Name: Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Keşfedin biyofilm-çevre etkileşimlerini mikroakışkan hücre sistemi ve 3D konfokal mikroskopi kullanarak. Bu yöntem, kimyasal gradyanlar altında biyofilm gelişimini ve kütle taşımını incelemek için araştırmacılara kapsamlı bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz P sağlamak için Washington Üniversitesi (Seattle, WA) Matt Parsek teşekkür aeruginosa, E. Akarsular yazılıma erişim sağlamak için Canterbury (Yeni Zelanda) Üniversitesi&#39;nde coli suşları ve Roger Nokes. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü hibe R01AI081983 tarafından desteklenmiştir. Konfokal görüntüleme Kuzeybatı Biyolojik Görüntüleme Tesisi (BIF) gerçekleştirildi.

1. Akış Hücre Kurulum ve Aşılama NOT:. Song ve ark tarif çift giriş mikroakışkan akış hücresi kullanın, 2014 14 biyofilm büyümeye. Bu akış hücresi iyi tanımlanmış pürüzsüz kimyasal degradeler oluşturmak mümkün. Akış hücresi tasarım, önceden Song açıklanan, Şekil 1 &#39;de gösterilen ve hücre imalat akış ve ark., 2014 14. Burada detaylı Yöntemlerimizi P kullanılarak aeruginosa, E. E. coli biyofilm oluşturulması için, ancak diğer türlerin de uygun olabilir. Biz P. kullanılan aeruginosa kurucu biyofilm geliştirilmesi için bir model organizma olarak, yeşil floresan protein (GFP) ifade gfp, PAO1-. Ayrıca, E. kullanılan coli DH5a P. ile karışık türler biyofilm oluşturmak için aeruginosa. P. aeruginosa, E. E. coli suşları LB agar plakaları üzerinde yetiştirildi. <ol><li> A (PDMS) bağlı akış hücresi kullanarak polidimetilsiloksan hazırlayın14 de tarif edildiği gibi, oksijen plazma muamelesi üzerinden cam lamel. Akış hücresi odasının boyutları 0.24 mm (uzunluk x genişlik x derinlik) × 23 mm × 13 mm. </li><li> Hazırlayın FAB büyüme ortamı 15 güncellenmiştir. Akış hücre içinde bir beslenme degrade altında biyofilm büyüme gözlemlemek için, bir girişinde 0,6 mcM glukoz ile 15 orta FAB değiştirilmiş ve diğer giriş boyunca herhangi bir karbon kaynağı olmadan FAB orta tanıtmak getiriyordu. Filtre ile sterilize (gözenek boyutu = 0.2 mm) FAB orta eklemeden önce glikoz stok çözeltisi (60 mM) getirilmiştir. Ayrıca döngüsü 1 FAB orta otoklav (sıvı, 15 dakika, 121 ° C, 17 psi) ile yıkanmıştır. </li><li> Akış sistemi sterilize. Aşılamadan önce, bütün akış yolunu (orta şişe, boru, kabarcık tuzakları, akış hücreleri) akış hücresinin üst bulunan (tek ve önceden sterilize) plastik üç yollu vana hariç, döngüsü 1 kullanarak otoklav. (Üç Yollu vana hücre c enjekte edilmesi için kullanılanulture, floresan izleyici ve mikroboncukları.), montaj sırasında kirlenmesini önlemek alüminyum folyo veya otoklav önce otoklav torbaları ile tüm boru ve bağlantı açıklıkları karşılamak için. </li><li> Akış sistemi bağlayın. Dikkatle akış hücresi sistemi bileşenlerini monte (akış sistemi montajı için video bakınız) ve tam akış hızını kontrol eden bir peristaltik pompa vasıtasıyla akış hücresi büyüme ortamı sunmak. </li><li> P. bir koloni aktararak aşılama için hücre kültürü hazırlayın aeruginosa veya E. LB plakaları 3 LB et suyu ilave edildi ve 225 rpm&#39;de ve 37 ° C&#39;de kültür O / N sallamak için E. coli. Son OD 600 su sterilize 1 ml O / N hücre kültürleri sulandırmak = 0.01 inokulum olarak. (Kültür ve kirlenmeyi önlemek için bir laminer akış kaputu bakteri sulandırmak.) </li><li> Eşdeğer OD 600 ile 1 ml 1 = 0.01 Her bir bakteri için: karışık türleri biyofilm ile deneyler için, 1 oranında iki bakteri kültürleri seyreltin. </li><li> Akış hücresi inoküle. Üç yollu bir valf akış hücresi girişine aşı 1 ml enjekte edilir. Enjeksiyon sonrası, bakteriyel hücreler cam kapak takmak için izin 1 saat akışını durdurun. (Akış hücresi askıya hücreler lamel üzerine yerleşmek için izin aşağı lamel tarafı ile yerleştirildiğinden emin olun.) </li><li> 1 saat sonra, akış devam ve 3 gün süre ile her bir giriş için 0.03 ml / dakikalık bir sabit oranda akış hücresi büyüme ortamı pompa. </li></ol> Konfokal Mikroskobu kullanılarak Besin Gradiyentler Cevabı 2. karakterizasyon Biyofilm Geliştirme NOT: P. aeruginosa kurucu olarak ifade edilen GFP ile görüntülenmiş, ve bununla birlikte E. edilebilir karma türler Biyofilmlererde coli counterstaining tarafından görüntülendi gerekir. <ol><li> Konfokal mikroskopi kullanılarak 3 gün biyofilm gözlemleyin. Temsilcisi sonuçları için bir 63X amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak biyofilm gözlemlemek. Görüntüleme önce işaretleyinizkapak cam tarafında bir ızgara ile çift giriş akış hücresi. (Bu ızgara amacı deneyci akış hücresi odasının içinde görüntüleme bölgeleri bulmak için izin vermektir.) </li><li> Örneğin STYO, 62, 990 ul stok çözeltisi (1 mM) ile sterilize edilmiş su ve daha sonra yavaş yavaş bir şırınga içine kullanılarak seyreltilmiştir leke enjekte, yeşil flüoresan nükleik asit boya olarak hücre-geçirgen kırmızı floresan nükleik asit leke 10 ul seyreltilmiş, counterstain için yukarı üç yollu vana akış hücresi odası. Durgun akış hücresi edin ve 30 dakika boyunca karanlıkta üretilmişler ve sonra 15 dakika için bağlanmamış leke üzerinden yıkama akışı devam eder. </li><li> Konfokal görüntüleme gerçekleştirin. Uyarma için 488 nm Argon lazer ve GFP (500-535 nm) ve (yeşil floresan nükleik asit leke, 650-750 nm) nükleik asit leke kanalları toplama emisyon etkinleştirin. Parlak ve temiz görüntüler için her iki kanal için kazanç ve uzaklıklar ayarlayın. Seç xyz ve eşzamanlı görüntüleme modu. Iden z kontrol düğmesini kullanınalanında biyofilm alt ve üst tespit edebilecektir. 3-D görüntü yığını elde etmek için 0.5 mikron z-adım ayarlayın. (Görüntü elde etmek için dört bir çizgi ortalama kullanmak, yüksek görüntü kalitesini sağlamak için.) </li><li> Üç ya da mekansal akış hücresi içinde biyofilm geliştirme şekilleri, görüntü biyofilm eşlemek için daha uzunlamasına (x) akış hücresi girişi boyunca mesafeler ve Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, üç enine (y), uygulanan besin derecesinde göre konumlandırır . </li></ol> Muhafazakar Floresan Tracer Enjeksiyonların 3. karakterizasyon İç Katı Ulaşım NOT: Cy5 gibi tutucu bir floresanlı işaret ley ic, biyofilm içinde çözünen nakil kalıpları karakterize etmek için kullanılabilir. <ol><li> Bir stok çözeltisi olarak 10 mg / ml&#39;ye bir son konsantrasyona kadar su içinde Cy5 (mono-reaktıf NHS esterlı) içinde çözülür. -20 ° C derin dondurucuda Cy5 stok solüsyonu saklayın. NOT: Cy5 ışık Sensit olduğu gibiive, mağaza, sulandırmak ve karanlıkta Cy5 çözümleri enjekte. </li><li> Floresan izleyici enjeksiyonları öncesinde, (bir 63X amacı ile) konfokal mikroskobu ile 3 gün biyofilm 3-D görüntü yığını alır. (Biyofilm kolonilerin geniş bölgeleri boya nakil zaman serisi gözlemler için idealdir.) (Şekil 5A&#39;da gösterildiği gibi) aynı zamanda görüntüleme için iyi ayrılmış koloniler ile bir z düzlemi seçin. </li><li> Her bir Cy5 enjeksiyon deney için, 20 ug / ml arasında bir Cy5 konsantrasyona sahip bir enjeksiyon çözeltisi elde etmek için su ile sterilize 998 ul Cy5 stok çözeltisi, 2 ul seyreltin. </li><li> Akışını duraklatmak ve 3-yollu vana vasıtasıyla bir şırınga kullanılarak akış hücresinin memba içine Cy5 çözüm enjekte etmek pompayı durdurun. (Bu enjekte ederken akış yolunu girmesini hava kabarcıklarını önlemek için önemlidir. Kabarcık tuzakları geri enjeksiyon sırasında açık tutulmalıdır.) </li><li> Cy5 çözüm enjekte ettikten sonra, 3-yollu vana ayarlamak, kabarcık tuzakları kapatın ve yeniden başlatınakış hücresi enjekte Cy5 çözüm sunmak için pompa. </li><li> XYT için konfokal görüntüleme moduna geçiş. Eşzamanlı görüntüleme modunda Cy5 ve GFP kanalları etkinleştirin. (Lazer yoğunluğu kazanmak ve ofset) Cy5 yoğunluğuna konfokal ayarlarını yapma ölçümü için kritik sinyaller, doyurarak önlemek için. (Yüksek çözünürlüklü zamansal boya penetrasyonu görselleştirmek için tercih edilir. Ancak, hızlı tarama görüntü kalitesini düşürür.) Görüntüleme süresi çözünürlük ve görüntü kalitesi dengelemek için uygun tarama hızı ve çizgi ortalama seçin. Bu protokol için dört bir çizgi ortalama ve 0.15 Hz kare hızı kullanın. </li><li> (Hala 0.03 ml / dk&#39;lık bir akış hızında) akış hücresi içine Cy5 sağlamak için akış devam edin. Aynı anda zaman serisi konfokal görüntüleme başlatın. </li><li> Radyal 2-D dairesel biyofilm koloni içinde Cy5 yoğunluğunu ortalama olarak Cy5 nüfuz niceliğini. Ilk biyofilm küme kenarını tanımlamak, ortalama, ardından kümenin 2-D bölümü için bir mesafe haritası oluşturmakVe son olarak, Cy5 yoğunluklarının ortalaması radyal kalıpları bir penetrasyon eğrisi (bakınız Şekil 6) üretir. <ol><li> Hesaplama 3.8 adıma gerçekleştirmek için, BioSpa (Biyofilm Mekansal Desen Analizi) yazılım paketi (yayınlanmamış, yazılım paketi ve el istek üzerine) veya diğer görüntü analiz programları kullanın. </li><li> BioSpa kullanmak için, öncelikle BioSpa içine ayarlanmış bir görüntüyü içe. Sonra ikili görüntüleri yapmak için GFP ve Cy5 kanalları için uygun eşik seçmek. Analiz / Hesaplama menüsünde, Gelişmiş Analizi ve ardından Difüzyon Analizi seçin. Bir küme kenarını tanımlamak ve faiz (ROI) bölgesi gibi bir küme seçmek için poligon aracını kullanmak için GFP kanalı kullanın. </li><li> Çift difüzyon analizi gerçekleştirmek için seçilen biyofilm kümeyi tıklatın. Difüzyon analiz sonuçlarını kaydedin ve bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak Cy5 konsantrasyonuna Cy5 yoğunluğunu ayarlayın. <ol><li> Bir Cy5 conce üzerinde Cy5 yoğunluklarını ölçmek, Cy5 konsantrasyonu kalibrasyon eğrisi oluşturmak içinkonfokal mikroskopta ntration degrade. (Cy5 yoğunluğu ve konsantrasyonu doğrusal bir ilişki vardır.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Takip Floresan Parçacıklar tarafından Etraftaki Akış Field karakterize NOT: floresan mikro Flüoresan parçacıklar, biyofilm çevresinde akış alanı karakterize etmek için kullanılabilir. Biyofilm etrafında akış alanı parçacık izleme velosimetri yazılımını kullanarak parçacık pozisyonların zaman serisi gözlemlerinden hesaplanabilir. Burada gösterilen sonuçlar Akımlar 2.02 yazılım paketi 16 (yazılım indir ve mevcut kullanıcı kılavuzu ile elde edilmiştir <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> % 0.2&#39;lik bir nihai katı konsantrasyonu ve 0.5 ml nihai hacme kadar steril su içinde floresan, mikro (çap yaklaşık 1 um) seyreltin. Vortex mikroboncukları emin olmak içiniyi dağılmıştır. </li><li> Enjekte ve adımlar 3,3-3,5 arası prosedürleri aşağıdaki akış hücre içine seyreltilmiş floresan mikroboncukları teslim. Parçacık yolunun doğru izleme, (bu yazıda parçacık izleme sonuçları için 0.01 ml / saat) nispeten düşük akış hızını kullanmak izin vermek için. </li><li> Bir z-dilim partikül hareketi izlemek ve zaman serisi görüntüleri çekmek için modu XYT için konfokal ayarları geçin. (1 Hz A kare hızı, bu yazıda gösterilen temsilcisi sonuçları için kullanılmıştır.) Tekrar parçacık enjeksiyon ve görüntü farklı z yerlerde 3-D akış alanını oluşturmak için. </li><li> Ön işlem zaman serisi (mevcut yazılım indirme ve kılavuzu ImageJ kullanarak arka plan floresan sinyali (görüntü kümesinin ilk kazanılmış görüntüde sinyali) çıkarılarak konfokal görüntüleri <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) veya diğer programlar. </li><li> ImageJ, bir görüntü kümesinin ilk görüntüyü açmak ve ardından görüntü seti ithal. Süreci altında / Görüntü Calculator, görüntü kümesinden ilk görüntüyü çıkarma. Önceden işlenmiş görüntü kümesi kaydedin. </li><li> Akarsu 2.02 akış vektörleri, ithalat zaman serisi konfokal görüntüleri hesaplamak için. &quot;Açık süreç görüntüsü&quot; altında seçin ve &quot;parçacıkları tanımlamak&quot; yürütmek. Parçacıkları tanımlamak üzere uygun eşik kullanın. 1 um parçacıkları için minimum ve maksimum çapı eşik olarak 0.5 ile 5 um kullanın. </li><li> Ardından &quot;Aç süreç görünümü&quot; altında, seçmek ve parçacık yolları üretmek için &quot;PTV analiz boru hattı&quot; yürütmek. Onlar parçacık hareketi temsil görmek için parçacık yolları kontrol edin. Son olarak, seçmek ve bir akış vektör haritası oluşturmak için &quot;hız alanını oluşturma&quot; yürütmek. </li></ol>

<ol><li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).</li>
<li>Costerton, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms+in+Nature+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms in Nature and Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li>
<li>Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+microbial+biofilms+to+ecosystem+processes+in+stream+mesocosms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms.</a> Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+A+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li>
<li>Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hydrodynamics+and+nutrients+on+biofilm+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure.</a> J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear%3A+An+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).</li>
<li>Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+growth+conditions+on+biofilm+development+and+mass+transfer+at+the+bulk%2Fbiofilm+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface.</a> Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).</li>
<li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Convection+around+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%3A+The+Journal+of+Bioadhesion+and+Biofilm+Research%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Convection around biofilms.</a> Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).</li>
<li>Flemming, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorption+sites+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Sorption sites in biofilms.</a> Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).</li>
<li>Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Flow+in+Heterogeneous+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).</li>
<li>Schultz, M. P., Swain, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+biofilms+on+turbulent+boundary+layers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluid+Eng-T+Asme%22%5BJournal%5D)">The effect of biofilms on turbulent boundary layers.</a> J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).</li>
<li>Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Responses+to+Smooth+Flow+Fields+and+Chemical+Gradients+in+Novel+Microfluidic+Flow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).</li>
<li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li>
<li>Maxworthy, T., Nokes, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+gravity+currents+propagating+down+slopes.+Part+1.+The+release+of+a+fixed+volume+of+heavy+fluid+from+an+enclosed+lock+into+an+open+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel.</a> J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).</li>
<li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+experimental+measurements+of+effective+diffusive+permeabilities+and+effective+diffusion+coefficients+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).</li>
<li>Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironments+and+distribution+of+nitrifying+bacteria+in+a+membrane-bound+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm.</a> Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).</li>
<li>Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsensors+as+a+tool+to+determine+chemical+microgradients+and+bacterial+activity+in+wastewater+biofilms+and+flocs%5BTitle%5D)+AND+%22Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs.</a> Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).</li>
<li>Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Biofilm+Structures+on+Oxygen+Distribution+and+Mass-Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).</li>
<li>Liu, Y., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+role+of+hydrodynamic+shear+force+in+the+formation+of+biofilm+and+granular+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge.</a> Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Planar+Flow+Cell+for+Studies+of+Biofilm+Heterogeneity+and+Flow-Biofilm+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li>
<li>Tseng, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+protects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+limiting+the+penetration+of+tobramycin%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin.</a> Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).</li>
<li>Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Chlorine+Penetration+into+Biofilms+during+Disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection.</a> Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biyofilm kimyasal geçişlerini yanıt, çevredeki akış mikroçevre üzerinde biyofilm büyüme ve iç ulaşım sınırlamaları kaynaklanan biyofilm heterojenite etkileri: Biz üç önemli biyofilm-çevre etkileşimlerini karakterize etmek yöntemler paketi gösterdi. İlk biyofilm gelişimi için iyi tanımlanmış kimyasal gradyanı empoze etmek için yeni bir mikro-akışkan akış hücresinin kullanmıştır. Akış hücresi içinde, bir iyi tanımlanmış kimyasal gradyanı üretmek için, her iki girişleri için aynı akış oranının ...

Bir hücre dışı-polimer matrisi 1 içine hücre agrega - İman yüzeyler ve form biyofilm eklemek. Biyofilm hücre metabolizmasında 2,3 iç çözünen taşıma sınırlamaları ve mekansal varyasyonların bir arada kaynaklanan dramatik mekansal heterojenlik çünkü Biyofilmler, çok farklı bireysel mikrobiyal hücrelerin davranır. Oksijen ve besin konsantrasyonları önemli ölçüde biyofilm ve sıvı ve daha biyofilm 2 içinde tükenen çevreleyen arasındaki arayüzde azalır. Biyofilm solunum ve protein sentezinde Mekansal varyasyonları da lokalize oksijen ve besin durumu 2 yanıt olarak oluşabilir. Sucul ve toprak ortamlarında, çoğu bakteri biyofilmlerde yaşamak. Doğal biyofilm karbon ve azot bisiklet ve metaller 4,5 azaltarak gibi önemli biyokimyasal süreçlerini yürütmek. Klinik, biyofilm oluşumu tepk olduğunuUzun süreli akciğer ve üriner enfeksiyonlar 6 ible. Biyofilmlererde hücreler planktonik muadillerine göre 6 antibiyotiklere son derece yüksek direnç var çünkü biyofilm ilişkili enfeksiyonlar oldukça sorunludur. Biyofilm farklı ortamlarda önemli olduğundan, araştırma önemli bir miktarda biyofilm faaliyetleri ve biyofilm mekansal heterojenlik ve çevredeki mikroortam kontrol çevresel faktörleri anlamaya odaklanmıştır. Önceki çalışmalar, biyofilm geliştirme; çevresel bir dizi faktöre göre düzenlenir olduğunu bulduk: biyofilm çeşitli akış koşullarında farklı morfolojiler geliştirilmesi; oksijen ve besin kullanılabilirliği etkisi biyofilm morfolojisi; ve hidrodinamik kayma gerilmesi yüzeylere planktonik hücreler eki ve biyofilm 7-9 hücrelerinin ayrılmasını etkiler. Ayrıca, dış akış durumu yüzeyler int teslim etkilero ve biyofilm 10 içinde. biyofilm büyüme de fiziksel ve kimyasal koşulları çevredeki değiştirir. Örneğin, biyofilm büyüme oksijen ve besin 2 yerel tükenmesine yol açar; biyofilm çevresini 11 inorganik ve organik bileşikler birikir; ve biyofilm kümeleri akış ve artış yüzey sürtünmesi 12,13 yönlendirir. Biyofilm onların çok karmaşık yollarla çevreyi saran etkileşim nedeniyle, aynı anda biyofilm özellikleri ve çevre koşulları hakkında bilgi edinmek için kritik ve çok disiplinli yaklaşımlar kapsamlı biyofilm-çevre etkileşimlerini karakterize etmek için kullanılması gerekmektedir. Burada bir uygulanan besin derecesinde mono- türler ve ikili türler biyofilm içindeki mikrobik büyüme uzamsal desen karakterize etmek ve yerel kimyasal ve sıvı mikro-elde edilen modifikasyon gözlemlemek için entegre yöntem bir dizi sunulmuştur. Biz köknarst iyi tanımlanmış kimyasal geçişlerini altında biyofilm büyüme gözlemlemek için bir süre önce geliştirilen çift giriş mikroakışkan akış hücresinin kullanımını tarif. Daha sonra beslenme koşulları kümesi altında biyofilm bakteri, Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia coli, iki türün gelişimini izlemek için bu mikro-akışkan akış hücresinin kullanımını göstermektedir. Biz biyofilm koloniler halinde floresan izleyici yayılma yerinde görselleştirme nicel Biyofilmlererde çözünen ulaşım modellerini değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Son olarak, biz konfokal mikroskobu altında yapılan mikro parçacık izleme velosimetri, büyüyen biyofilm etrafında yerel akış alanını elde etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Peristaltik Pompa</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>Pompa Borusu 0.50&nbsp; mm OVC, Turuncu / Sarı</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>Üç Musluk w / Döner Erkek Luer kilit</td><td>Smiths Medical&nbsp;</td><td>MX9311L</td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>Güneş Panelleri Yapmak için Sylgard 184 Güneş Pili Kapsülleme</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>Pyrex Orta Şişe, 1 &nbsp; L, GL45</td><td>VWR</td><td>16157-191</td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>C-FLEX Boru</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>1 ml TB Şırınga</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>Polimer Boru</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>Steril Intramedic Luer Saplama Adaptörü Kil</td><td>Adams</td><td>427564</td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>PrecisionGlide İğne</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>HACH</td><td></td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>Şırınga filtreleri - steril (0.2 & mu; m)</td> <td>Fisherbrand</td><td>09-719A</td><td>Akış hücresi kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>MAXQ Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Flow hücre kurulumu ve aşılama</td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik susuz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Monobazik potasyum fosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Kalsiyum sülfat dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Demir(II) sülfat heptahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Manganez (II) sülfat monohidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Bakır (II) sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Çinko sülfat heptahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Kobalt (II) sülfat heptahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Sodyum molibdat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Luria Bertani Et suyu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>TCS SP2 Konfokal Mikroskopi</td><td>Leica</td><td></td><td>Floresan görüntüleme</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>S11344</td><td>Floresan görüntüleme</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>PA15100</td><td>Floresan görüntüleme</td></tr><tr><td>Kırmızı Floresan (580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>Floresan görüntüleme</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>Görüntü İşleme</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Görüntü İşleme</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Görüntü İşleme</td></tr><tr><td>Akışları 2.02</td><td>Cantebury</td><td></td> Üniversitesi <td>Görüntü İşleme</td></tr></tbody></table>

biyofilm ve habitat heterojen eş-geliştirme karakterize yöntemleri

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biyofilmler kompleks yapılara sahip ve önemli mekansal farklılıklarını üreten yüzey bağlı mikrobiyal topluluklar vardır. Biyofilm geliştirme güçlü çevredeki akışı ve besin ortamında düzenlenir. Biyofilm büyüme de karmaşık akış alanları ve çözünen taşıma modellerini üreterek yerel mikroçevresinin heterojenliğini artırır. Biyofilm ve yerel mikro-yaşam arasındaki Biyofilmlererde ve etkileşim içinde heterojenite gelişimini araştırmak için, biz Pseudomonas aeruginosa mono-tür biyofilm ve P. çift türler biyofilm büyüdü mikroakışkan akış hücresi beslenme geçişlerini altında aeruginosa ve Escherichia coli. Bu akış hücresi içinde besin gradyanları oluşturmak için büyüyen ve bu koşullar altında biyofilm geliştirme görselleştirmek için ayrıntılı protokolleri sağlar. Biz aynı zamanda optik yöntemler bir dizi için mevcut protokoller distri akış, biyofilm yapısı mekansal desen ölçmek içinrı payı etrafında biyofilm ve kitle ulaşım üzerinde ve biyofilm koloniler içinde. Bu yöntemler biyofilm ve habitat heterojenite eş-geliştirme kapsamlı araştırmalar destekler.

çift ​​giriş mikro-akışkan akış hücresi akış bölme içinde iki çözeltinin karıştırılması ile oluşturulan bir iyi tanımlanmış kimyasal derecesinde biyofilm büyüme gözlenmesini sağlar. Elde edilen kimyasal degrade eski boya enjeksiyonu ile gözlenen ve Şarkı ark. 14 tarafından ayrıntılı olarak karakterize edildi. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, pürüzsüz değişim ölçüleri, enine yönde oluşturulmuştur. Konsantrasyon profili girişin yanındaki dik nedeniyle difüzyon (Şekil 1)</stro...

Biyofilmlerin çevreleriyle karmaşık etkileşimleri vardır. Biyofilm-çevre etkileşimlerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, burada biyofilm gelişimi için heterojen kimyasal ortam oluşturmak, yerel akış hızını ölçmek ve biyofilm kolonileri içinde ve çevresinde kütle taşınmasını analiz etmek için bir dizi yöntem sunuyoruz.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Bu prosedürün genel amacı, entegre yöntemler kullanarak biyofilm etkileşimlerini çevreleyen ortamla birlikte karakterize etmektir. Glukoz içeren ve glukoz içermeyen ortamların bir akış hücresi boyunca pompalandığı ve böylece bir glukoz gradyanı oluşturulduğu çift girişli bir mikroakışkan akış hücresi sistemi kurulur. Sisteme bakteriler eklenir ve biyofilmlerin birkaç gün boyunca gelişmesine izin verilir.Ardından, çözünen madde taşınımını karakterize etmek için biyofilmler 3D konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Biyofilmler içinde, akış sistemine floresan izleyiciler enjekte edilir ve biyofilm kolonilerinin etrafındaki akış alanını karakterize etmek için zaman ayarlı görüntüleme yapılır; floresan mikroboncuklar enjekte edilir ve zaman ayarlı görüntüleme gerçekleştirilir. Elde edilen verilerin çözünen madde taşınımı ve partikül izleme analizleri, bu yöntemin tek bir cihazda ve tek bir deney setinde, çeşitli kimyasal ortamlar altındaki biyofilm süreçlerini değerlendirmedeki faydasını ortaya koymaktadır.Bu yöntemlerin temel avantajı, biyofilm çevre etkileşimlerinin birden fazla yönünün eş zamanlı olarak değerlendirilmesine olanak tanımalarıdır. Burada rapor edilen yöntemler, doğal ort

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz biyofilm oluşumunu araştırmak için basit, yarı-nicel yöntem...

Buruşuk Koloni Gelişimi kullanarak Biyofilm Oluşumu değerlendirin Bir Yarı-kantitatif Yaklaşım

Kaynak: Miquel Guennoc, C. ve diğerleri. Filamentli mantar kolonilerinde bakteriyel biyofilmlerin konfokal ve elektron mikroskopisi kullanılarak niteliksel çok ölçekli analizi için yeni yöntem. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, koloni oluşumunu ve radyal büyümeyi desteklemek için işlenmiş selofan zarlarında mantar kültürünün hazırlanmasını göstermektedir. Daha sonra toprak bakteri hücrelerinin etkileşim testleri için yetiştirilip hazırlanması gösterilir. Son olarak, bakteriyel hücrelerin mantar...

Biyofilm oluşumu için mantar-bakteriyel ortak kültür oluşturmak

Biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı niceliği ve karşılaştırılması için bir protokol sunulmuştur. Metodoloji, konfokal lazer tarama mikroskobu, biyofilm yapısal analiz ve görselleştirme yazılımı ve istatistiksel analiz yazılımının kullanımını içerir.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Bu yöntemler kağıt amacı tipik insan Mikrobiyal dental plak tespit türler içeren çok tür biyofilm gelişmesi için mikroakışkan sisteminin kullanımını tarif etmektir. Yöntem biyofilm mimarisi, biyofilm canlılığı ve vurgulanır kültür-bağımlı veya kültür-bağımsız analizler için hasat biyofilm bir yaklaşım açıklamak için.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

evrim senaryolarda çeşitler (mekansal ayrışmanın) rolü mekansal dağılımı ayarı kontrollü izin laboratuvarda basit mikrobik sistemler kullanılarak incelenebilir. Kurucu hücre yoğunluğu değiştirerek, çeşitli çeşitler seviyeleri, Bacillus subtilis, koloni biyofilm floresan etiketli bakteriyel suşlar kullanılarak görüntülenebilir.

Yüzey koloniler Mikrobiyal Populasyonlarında Mekansal Ayrışma İzleme

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Akış Sitometresi görsel kümeleme ile birlikte su biyofilmler çalışmak için kullanımı kolay ve hızlı bir yöntem sunar. Biyofilm karakterizasyonu, biyofilm toplum yapısındaki değişikliklerin tespiti ve biyofilm içinde gömülü abiyotik parçacıklar tespiti için kullanılabilir.

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Mikrobiyal biyofilmler interfazlarda karmaşık mimariler oluşturur ve yüksek ölçekli-bağımlı uzamsal desenler halinde gelişirler. Burada, 3D optik koherens tomografisi (OCT) veri kümelerinin otomatik olarak edinimi için deneysel bir sistem (sert ve yazılım) sıyoruz. Bu araç seti, uzay ve zamanda biyofilm morfogenezinin non-invaziv ve çok ölçekli karakterizasyonuna olanak sağlar.

Büyük Uzamsal Ölçekler Üzerinde Biyofilm Morfogenezini Açıklamak için Otomatik 3D Optik Koherens Tomografisi

Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanılabilir.

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Çeşitli rizosfer topraklarından sinerjik çok türlü biyofilm toplulukları oluşturmak için hızlı ve standartlaştırılmış bir prosedür burada sunulmaktadır. Karmaşık rizosfer toprak mikrobiyotasını araştırmak ve simüle etmek için tasarlanmış benzersiz bir protokoldür.

Rizosfer Toprağından Çok Türlü Biyofilm Toplulukları Oluşturmaya Yönelik Bir Yaklaşım

Keşfedin biyofilm-çevre etkileşimlerini mikroakışkan hücre sistemi ve 3D konfokal mikroskopi kullanarak. Bu yöntem, kimyasal gradyanlar altında biyofilm gelişimini ve kütle taşımını incelemek için araştırmacılara kapsamlı bir yaklaşım sunar.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Daha fazla video keşfet