Name: İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, iç pozitif kontrol kullanarak kantitatif RPA ile DNA konsantrasyonunu nasıl ölçeceğinizi. Bu izotermal yöntem, pahalı termal sikler gerektirmeden HIV gibi hedef DNA'ları hızla nicelendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Küresel Sağlık Girişimi Grand Zorluklar ile Bill &amp; Melinda Gates Vakfı hibe ile finanse edildi.

<ol><li>Yoon, J. -Y., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-Chip+Pathogen+Sensors+for+Food+Safety%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety.</a> Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).</li>
<li>Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+parvum+and+Cyclospora+cayetanensis%3A+A+review+of+laboratory+methods+for+detection+of+these+waterborne+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).</li>
<li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li>
<li>Asiello, P. J., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+isothermal+nucleic+acid+amplification%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review.</a> Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).</li>
<li>Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+detection+using+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA detection using recombination proteins.</a> PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).</li>
<li>Krõlov, K., Frolova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+Rapid+Detection+of+Chlamydia+trachomatis+by+Recombinase+Polymerase+Amplification+Directly+from+Urine+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics+JMD%22%5BJournal%5D)">Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples.</a> The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).</li>
<li>Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay+as+a+DNA+amplification-detection+strategy+for+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis.</a> Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).</li>
<li>Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Plasmodium+falciparum+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+and+lateral+flow+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis.</a> Malaria Journal. 13 (1), 99(2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+test+to+diagnose+cryptosporidiosis%3A+lab+assessment+in+animal+and+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).</li>
<li>Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper+and+plastic+device+for+performing+recombinase+polymerase+amplification+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 3082(2012).</li>
<li>Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aptamer-based+bio-barcode+assay+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+for+cytochrome-c+detection+and+anti-cancer+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening.</a> Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).</li>
<li>Euler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+recombinase+polymerase+amplification+assays+for+detection+of+biothreat+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).</li>
<li>Abd El Wahed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+reverse+transcription+recombinase+polymerase+amplification+assay+for+rapid+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus.</a> PloS One. 8 (8), e71642(2013).</li>
<li>Escadafal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Molecular+Assays+for+the+Detection+of+Yellow+Fever+Virus+in+Low-Resource+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730(2014).</li>
<li>Hutson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T.+gondii+RP+Promoters+%26+Knockdown+Reveal+Molecular+Pathways+Associated+with+Proliferation+and+Cell-Cycle+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest.</a> PLoS ONE. 5 (11), 15(2010).</li>
<li>Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+detection+of+artificial+replication-competent+lentivirus+of+altered+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).</li>
<li>DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html</a> (2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+HIV-1+DNA+using+Real-Time+Recombinase+Polymerase+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).</li>
<li>Sollis, K. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+the+performance+of+HIV+viral+load+technologies+on+plasma+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples.</a> PloS one. 9 (2), e85869(2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+use+of+antiretroviral+agents+in+HIV-1-infected+adults+and+adolescents%22">Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents</a>. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

İstendiğinde MATLAB algoritması kullanarak anlamlı ölçüm verileri elde etmek için, kullanıcı uygun giriş değerlerini seçmeniz gerekir. Bölüm 5 ve 6 her komut başlatılması sonra, tüm giriş değişkenleri otomatik olarak komut penceresinde İstenen ve çıkışlar otomatik olarak oluşturulur. Bölüm 5.7 kullanıcı bir yamaç eşiğini seçmesi istenir. yamaç eşik değeri uyum korelasyon katsayısı (r 2) karesini etkiler. Bir termal döngü ihraç ham floresan verileri kullanırken, 2.0 ve 5.0 arasındaki değerler yüksek r 2</...

Kantitatif nükleik asit amplifikasyon çevre, gıda kaynaklı ve su patojenlere tespiti için hem de klinik teşhis için önemli bir tekniktir. Gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), HİV-1 virüs yük testi, bakteriyel patojenlerin saptanması, ve bir çok diğer organizmalar 1 taranması için, örneğin nükleik asitlerin, duyarlı, spesifik, ve nicel tespiti için altın standart yöntemdir - 3. Gerçek zamanlı qPCR sırasında primerler döngülerinde patojen DNA&#39;yı çoğaltmak ve bir flüoresan sinyal her bir döngüde numunede büyütülmüş DNA miktarı ile orantılı olduğundan oluşturulur. Patojen DNA&#39;ya ait, bilinmeyen bir konsantrasyonunu ihtiva eden bir numune standart örneklerinin ilk DNA konsantrasyonuna ve flüoresan sinyal belirli bir eşiğe ulaştığı zaman (yani, çevrim eşiği, veya C, T) ile ilgilidir, bir standart eğri kullanılarak ölçülebilir. <p class=Gerçek zamanlı qPCR bu rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (ECP) olarak sonuçlar, alternatif izotermal amplifikasyon teknikleri almak için pahalı termal döngü cihaz ve birkaç saat gerektirirken, çünkü &quot;jove_content&quot;&gt; 4 geliştirilmiştir. Bu platformlar genellikle daha hızlı sonuç sağlar ve daha az pahalı, basit ekipmanla gerçekleştirilebilir bir alt, bir sıcaklık, bir nükleik asitleri amplifiye. Nokta-bakım uygulamaları için özellikle çekici dakika içinde DNA güçlendirir RPA, düşük büyütme sıcaklığı (37 ° C) gerektirir, ve kirliliklerin 5,6 varlığında aktif kalır. 12 - RPA tahlilleri biothreat maddeler 7&#39;nin gıda maddesi analizi, patojenin tespit edilmesi, kanser ilaç tarama ve saptama da dahil olmak üzere, geniş bir uygulama yelpazesi için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, nükleik asitlerin ölçümü için RPA kullanımı 13,14 sınırlıdır. Bir önceki çalışmada, bu sho olduwn gerçek-zamanlı kantitatif RPA (qRPA) 15 mümkündür. Burada daha ayrıntılı bir protokol bir standart eğri, QPCR kullanılarak miktar tayini için benzer bir yöntemi kullanarak bilinmeyen örnekleri ölçmek için gerçek zamanlı kantitatif RPA ile sağlanır. Bu protokol düzgün çalışıp sistemi sağlamak için bir iç pozitif kontrol (IPC) geliştirmek için nasıl yanı sıra, bir proof-of-concept olarak, HIV-1 DNA tespiti için termal döngü bir RPA reaksiyonu gerçekleştirmek açıklamaktadır. Eğitim verileri kullanarak standart bir eğri oluşturmak için bir termal döngü veya mikroskop ve veri analizi kullanılarak veri toplama da ayrıntılı. Son olarak, özel bir komut dosyası ile standart eğri kullanılarak bilinmeyen örnekleri ölçülmesi için bir yöntem gösterilmiştir. Bu qRPA tekniği bilinmeyen konsantrasyonları ile numunelerin miktarının sağlayan ve geleneksel gerçek zamanlı qPCR üzerinden pek çok avantajı vardır.

<table><tbody><tr><td>qRPA Tahlili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 ileri primer</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel DNA oligoları</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 ters primer</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel DNA oligoları</td><td>5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 sondası</td><td>BioSearch Teknolojileri&nbsp;</td><td>özel DNA oligoları</td><td>5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3' &nbsp;</td></tr><tr><td>IPC probu</td><td>BioSearch Teknolojileri&nbsp;</td><td>özel DNA oligoları</td><td>5'-AGG ETİKETİ TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'</td></tr><tr><td>RPA exo reaktifleri (peletler, rehidrasyon tamponu, magnezyum asetat</td><td>TwistDx</td><td>TwistAmp exo</td><td></td></tr><tr><td>PCR tüp şeritleri</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td> PCR düz kapaklı tüp şeritleri BioRad TCS0803 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro sızdırmaz yapıştırıcı</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 hedefi (pHIV-IRES- eYFP&Delta; Env ve Delta; Vip & Delta; Vpr)</td><td></td><td></td><td>özel plazmid, bakınız: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Değişmiş konak aralığının yapay replikasyona yetkin lentivirüsünün karakterizasyonu ve tespiti. Moleküler Terapi 8, 118&ndash; 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>İnsan erkek genomik DNA</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu soğuk blok</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponu 1.0 M, pH 8.0</td><td>EMD Kırlangıç</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>IPC Geliştirme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryptosporidium parvum IPC şablonu</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>Kullanıcı C. parvum (bir BSL-2 bulaşıcı ajan) ile çalışmak için donatılmamışsa, IDT'den çift sarmallı bir sentetik hedef sipariş etmek de mümkündür. C. parvum için PCR ve RPA primerleri, GenBank erişim numarası AF115377.1 kullanılarak tasarlanmıştır</td></tr>, <tr><td>PCR uzun ileri primer</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td>, <td>özel DNA oligoları,</td><td>5'-TGG, CAG TAT, TCA TTC, ACA ATT, TTA AAA, GAA, AAG G/ ATC, TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'</td></tr><tr><td>PCR uzun ters primer</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel DNA oligoları</td><td>5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'</td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X tampon</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Deneyleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dik floresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>Sahne ısıtıcısı Biyobilim</td><td>Araçları</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>1 Kanallı Hassas Yüksek Kararlılık Sıcaklık Kontrol Cihazı Biyobilim</td><td>Araçları</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM/GFP filtre küpü</td><td>Zeiss</td><td>filtre seti 38 (000000-1031-346)</td><td>uyarma BP 470/40 nm, emisyon BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>HEX filtre küpü</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>uyarma BP 530/30 nm, emisyon BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>Lazer kesici</td><td>Oymacı Ağı</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8" siyah akrilik</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm şeffaf akrilik</td><td>McMaster Carr</td><td>PD-72268940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Süper yapıştırıcı</td><td>Ofis Deposu</td><td>Duro süper yapıştırıcı&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PCR sınıfı mineral yağ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Veri Analizi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB komut dosyası: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"</td><td>SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB komut dosyasına dahildir: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"</td><td>SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB komut dosyasına dahil olanlar: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"</td><td>SI'ya</td><td></td><td></td>dahildir</tr><tr><td>Adobe</td> Illustrator <td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai'ye</td><td>dahildir SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision yazılımına</td> dahildir <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>SI'ya</td><td></td><td></td> dahildir</tr></tbody></table>

İç pozitif kontrol ile kantitatif recombinase polimeraz amplifikasyon testi geliştirme

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Yakın zamanda, patojen tespiti için bir izotermal amplifikasyon platformu olan rekombinaz polimeraz amplifikasyonunun (RPA), standart bir eğri kullanarak DNA numune konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabileceği gösterilmiştir. Bu yazıda, gerçek zamanlı kantitatif rekombinaz polimeraz amplifikasyon testinin (qRPA testi) geliştirilmesi ve uygulanması için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Örnek olarak HIV-1 DNA kantifikasyonu kullanılarak, gerçek zamanlı RPA reaksiyonlarının montajı, dahili bir pozitif kontrol (IPC) dizisinin tasarımı ve IPC'nin ve ilgilenilen hedefin birlikte amplifikasyonu açıklanmaktadır. Bilinmeyen numunelerin konsantrasyonunu tahmin etmek veya testin performansını değerlendirmek için kullanılabilecek birden fazla deneyden elde edilen verileri kullanarak standart bir eğrinin oluşturulması için talimatlar ve veri işleme komut dosyaları sağlanmıştır. Son olarak, bir bakım noktası qRPA testi geliştirmeye yönelik bir adım olarak bir mikroskop ve bir sahne ısıtıcısı ile gerçek zamanlı floresan verilerinin toplanması için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır. Sağlanan protokol ve komut dosyaları, ilgilenilen herhangi bir DNA hedefi için bir qRPA testinin geliştirilmesi için kullanılabilir.

Hedefle qRPA deneylerde IPC olarak hizmet etmek üzere bir dizi seçmeden önce (HIV-1), DNA, dahili pozitif kontrol (IPC) adayları yukarıda anlatıldığı ve HIV-1 DNA mevcut olmadan qRPA reaksiyonlarda amplifiye etme kabiliyetleri açısından tarandı. IPC aday hedef (HİV-1) üzerinden rekabet eden HIV-1 amplikon oluşumunu IPC oluşumunu önlemek için, DNA daha uzundur. Şekil 2A, iki C nesil gösterildiği gibi Parvum IPC aday jel elektroforezi kullanılarak 415 ve 435 bp&#39;lik bantların mevcudiy...

Sağlanan, bir termal döngüleyici veya bir mikroskop ve sahne ısıtıcısı kullanarak DNA örneklerinin ilk konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı bir rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesi de açıklanmaktadır. Ham gerçek zamanlı floresan verilerinin işlenmesi için komut dosyaları sağlanmıştır.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bilinmeyen örneklerin DNA konsantrasyonunu belirlemek için kantitatif rekombinaz polimeraz basitleştirmesi yöntemini kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle reaksiyona hedef DNA internal pozitif kontrolü, DNA primerleri ve floresan işaretli probların eklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, reaksiyonlar, enzimleri aktive etmek için reaksiyonları ısıtan ve hedef ile kontrol amplikonlarının oluşumunu tespit etmek için probların floresansını izleyen real-time PCR cihazına yerleştirilir.Ardından, standart eğriyi oluşturmak ve deneyi doğrulamak için bir betik kullanılarak floresan verileri analiz edilir. Sonuçlar, bir HIV-1 hedef DNA'sını nicelleştirmek için kullanılan doğrulama deneylerine dayanarak, DNA örneklerinin doğru konsantrasyonun bir büyüklük mertebesi dahilinde hassas bir şekilde nicelleştirilebildiğini göstermektedir. Bu tekniğin gerçek zamanlı kantitatif PCR gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, RPA'nın izotermal olmasıdır, dolayısıyla pahalı bir termal döngüleyiciye ihtiyaç duyulmaz.RPA ayrıca daha düşük bir amplifikasyon sıcaklığı gerektirir, kirli örneklere karşı toleranslıdır, hedefi dakikalar içinde tespit edilebilir seviyelere amplifiye eder ve oda sıcaklığında kolay taşıma ve saklama imkanı tanıyan liyofilize enzimler kullanır. Başlamak için, temiz bir amplifikasyon öncesi çalışma alanı oluşturmak amacıyla tüm tezgah üstü ve ekipman yüzeylerini %50'lik çamaşır suyu çözeltisi ile temizleyin; 280 mM magnezyum asetat çözeltisini, rehidrasyon tamponunu ve reaksiyon peletlerini -20 °C dondurucudan çıkarın ve çözeltileri oda sıcaklığında çözdürün. Ardından, 383,5 µL rehidrasyon tamponunu yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak, tampona 41,6 µL nükleaz içermeyen su ekleyip karıştırmak için vorteksleyerek ve ayrı bir tüpe 35 µL magnezyum asetat ekleyerek bir master mix hazırlayın.Rehidrasyon tamponu stok çözeltileri içindeki magnezyum asetatı dondurucuya geri koyun. Ardından, primer ve prob stoklarını dört santigrat derece Celsius buzdolabından alın. Bunları ön amplifikasyon çalışma alanına yerleştirin ve ışığa maruziyeti en aza indirmek için ışıkları kapatın; her birinden 10 mikromolar ileri ve geri primerlerden 27,3 mikrolitre master mikse ekleyin.Ardından, master karışıma 7,8 µL 10 µM hex etiketli HIV 1D NA Probe ekleyin ve tüpü vorteksleyin. Daha sonra primer ve prob stok çözeltilerini saklama alanına geri götürün; QRPA reaksiyonlarını kurmak için metin protokolünde belirtildiği üzere, dahili pozitif kontrol için gereken reajanlar burada eklenebilir. İlk olarak, dondurularak kurutulmuş enzim peletlerini iki adet düşük profilli sekizli PCR tüp şeridindeki ayrı tüplere yerleştirin; pelet içeren bir tüpe 37,5 µL master karışım pipetleyin.Hava kabarcığı oluşturmadan peleti çözmek için tüpün içeriğini pipet ucuyla nazikçe karıştırın. Hacim kaybını önlemek için ucu reaksiyondan dikkatlice çıkarın ve her tüp arasında pipet uçlarını değiştirdiğinizden emin olun. Master mix'in soğuması için tüpleri en az beş dakika boyunca soğutulmuş 96 kuyucuklu soğutma bloğuna yerleştirin.Bu sırada, termal döngüleyici yazılımına protokolü yükleyin; plaka düzeni metin protokolünde belirtilmiştir. Ardından, PCR tüplerinden biraz daha geniş olacak şekilde iki şerit şeffaf plastik mikro mühür yapıştırıcısı kesin. Ayrıca iki adet düz PCR tüp şeridi kapağı temin edin ve HIV-1 plazmid şablonunu metin protokolünde belirtildiği şekilde alikotlayın.Ardından, uygun PCR tüpüne 10 µL kalıp DNA ekleyin. Karışımı pipet ucuyla tekrar nazikçe karıştırın. Sonra, her tüp kapağına 2,5 µL magnezyum asetat ekleyin ve ardından kapakları, tamamen mühürlenmeyecek şekilde reaksiyon tüplerinin üzerine nazikçe yerleştirin.Magnezyum asetat kapak arasından net bir şekilde görülmelidir. Sıvının tamamını tüpün tabanında toplamak ve varsa hava kabarcıklarını gidermek için PCR tüp şeritlerini bir mikro santrifüje yerleştirin ve tüpleri 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Magnezyum asetat çözeltisinin master mix ile birleştirilmesi QRPA reaksiyonunu başlatır.Reaksiyonu durdurmak için PCR tüplerini hızlıca soğutma bloğuna alın. Ardından, reaksiyonların kontamine olmasını önlemek için kapakları yavaşça açın ve tüpleri şeffaf mikro mühürleme filmi ile kapatın. Tüpleri, plaka düzenindeki konumlarına göre termal döngüleyiciye aktarın.Termal döngüleyicinin kapağını kapatın ve çalıştırmayı başlat (start run) düğmesine tıklayın. Çalışma sona erdiğinde deney için bir dosya adı belirlediğinizden emin olun. Ham floresans verilerini görüntüleyin ve bu verileri, kantitatif amplifikasyon sonuçları (quantification amplification results) adlı bir dosya oluşturacak şekilde bir hesap tabloya aktarın.Standart eğriyi oluşturmak için; öncelikle standart eğri betiğini indirin, ardından MATLAB veya benzeri bir veri analiz programını açın. Betiği açın ve çalıştırmak için run düğmesine basın.İstendiğinde analiz edilecek veri dosyalarının sayısını girin. Ardından, her bir eğitim dosyasındaki örnek sayısını ve tekrarların sayısını komut penceresine yazın.Standart eğrinin oluşturulmasında kullanılan, 10 tabanlı log cinsinden en düşük DNA konsantrasyonunu girin ve enter tuşuna basın. Buradaki örnekte, en düşük konsantrasyon 10 tabanlı log cinsinden bir kopyadır.Ardından, her bir DNA standardı arasındaki konsantrasyon farkını komut istemine yazın ve buradaki enter tuşuna basın. Konsantrasyon aralığı, 10 tabanlı bir log kopya düzeyindedir. Daha sonra, eğim eşiği değerini komut penceresine girin ve enter tuşuna basın.Bu değer genellikle üç ile beş arasındadır. Pozitif eşik için, Z olarak da bilinen, arka planın üzerindeki standart sapma sayısını girin ve ardından enter tuşuna basın; tipik Z değerleri bir ile beş arasında değişir. Ardından, bu durumda verileri toplamak için kullanılan ekipmanı belirtin.Termal döngüleyici için bir yazın ve ardından enter tuşuna basın. Eğer dahili bir pozitif kontrol varsa, yeni bir eşik değerine ihtiyaç duyulup duyulmadığına bağlı olarak Y veya N yazarak eşik için varsayılan değeri veya yeni bir değeri seçin. Son olarak, standart eğrisini oluşturmak için kullanılacak tüm hesap tablosu dosyalarını seçin.Ardından betik, tüm verileri otomatik olarak içe aktaracak ve analiz edecektir. Farklı HIV 1D NA kopya sayıları içeren mükerrer örnekler üzerinde gerçek zamanlı QRPA gerçekleştirilmiştir. Floresan artışıyla belirtilen saptanabilir amplifikasyon başlangıcı, yüksek DNA kopya sayılarına sahip örneklerde, düşük kopya sayılarına sahip örneklerden daha erken gerçekleşir. Ham floresan verileri, bilinen konsantrasyonlardaki HIV 1D NA amplifikasyonundan bir standart eğri oluşturmak için kullanılmıştır. Bu veriler eksponansiyel bir eğriye uydurulmuş olup, R kare değeri yüksek bir uyum iyiliğine işaret etmektedir.Standart eğri, konsantrasyonu bilinen ek DNA örneklerinin konsantrasyonlarını tahmin etmek için kullanılmıştır. Z değerinin bire ayarlanması, düşük DNA konsantrasyonlarının doğru şekilde tahmin edilmesine olanak tanır. Buna karşılık, yüksek DNA konsantrasyonları beşlik bir Z değeri ile daha iyi tahmin edilir.Bu prosedür uygulanırken, RPA'nın DNA amplifikasyon hızını sınırlayacak gerçek döngülere sahip olmadığını hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, amplifikasyon hızı hassas bir şekilde kontrol edilmelidir. Deneyler arasında tutarlılık kritik öneme sahiptir, bu yüzden tüm deneyler için aynı primer alikotlarını kullandığınızdan emin olun.Reaksiyon bileşenlerini ısıdan ve ışıktan koruyun. Magnezyum asetatı veri toplama işlemi başlamadan hemen önce ekleyin ve reaksiyonları başlangıca kadar soğutma bloğunda tutun. Deney.

development-quantitative-recombinase-polymerase-amplification-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

43 kadar moleküler hedeflere eş zamanlı olarak algılanması için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi açıklanmıştır. MPCR / RLB Uygulamaları mikrobiyal yazarak ve klinik örneklerde birden fazla patojenlerin tespiti içerir.

Multiplex PCR ve Reverse Line Blot Hibridizasyon Testi (mPCR / RLB)

Bu çalışma, MST araçları olarak önerilen insan / / sığır domuz DNA virüsleri, adenovirüs ve polyomaviruses, belirli bir miktar tayini için qPCR kullanarak suda nitrat dışkı / idrar kirlenme veya kontaminasyon kaynağının belirlenmesi için maliyet-etkin bir yöntem açıklanır.

Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi

Bu videoda, iki farklı genetik belirteci aynı anda tespit etmede yararlı olan geleneksel PCR tekniğinin bir modifikasyonu olan çift yönlü dijital PCR (ddPCR) tekniğini gösteriyoruz. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız olarak amplifiye edilen nanolitre boyutunda emülsifiye edilmiş damlacıklara bölünür ve hedef dizilerin başlangıç konsantrasyonunu hesaplamak için damlacıkların fraksiyonundan farklı renkli floresan amplifikasyon sinyallerinin tespiti kullanılır.

Çift genetik belirteçlerin eş zamanlı olarak ölçülmesi için dubleks dijital PCR

Burada, T hücresi reseptör eksizyon çemberlerinin (TREC'ler) ve K-silme rekombinasyon eksizyon çemberlerinin (KREC'ler) eşzamanlı niceliklemesi için bir yöntem açıklıyoruz. TREC/KREC testi, timik ve kemik iliği çıkışının belirteci olarak kullanılabilir.

T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

Burada, at solunum sıvılarında EHV-2 DNA'sının tespiti ve miktarının belirlenmesi için kullanılan kantitatif bir PCR yönteminin geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz. EHV-2 qRT-PCR doğrulama protokolü üç bölümden oluşan bir prosedür içerir: geliştirme, tek başına qRT-PCR testinin karakterizasyonu ve tüm analitik yöntemin karakterizasyonu.

Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Çevresel DNA tahlilleri, alan verilerinin toplanmasına başlamadan önce titiz bir tasarım, test, optimizasyon ve doğrulama gerektirir. Burada, çevresel örneklerden hedef tür DNA'sının tespiti ve nicelleştirilmesi için türe özgü, prob tabanlı bir qPCR testi tasarlamanın her adımında kullanıcıları götürecek bir protokol sunuyoruz.

ÇevreSEL DNA Uygulamaları için Türlere Özgü Nicel PCR Testlerinin Geliştirilmesi ve Testi

Gerçek zamanlı, nicel izotermal nükleik asit amplifikasyonu gerçekleştirmek için birçok düşük maliyetli ısıtıcı ile uyumlu açık kaynaklı, modüler bir florometre oluşturmak için ayrıntılı talimatlar sağlanmıştır.

Kaynak Sınırlı Ortamlarda Gerçek Zamanlı İzotermal Nükleik Asit Amplifikasyon Reaksiyonlarını İzlemek için Açık Kaynaklı Minyatür Florometre

D-döngü yakalama (DLC) ve D-döngü uzatma (DLE) testleri, Saccharomyces cerevisiae'de indüklenebilir çift sarmallı bir kırılma yerinde D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve ürün oluşumunu ölçmek için kantitatif PCR ile birlikte yakınlık ligasyonu prensibini kullanır.

Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

Acinetobacter baumannii'nin hızlı ve hassas tespitini kolaylaştırmak için, A. baumannii enfeksiyonlarını tanımlamak için LbaCas12a endonükleaz ile birlikte Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu (RPA) kullanan bir protokol sunuyoruz.

Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu/Cas12a tabanlı bir sistem kullanılarak Acinetobacter baumannii enfeksiyonlarının hızlı ve spesifik tespiti

Öğrenin, iç pozitif kontrol kullanarak kantitatif RPA ile DNA konsantrasyonunu nasıl ölçeceğinizi. Bu izotermal yöntem, pahalı termal sikler gerektirmeden HIV gibi hedef DNA'ları hızla nicelendirir.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

Daha fazla video keşfet