İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme
March 30th, 2015
Sağlanan, bir termal döngüleyici veya bir mikroskop ve sahne ısıtıcısı kullanarak DNA örneklerinin ilk konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı bir rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesi de açıklanmaktadır. Ham gerçek zamanlı floresan verilerinin işlenmesi için komut dosyaları sağlanmıştır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, bilinmeyen numunelerin DNA konsantrasyonunu ölçmek için kantitatif rekombinaz polimeraz basitleştirmesini kullanmaktır. Bu, reaksiyona önce hedef DNA dahili pozitif kontrolü, DNA primerleri ve floresan etiketli probların eklenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, reaksiyonlar, enzimleri aktive etmek için reaksiyonları ısıtan ve hedef ve kontrol amplikonlarının oluşumunu tespit etmek için probların floresansını izleyen gerçek zamanlı PCR makinesine yerleştirilir.
Daha sonra, floresan veriler, standart eğriyi oluşturmak ve testi doğrulamak için bir komut dosyası kullanılarak analiz edilir. Sonuçlar, DNA örneklerinin, bir HIV hedef DNA'yı ölçmek için kullanılan doğrulama deneylerine dayalı olarak doğru konsantrasyonun bir büyüklük sırası içinde doğru bir şekilde ölçülebileceğini göstermektedir. Bu tekniğin gerçek zamanlı kantitatif PCR gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, RPA'nın izotermal olmasıdır, bu nedenle pahalı bir termal döngüleyiciye gerek yoktur.
RPA ayrıca sıcaklığa daha düşük bir amplifikasyon gerektirir, kirli numunelere toleranslıdır, hedefi dakikalar içinde tespit edilebilir seviyelere yükseltir ve oda sıcaklığında kolay taşıma ve saklama sağlamak için lly enzimleri kullanır. Temiz bir ön amplifikasyon çalışma alanı oluşturmak için tüm tezgah üstü ve ekipman yüzeylerini %50 çamaşır suyu solüsyonu ile temizlemeye başlamak için, 280 milimolar magnezyum asetat solüsyonunu, rehidrasyon tamponunu ve reaksiyon peletlerini eksi 20 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve solüsyonları oda sıcaklığında çözün. Daha sonra, 383.5 mikrolitre rehidrasyon tamponunu, 41.6 mikrolitre nükleaz içermeyen suda yeni bir mikro füj tüpüne aktararak ve 35 mikrolitre magnezyum asetatta ayrı bir tüpe karıştırmak için girdap yaparak bir ana karışım oluşturun.
Rehidrasyon tamponu stok çözeltilerindeki magnezyum asetatı dondurucuya geri koyun. Daha sonra dört santigrat derece buzdolabından astar ve prob quas'ı alın. Bunları ön amplifikasyon çalışma alanına yerleştirin ve ana karışıma giden 10 mikromolar ileri ve geri primerin her birinin 27,3 mikrolitresinde ışığa maruz kalmayı en aza indirmek için ışıkları kapatın.
Daha sonra, HIV 1D NA etiketli 10 mikromolar hex'in 7.8 mikrolitresinde. Ana karışıma sondalayın ve tüpü girdaplayın. Daha sonra astarı ve prob stoğu çözeltilerini depolama reaktiflerine geri getirin, dahili pozitif kontrol için QRPA reaksiyonlarını birleştirmek için metin protokolünde belirtildiği gibi buraya eklenebilir. İlk olarak, dondurularak kurutulmuş enzim peletlerini iki, düşük katlı sekiz kuyulu PCR tüp şeritlerinden oluşan ayrı tüplere yerleştirin, ana karışımın 37.5 mikrolitresini bir pelet içeren bir tüpe pipetleyin.
Kabarcıklar oluşturmadan peleti çözmek için tüpün içeriğini pipet ucuyla hafifçe karıştırın. Hacim kaybını önlemek ve her tüp arasında pipet uçlarını değiştirdiğinizden emin olmak için ucu reaksiyondan dikkatlice çıkarın. Ana karışımı soğutmak için tüpleri en az beş dakika boyunca soğutulmuş 96 kuyulu soğuk bir bloğa aktarın.
Bu arada, termal döngüleyici yazılımını protokol ile yükleyin ve plaka düzeni metin protokolünde belirtilmiştir. Ardından, PCR tüplerinden biraz daha geniş olacak şekilde iki şerit şeffaf plastik mikro conta yapıştırıcısı kesin. Ayrıca iki düz PCR tüp şeridi kapağı edinin, metin protokolünde belirtildiği gibi HIV bir plazmit şablonunu alikotlayın.
Ardından uygun PCR tüpüne 10 mikrolitre şablon ekleyin. Yine, karışımı pipet ucuyla hafifçe karıştırın. Daha sonra, her bir tüp kapağına 2,5 mikrolitre magnezyum asetat ekleyin ve ardından kapakları, tam olarak kapatılmamaları için reaksiyon tüplerinin üzerine yavaşça yerleştirin.
Magnezyum asetat, kapaktan açıkça görülebilmelidir. PCR tüp şeritlerini bir mikro santrifüje yerleştirin ve tüpün altındaki tüm sıvıyı toplamak ve kabarcıkları gidermek için tüpleri 10 saniye santrifüjleyin. Magnezyum asetat çözeltisinin ana karışımla birleştirilmesi, QRPA reaksiyonunu başlatır.
Reaksiyonu durdurmak için PCR tüplerini hızlı bir şekilde soğuk bloğa çıkarın. Ardından, reaksiyonların kirlenmesini önlemek için kapakları yavaşça çıkarın ve tüpleri şeffaf bir mikro sızdırmazlık filmi ile kapatın. Tüpleri, plaka düzenindeki konumlara göre termal döngüleyiciye aktarın.
Termal döngüleyicinin kapağını kapatın ve çalıştırmayı başlat'a tıklayın. Çalıştırma tamamlandığında deneme için bir dosya adı belirlediğinizden emin olun. Ham floresan verilerini görüntüleyin ve niceleme amplifikasyon sonuçları adı verilen bir dosya oluşturacak bir elektronik tabloya aktarın.
Standart eğriyi oluşturmak için. Önce standart eğri komut dosyasını indirin, ardından MATLAB veya benzer bir veri analiz programını açın. Komut dosyasını açın ve komut dosyasını çalıştırmak için çalıştır tuşuna basın.
İstendiğinde analiz edilecek veri dosyalarının sayısını yazın. Ardından, her eğitim dosyasındaki örnek sayısını ve çoğaltma sayısını yazın. Komut penceresinde.
Standart eğriyi oluşturmak için kullanılan günlük tabanlı 10 kopyadaki en düşük DNA konsantrasyonunu yazın ve enter tuşuna basın. Buradaki örnekte. En düşük konsantrasyon, bir günlük tabanlı 10 kopyadır.
Ardından her bir DNA standardı arasındaki konsantrasyon farkını komut istemine yazın ve buraya enter tuşuna basın. Konsantrasyon aralığı bir günlük tabanlı 10 kopyadır. Ardından, eğim eşiği değerini komut penceresine girin ve enter tuşuna basın.
Bu değer genellikle üç ile beş arasındadır. Z olarak da bilinen pozitif eşik için arka planın üzerindeki standart sapma sayısını yazın ve ardından bir ile beş arasında tipik Z değerleri girin. Ardından, bu durumda verileri toplamak için kullanılan ekipmanı belirtin.
Termal döngüleyici için bir tane yazın ve enter tuşuna basın. Dahili bir pozitif kontrol varsa, yeni bir eşiğin gerekli olup olmadığına bağlı olarak Y veya N yazarak eşik için varsayılan veya yeni bir değer seçin. Son olarak, standart eğriyi oluşturmak için kullanılacak tüm elektronik tablo dosyalarını seçin.
Komut dosyası daha sonra tüm verileri otomatik olarak içe aktaracak ve analiz edecektir. Gerçek zamanlı QRPA, HIV 1D NA'nın farklı kopya sayılarını içeren çift örnekler üzerinde gerçekleştirildi. Floresansta bir artışla gösterilen saptanabilir amplifikasyonun başlangıcı, daha yüksek DNA kopya sayısına sahip numuneler için, daha düşük kopya sayısına sahip numunelere göre daha erken gerçekleşir. Ham floresan verileri, bilinen HIV 1D NA konsantrasyonlarının amplifikasyonundan standart bir eğri oluşturmak için kullanıldı. Bu veriler üstel bir eğriye sığdırıldı ve R kare değeri yüksek bir uyum iyiliğini gösterir.
Standart eğri, bilinen konsantrasyondaki ek DNA örneklerinin konsantrasyonlarını tahmin etmek için kullanıldı. Z'nin değerini bire ayarlamak, düşük DNA konsantrasyonlarının doğru bir şekilde tahmin edilmesini sağlar. Buna karşılık, yüksek DNA konsantrasyonları, beş Z değeri ile daha iyi tahmin edilir.
Bu prosedürü denerken, RPA'nın DNA amplifikasyon oranını sınırlamak için gerçek döngülerden yoksun olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, amplifikasyon hızı hassas bir şekilde kontrol edilmelidir. Deneyler arasındaki tutarlılık çok önemlidir, bu nedenle tüm deneyler için aynı astar alikotlarını kullandığınızdan emin olun.
Reaksiyon bileşenlerini ısı ve ışıktan koruyun. Veri toplama başlamadan hemen önce magnezyum asetat ekleyin ve reaksiyonları başlayana kadar soğuk blokta tutun. Deney.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, numunelerde DNA konsantrasyonlarını kantitatif olarak belirlemek için tasarlanmış gerçek zamanlı rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi için bir protokol sunar. Yöntem, bir termal sikller veya sahaya sahip bir mikroskop kullanır ve bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesini içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyoteknoloji
- Moleküler Biyoloji
- Genomik
Arka Plan
- DNA'nın kantitatif analizi, çeşitli biyolojik araştırma alanlarında kritik öneme sahiptir.
- Gerçek zamanlı kantitatif PCR gibi geleneksel yöntemler, pahalı termal sikller gerektirir.
- Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA), izotermal bir alternatif sunar.
- İç pozitif kontroller, kantitatif testlerin güvenilirliğini artırır.
Çalışmanın Amacı
- RPA kullanarak DNA konsantrasyonlarını kantitatif olarak belirlemek için bir protokol geliştirmek.
- Daha iyi test doğrulama için bir iç pozitif kontrol oluşturmak.
- Gerçek zamanlı floresan verilerini analiz etmek için komut dosyaları sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Hedef DNA, primerler ve floresan problar ile reaksiyon karışımlarının hazırlanması.
- Amplifikasyon sırasında floresansı izlemek için gerçek zamanlı PCR makinesi kullanımı.
- Standart bir eğri oluşturmak için floresan verilerinin analizi.
- HIV hedef DNA'sını kantitatif olarak belirleyen deneylerle testin doğrulanması.
Ana Sonuçlar
- Test, DNA konsantrasyonlarını bir büyüklük sırası içinde doğru bir şekilde kantitatif olarak belirler.
- Doğrulama deneyleri, iç pozitif kontrolün etkinliğini doğruladı.
- RPA, geleneksel PCR yöntemlerine göre avantajlar gösterdi.
- Protokol, pahalı ekipmanlara sahip olmayan araştırmacılar için erişilebilirdir.
Sonuçlar
- Geliştirilen RPA testi, DNA kantitasyonu için güvenilir bir yöntemdir.
- İç pozitif kontroller, test doğrulamada esastır.
- Bu yöntem, DNA kantitasyonu tekniklerine daha geniş erişimi kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative DNA measurement is a foundational capability in target validation and assay development, where accurate concentration data supports lead identification and predictive confidence. The described qRPA method provides an isothermal alternative to qPCR, reducing equipment dependency and enabling deployment in resource-variable settings. This positions the assay as a scalable tool for early discovery workflows requiring reliable nucleic acid quantification without thermal cycling infrastructure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise DNA target quantification in complex samples.
- Operational Value: Supports functional target validation by delivering concentration data within one order of magnitude accuracy using internal positive controls.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by generating standard curves that allow cross-experiment comparison and assay performance assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements essential for dose-response modeling and compound screening readiness.
- Operational Value: Enables assay standardization through internal positive controls that monitor amplification efficiency and inhibition.
- Scalability: Compatible with microscope-based detection, supporting adaptation to point-of-care or decentralized testing formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage quantification to preclinical validation through reproducible standard curve generation.
- Biomarker Alignment: Supports monitoring of DNA-based biomarkers where concentration changes indicate target engagement or pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative outputs that inform go/no-go decisions by defining detectable limits and dynamic range.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where quantitative nucleic acid data informs compound prioritization and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying DNA targets to assess pathway modulation or genetic perturbation effects.
- Screening: Delivers reproducible fluorescence-based readouts suitable for high-throughput adaptation when paired with automated liquid handling.
- Analytics: Generates standard curves and Z-score thresholds that allow teams to compare conditions and validate assay sensitivity.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing quantifiable DNA measurements that correlate with biological activity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable quantification platform applicable across DNA targets, reducing redevelopment effort for new assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability through internal positive control normalization.
- Operational Value: Enhances reproducibility via isothermal amplification and cold-block reaction setup, minimizing temperature-dependent artifacts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating need for thermal cyclers, lowering barrier to entry for quantitative DNA analysis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through concentration data that supports accurate dosing and target exposure modeling.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in primer/probe design and fluorescence data interpretation.
- Needs access to fluorescence detection equipment such as a real-time PCR machine or microscope with stage heater.
- Demands standardization of reagent handling, including magnesium acetate addition timing and cold-block storage.
- Involves adaptation considerations for sample types, particularly regarding inhibitor tolerance and DNA purity.
- Includes practical limitations such as the one-order-of-magnitude quantification accuracy and absence of true amplification cycles requiring precise reaction timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Assembling the Quantitative Recombinase Polymerase Amplification (qRPA) Reactions for a Standards Curve
5:16
Constructing a Standard Curve from Multiple Experiments with Custom Scripts
6:55
Results: Construction of an HIV-1 DNA Standard Curve by qRPA
7:53
Conclusion
