Lepr

Bu prosedürün genel amacı, diyabetik LEP R DB farelerden canlı adacıklar elde etmek ve canlı hücre iki foton görüntüleme yöntemiyle adacıklardaki beta hücrelerinden insülin salınımını değerlendirmektir. Bu işlem; öncelikle pankreas sindirimi için enzim karışımı, adacık kültürü için kültür medyumu ve iki foton analizi için ekstraselüler tampon gibi reaktiflerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, ötanazi uygulanmış bir farenin karnı açılır ve organı sindirmek için pankreasa enzim karışımı enjekte edilir.

Ardından, eyelet'ler pankreatik sindirimden ayrılır ve kültüre edilir. Son olarak, eyelet içindeki beta hücrelerinden tekil insülin granül füzyonlarının görüntülenmesi için iki foton mikroskobu kullanılır. Nihayetinde bu protokol, araştırmacıların sağlıklı durumda ve hastalıkta insülin salgılanmasının nasıl kontrol edildiğini anlamalarına yardımcı olacaktır.

Eyelet izolasyon tekniğinin temel iyileştirmesi, eyeletlerin verimini ve canlılığını artırmak için karışık enzimlerin kullanılmasıdır. İki foton görüntüleme tekniği, şu an için sağlam bir eyelet içindeki birden fazla hücreden insülin sekresyonunu kaydetmenin tek yöntemidir. Pankreatik eyeletleri izole etmek için enzimleri hazırlamak amacıyla, beş miligram liase TL içeren bir flakonu 26 mililitre DM EM ile seyreltin; tip dört kollajenazı Hank's tamponunda 0,5 miligram/mililitre konsantrasyona getirin ve ardından hazırlanan liase TL ve kollajenaz çözeltileriyle tamamlayın.

Hacimce dörtte bir oranında, enzim karışımını her biri 2,5 mL olacak şekilde paylaştırın ve -20 °C'de saklayın. Bir litre su içeren büyük bir konik erlene RPMI izolasyon ortamı hazırlamak için, bir flakon RPMI 1 6 4 0 tozunu oda sıcaklığında çözün ve iki gram sodyum bikarbonat ile 4,02 gram HEPES ekleyin. pH değerini 7,4'e ayarlamak için sodyum hidroksit kullanın, ardından filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.

İki foton görüntüleme için RPMI izolasyon besiyerine %10 FBS ve %1 antibiyotik ekleyerek RPMI kültür besiyeri hazırlayın. Aşağıdaki reaktifleri kullanarak sodyum açısından zengin hücre dışı tampon hazırlayın. Hücre dışı boya hazırlamak için, SRB'nin sekiz milimolar stokunu hazırlayıp hücre dışı tamponu küçük tüplere paylaştırın ve -20 °C'de saklayın.

Çalışma konsantrasyonuna ulaşmak için, stok SRB'yi 1/10 oranında seyreltmek amacıyla taze hücre dışı tampon kullanın. Bir fareyi sakrifiye ettikten ve metin protokolüne uygun olarak fare gövdesini %70 etanol ile iyice spreyledikten sonra, hayvanı başı cerraha dönük, kuyruğu ise uzağa bakacak şekilde konumlandırın. V şeklinde bir flep oluşturmak için abdominal deri ve periton boyunca iki uzun lateral kesi yapın.

Tüm abdominal boşluğu açığa çıkarmak için deri flebini yukarı doğru çekin. Bağırsakları kenara itin ve katlanmış doku ile ortak safra kanalını ortaya çıkarmak için karaciğeri sabit tutun. Ardından, enjekte edilen enzimlerin duodenumun içine girmesini engellemek için duodenum duvarındaki ampullaya bir vasküler klempi uygulayın.

Bu, pankreatik enzimlerin pankreas kanalı reflüsüne mi, enjeksiyon bölgesine mi yoksa duodenum'a mı gireceğini belirleyen önemli bir adımdır. Ortak karaciğer kanalı ile sistik kanalın birleşim yerinin yakınındaki ana safra kanalını kanüle etmek için 31 gauge bir iğne kullanın ve ikinci bir enjeksiyon için yer bırakın. Pankreas ilk seferde perfüze edilemezse, fare ana safra kanalına yavaşça yaklaşık iki mililitre soğuk enzim karışımı enjekte edin.

Klem de doğru konumdaysa, pankreas hızla perfüze edilecektir. Pankreas perfüze olduktan sonra organı hızlıca çıkarın, cam bir şişeye yerleştirin ve yaklaşık 19 dakika boyunca 37 °C su banyosunda inkübe edin. İnkübasyonun ardından, yaklaşık 20 mL soğuk izolasyon ortamı ekleyerek sindirim işlemini durdurun.

Pankreası parçalamak için flakonu hafifçe çalkalayın ve bir milimetre gözenek boyutuna sahip standart bir T süzgeci aracılığıyla steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü tamamlamak için izolasyon ortamı kullanın ve 400 G'de, dört santigrat derecede bir dakika boyunca santrifüjleyin. Fren kapatılmış haldeyken, pelete izolasyon ortamı ekleyin ve onu çözün.

Ardından süspansiyonu iki adet 15 mililitrelik tüpe aktarın ve ikinci kez santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ettikten sonra, her bir pelete altı mililitre yoğunluk gradyanlı hücre ayırma medyumu ekleyin ve yeniden süspande etmek için pipetleyin veya vorteksleyin. Sonra tüplerin kenarından, yoğunluk gradyanlı ayırma medyumunun üzerine yaklaşık altı mililitre izolasyon medyumunu nazikçe ekleyin ve 100 G'de, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Koparma işlemiyle birlikte üst, orta ve alt katmanları üç ayrı kaba toplayın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, üç kaptaki gözleri bir pipet kullanarak tek tek seçin. Gözlerin enzim sindiriminden sonra toparlanmalarına yardımcı olmak için çoğunluğu orta katmanda bulunacaktır.

25 santimetrelik Petri kaplarında, 10 millimolar glukoz içeren altı mililitre RPMI kültür ortamı ile 40'ar adet adacık grubu hazırlayın ve iki gün boyunca kültüre edin. İnsülin sekresyonunu ölçmek için dolaylı bir analiz olarak iki foton görüntüleme yapmak üzere ortamı günlük olarak değiştirin. İki gün boyunca kültüre edilmiş adacıkları ön inkübasyona tabi tutmak için hücre dışı tamponda üç millimolar glukoz kullanarak başlayın.

Çözelti sızıntısını önlemek için mikroskop tablasına 30 dakika boyunca gres sürün ve içinde lam bulunan termo kontrol odasını mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, odağını 0,8 millimolar SRB ve çeşitli glukoz konsantrasyonları içeren 500 µL ekstraselüler tampon ile doldurun. Son olarak, ön inkübe edilmiş gözcüğü odanın ortasına yerleştirin ve gözcüğün üç ila dört hücre katmanı derinliğine odaklayın.

Kemirgen gözeciklerinde, insülin için yapılan immün boyama çoğu hücrenin beta hücresi olduğunu göstermektedir. Ardından, iki fotonlu mikroskop ve 60 x yağ daldırma objektif kullanarak, aniden ortaya çıkan küçük bir floresan nokta aracılığıyla tekil ekzositik olayları tanımlayın. Son olarak, tarama görüntüsü yazılımında, vahşi tip bir fare için belirlenen bir ilgi alanı üzerinden floresan sinyalinin hızlı yükselme fazı ile olayı doğrulayın.

Bu videoda gösterilen protokol kullanılarak yaklaşık 200 eyelet elde edilmesi beklenmektedir. Sağlıklı eyeletler parlak, yuvarlak şeklinde ve düzgün sınırlara sahiptir. Yetersiz sindirilmiş izolasyon gruplarında ise genellikle küçük ve bulanık eyeletler ile kendisine hücreler yapışmış eyeletler görülür.

Aşırı sindirilmiş birleşimde, glukoz veya yüksek potasyum gibi uyarılara yanıt olarak iki foton analizinde daha az gözlem noktası görülürken, insülin granülleri plazma membranı ile kaynaştığında, bir SRB granüllerin içine girer ve bu da yaklaşık 400 nanometre çapında ani bir floresan noktanın belirmesiyle sonuçlanır. Kaydedilen süre içerisinde, uyarana yanıt olarak gerçekleşen tüm ekzositoz olayları tanımlanır ve bu olayların konumu, belirme zamanı, süresi ve füzyon türü belirlenir. KISS ve Run veya tam füzyon gibi olaylar karakterize edilir ve tip iki diyabet modellerinde granül füzyonundaki herhangi bir kusuru değerlendirmek için değerlidir.

Bu yöntem, diyabetik DB DB isletlerindeki kusurun, tekil granül füzyon kinetiğindeki bir değişiklik değil, tam granül füzyon kaybı olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Ayrıca, hastalık durumunda insülin salgılanmasındaki azalmayı etkileyen en büyük faktör, yanıt veren hücre sayısındaki azalmadır. Bu videoyu izledikten sonra, pankreas perfüzyonu ve sol taraftaki RDB farelerden islet aktivasyonu hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalı ve sağlam isletler içindeki salgı yanıtlarını değerlendirmek için iki farklı tahlili gerçekleştirebilmelisiniz.