akış hızı, parçacık yolunun doğru bir şekilde izlenmesini sağlar. Konfokal ayarları XYT moduna getirin ve yazılıma tek bir Z diliminde parçacık hareketini izlemesi talimatını verin. Bir hertz'lik kare hızı kullanarak daha önce olduğu gibi zaman serisi görüntüleri yakalayın.

Partikül enjeksiyon prosedürünü ve görüntüyü farklı Z konumlarında tekrarlayın. Görüntülemeyi tamamladıktan sonra, bir glikoz gradyanı altında bir biyofilmdeki bakteriyel etkileşimleri incelemek üzere akış vektörlerini hesaplamak için ekteki belgedeki talimatları izleyin. Posa, GFP ve E coli, karşı boyama yoluyla çift tür biyofilmlerde farklılaştırıldı.

Cyto ile akış odasındaki dokuz görüntüleme bölgesinin her birinde 62 görüntü elde edildi. Burada gösterilen kaplamalarda, posa GFP yeşil veya sarı görünür ve e coli kırmızı görünür. Posa yüksek glikoz konsantrasyonlarına sahip bölgelerde biyofilm biyokütlesine hakim ve düşük glikoz konsantrasyonlarına sahip bölgelerde e coli baskındır.

Böylece, iki tür farklı ekolojik nişleri işgal etti. Bu sonuçlar, çift girişli mikroakışkan akış hücresinin, karmaşık ortamlarda biyofilm geliştirme aktivitesi ve etkileşimlerinin incelenmesinde faydasını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, kimyasal gradyanlar altında biyofilm yetiştirmek için çift girişli bir mikro akışkan akış hücresinin nasıl kullanılacağını ve floresan parçacıkların veya kovalayıcıların enjeksiyonlarını kullanarak biyofilm gelişimi için çevresel parametrelerin nasıl elde edileceğini iyi anlamalısınız.

Bu yöntemler, çevresel ve klinik mikrobiyoloji alanlarındaki araştırmacıların mikrobiyal topluluklar ve çevrelerindeki çevre arasındaki karmaşık etkileşimleri keşfetmelerinin yolunu açtı.