Name: Lepr Db Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Öğrenin, Lepr Db farelerinden pankreas adacıklarını izole etme ve iki foton mikroskobisiyle canlı hücre görüntüleme yöntemini. Bu teknik, tip 2 diyabette insülin salınım mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Avustralya Araştırma Konseyi Hibe DP110100642 (PT'ye) ve Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Hibeleri APP1002520 ve APP1059426 (PT ve HYG'ye) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm mevcut deneyler (Queensland Üniversitesi, Anatomik Biosciences Etik Kurul tarafından onaylanan) University of Queensland yerel hayvan etiği prosedürlere göre yapılmıştır. 1. Adacık İzolasyonu <ol><li> Reaktif hazırlama <ol><li> Enzim karışımı <ol><li> Pankreas sindirimi için Liberase® ve kollajenaz tip IV&#39;ün bir karışımının kullanılması. (Termolisin düşük) Liberase® TL DMEM, 26 ml (Dulbecco Modified Eagle Medium) ile 5 mg 1 vial seyreltilir. </li><li> , 5 mM HEPES ile takviye edilmiş 0.5 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, Hank tamponu içinde kolajenaz tip IV Hazırlama 0.5mM CaCl2, 0.1 mg / ml DNase ve 1 mg / ml sığır serumu albümini. </li><li> Örneğin, (hacim olarak) 1 Tl 1 mi kolajenaz Liberase® 4 ml: 4 bir oranda Liberase® TL ve kolajenaz çözüm karıştırın. -20 ° C de, her ve mağaza 2.5mL enzimlerin karışımı kısım. NOT: Doku inkübasyon süreleri venzim partiler arasında biraz (30 sn 1 dk farkı) lanarak. Bu nedenle, bir parti deneyi gerekebilir. </li></ol></li><li> RPMI İzolasyon Medya <ol><li> Oda sıcaklığında 1 L su RPMI 1640 tozu bir şişe eritilir ve 2 g NaHCOs 3, 4.02 g HEPES tamamlar. </li><li> Manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın, büyük bir konik bir şişe içinde, RPMI yalıtım ortamı birleştirin NaOH ile pH 7.4&#39;e ayarlayın, filtre ile sterilize edildi ve 4 ° C &#39;de muhafaza edin. </li></ol></li><li> RPMI Kültür Medya </li><li> % 10 fetal sığır serumu ve 1% antibiyotikler (örneğin, penisilin, 100 U / ml, 100 ug streptomisin / ml) ile, RPMI kültür ortamı kullanın. </li></ol></li><li> Adacık İzolasyonu ve Kültürleme <ol><li> Hayvan Kurban <ol><li> Yerel kurumun etik prosedürlerine göre servikal dislokasyon veya CO 2 boğulma tarafından fareler Kurban. % 70 etanol ile iyice fare vücut püskürtün. </li></ol></li><li> Pankreas Perfüzyon <ol><li> Uyanal karın cilt ve periton yoluyla se 2 uzun kesimler V şeklinde kanadı yapmak. Tüm karın boşluğu ortaya çıkarmak için cildi yukarı kapağı çekin, bağırsak kenara koymak ve koledok ortaya çıkarmak için katlanmış bir kağıt mendil ile yerinde karaciğer tutmak (Şekil 1 ve 2). Hayvan koyun cerrah ve uzak cerrah gelen kuyruk doğru kafa böylece. </li><li> Duodenum (Şekil 1) girmesini enjekte enzimleri engellemek için duodenum duvarında ampulla bir damar kelepçe uygulayın. NOT: enjekte enzimler pankreatik kanal içine gidin ve (kelepçe) üzerinden enjeksiyon yerinde pankreas veya reflü serpmek ya da (kelepçenin altında) duodenuma gidecek olup olmadığını o belirler gibi bu önemli bir adımdır. </li><li> Ortak hepatik kanal ve sistik kanal (Şekil 1) kavşağı yakınında 31 G iğne ile koledok cannulate ve ikinci enjeksiyon için odayı terk inci eğere pankreas ilk kez serpmek için başarısız olur. Yavaş yavaş (over ~ 10 sn) fare koledok içine yaklaşık 2 ml soğuk enzim karışımı enjekte edilir. NOT: kelepçe doğru pozisyonda ise pankreas hızla perfüze edilecektir. </li><li> İğne koledok içinde olduğunu, ancak pankreas serpmek edemez (yani. Sabitlenmiş üzerinde ise karaciğer biraz uzak kelepçe yukarı taşımak ya da kenetlenmiş altında ise karaciğere biraz aşağı hareket ettirin) kelepçe konumunu ayarlayın. NOT: İğne bazen çevredeki kapsül yerine kanalın lümenine gider. Yararlı bir işareti koledok enjekte kanalının genişlemesi olduğu içinde iğne olup olmadığını kontrol edin. Pankreas serpmek için başarısız olursa, alternatif enzim karışımı beklenen düşük verim ile pankreasın birden fazla enjekte edilebilir olduğunu. Pankreasın (splenik lob) sol sitenin perfüzyon adacık verimi maksimizasyonu açısından önemlidir. </li><li> Pankreas p sonraerfused, hızlı bir şekilde, pankreas kaldırmak bir viyal (~ 20 mi, cam) içine koymak ve bir 37 ° C su banyosu içinde yaklaşık 19 dakika inkübe edilir. NOT: İnkübasyon süresi fare zorlanma ve yaşa bağlı olarak biraz değişebilir. </li><li> İnkübasyon süresinden sonra, ~ soğuk yalıtım ortam 20 ml ekleyerek sindirim işlemi durdurun. Pankreas bozabilir ve steril bir 50 ml tüp içine normal bir kurutma eleği (1 mm gözenek çapı) üzerinden dökün iyice çalkalayınız. Fren kapalı olan 4 ° C&#39;de 1 dakika boyunca 400 xg&#39;de izolasyon medya ve santrifüj tüpü kontör. </li><li> Yine izolasyon ortamı pelet çözülür ve daha sonra fren kapalı olarak 4 ° C &#39;de 1 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj, iki adet 15 ml&#39;lik tüplere aktarın. Aspirasyon süpernatant sonra, vorteks veya yukarı ve aşağı pipetleme tüp başına yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı 6 ml (Histopaque 1077 çözelti) ile iyice iki pelet karıştırın. Daha sonra hafifçe üstüne tüpün yanına yalıtım ortam ~ 6 ml ilaveFren kapalı olarak 4 ° C &#39;de 15 dakika boyunca 100 x g&#39;de yoğunluk gradyanlı ayrıştırma ortamı ve santrifüjlenir. </li><li> Üst (izolasyon ortamı) içinde süpernatant 3 ayrı yemekler, orta ve alt (yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı) katmanı toplayın. Bir mikroskop altında bir pipet kullanarak, bu 3 yemekler adacıklar seçmenize. NOT: orta tabaka adacıklarının çoğunu içerir. Adacıklar boyutu ~ 50 mikron 500 kompakt yapıları (Şekil 3) olarak kabul edilmektedir. Biz WT farelerinde ~ 200 adacıklar ve db / db farelerinde 300- &lt;100 adacıklar elde. </li></ol></li><li> Adacık Kültürleme <ol><li> Adacıklar, 37 ° C&#39;de,% 5 ile enzim sindiriminden 6ml RPMI kültür ortamı (10 mM glukoz) ile 25 cm&#39;lik bir petri tabağına 40 adacıklar kültürü grupları kurtarmak için /% 95 canlı önce 2 gün CO2 / O 2 cell 2-foton görüntüleme. Günlük kültür ortamı değiştirin. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Canlı Hücre 2-Foton Görüntüleme <ol><li> Reaktif Hazırlama <ol><li> Ekstraselüler Tampon <ol><li> 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2.5 mM CaCI2, 1 mM MgCI2, 5 mM NaHCO 3 ve 10 mM HEPES ile 2-foton deneyi için, sodyum açısından zengin hücre-dışı tamponu hazırlayın. </li></ol></li><li> Ekstraselüler Boya <ol><li> 2-foton deneyi için -20 ° C&#39;de hücre dışı tamponu, kısım küçük tüplere ve deposunda hazır SRB 8 mM hazırlar. 0.8 mM bir çalışma konsantrasyonunu elde etmek için taze dışı tamponu stok SRB 01:10 sulandırınız. </li></ol></li></ol></li><li> foton Görüntüleme <ol><li> İlk olarak, 30 dakika boyunca 3 mM glikoz hücre dışı tamponu içinde 2 günlük bir kültür adacıklar önceden inkübe edin. NOT: Biz kültüründe 2 ile 5 gün arasında adacıklar kullanın. </li><li> Sonra, mikroskop sahnede monte termo-kontrol odasının üzerine cam slayt yerleştirin. Çözümün sızmasını önlemek için gres kullanın. </li><li> Extracell 500 ul odasına KapakFarklı glukoz konsantrasyonları (3 mM, 6 mM, 15 mM ve 20 mM glukoz) ile 0.8 mM SRB ihtiva nitlerin tamponu. </li><li> Sonra, odanın ortasına ön İnkübe adacık yerleştirmek ve kemirgen adacıklar halinde, insülin immün çoğu hücreleri beta hücreleri olduğunu göstermektedir nerede, adacık haline 3-4 hücre katmanları odaklanın. NOT: SRB hızla adacık tüm hücre zarı açıklayacağım ve adacık görüntüye hazırdır. </li><li> (Örn., Scanimage 11). Bir 60X immersiyon yağı hedefi (NA 1.42) ve görüntüleme yazılımı ile 2-foton mikroskop kullanın 4 tipik bir mikroskopi düzenlemesini göstermektedir Şekil. Floresan ile bir zar 880 nm&#39;de femtosaniye lazer darbeleri ile heyecanlı geçirgenliği olmayan floresan dışı işaretleyici olarak SRB kullanarak görüntü ekzositik olaylar, 550-650 nm&#39;de. Stimülasyon adacık yanıtları kaydedin. </li><li> Küçük bir floresan nokta aniden görünüşü tek ekzositik olayları tespit (çözünürlük 10 piksel /1 m) ve ilgi bir bölge (~ 0.78 mikron 2) üzerinde floresan sinyal hızlı yükselen faz onaylayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

adacık izolasyonu en kritik faktör pankreasın ilk perfüzyon ise; Bir altında oldukça düşük adacık verim pankreas sonuçları perfüze. Diğer faktörler de bu sindirim zaman ve kısmen perfüzyon seviyesinin telafi olabilir çalkalama düzeyi gibi izolasyon kalitesini etkiler. Örneğin, tam olarak perfüze pankreas hafifçe çalkalama sırasında bir küçük pankreas daha çalkalanarak ~ 20 dakika sindirim gerektirebilir sindirilmiş aksine, 18 dakika, 30 saniye ~ 37 ° C&#39;de inkübe edilmesi gerekecektir. Bizim ellerde iki sindirim enzi...

hastalıkta p-hücresi işlev bozukluğu rolü yaygın 3,4 kabul edilmiştir. Böyle MIN6 ve INS-1 gibi hücre hatları beta hücre davranış biyolojisinin anlaşılmasında yararlı araçlardır. Bununla birlikte, insülin salgılanmasının fizyolojik kontrol Langerhans adacıklarında içinde yer alır. Bu adacıklar sıkıca paketlenmiş beta hücreleri binlerce yanı sıra kan damarları ve diğer endokrin hücre tiplerini içerir. Adacık içinde bu ortam insülin salgılanmasını etkiler ve diyabette önemli olması muhtemeldir. Bu nedenle, insülin sekresyonunun fizyolojik kontrol ve hastalığın patofizyolojisi anlamak için, sağlam adacıklar çalışma gereklidir. Adacık izolasyonu Tip 2 diyabetli hastaların özellikle insan adacıklarında Canlı insan adacık ve elde etmek güçtür. Buna ek olarak, insan adacıklar deneysel moleküler manipülasyon için kısıtlı imkanları vardır. Araştırmacılar bu nedenle kullanılan adresHayvanlar ve tip 2 diyabet hayvan modellerinden sağlar. Böyle bir hastalık modeli, db / db faredir. Bu modeller yakından insan hastalığı 5,6 paralellikler bir fenotip ilerlemesi ile tip 2 diyabete kendiliğinden mutasyon olduğunu. diyabetik db / db farelerde adacık izolasyonu için burada sunulan protokol daha iyi verim, saflaştırma ve gelişmiş adacık hayatta kalmak için bazı iyileştirmeler ile diğer gruplarla ortak birçok adım vardır. 2 foton görüntüleme Burada anlatılan canlı hücre 2-foton tahlil sayısını ölçmek ve 7 ve yabani tip diyabetik 8,9 adacıklar birçok hücrelerinden insülin tek içeren granüllerin özelliklerini değerlendirmek için araştırmacılar sağlar.

<table><tbody><tr><td>Liferaz TL 5 mg</td><td>Roche-5401020001</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kollajenaz tip IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>izolasyon ortamı hazırlamak için</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>Kültürlü besiyeri hazırlamak için</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>kültürlü besiyeri hazırlamak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>kültürlenmiş ortam hazırlamak için</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>liberaz</td></tr><tr><td>Metamorf programını</td> seyreltmek için <td>Molecular Devices, ABD</td><td></td><td>2-foton görüntülerini analiz etmek için</td></tr></tbody></table>

lepr<sup&gt; db</sup&gt; tip 2 diyabet fare modeli: bozulmamış islets of pankreas adacık İzolasyonu ve canlı hücre 2-foton görüntüleme

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Tip 2 diyabet 2013 yılında 382 milyon kişiyi etkileyen kronik bir hastalıktır, ve, son 2 yıl boyunca. 2035 1 ile 592.000.000 açıkça 2 kurulmuştur tip 2 diyabette beta hücre disfonksiyonu rolünü artması bekleniyor. Araştırma ilerleme pankreas adacık izolasyonu için yöntemler gerektirmiştir. Adacık izolasyon protokolü yabani tip ve diyabetik Lepr db (db / db) fareler, hem izole adacıklar verim ve kalitesini artırmak için bazı değişikliklerle, hisseleri burada diğer gruplardan protokolleri ile birçok ortak adımlar sundu. Bir canlı hücre 2-foton görüntüleme yöntemi, daha sonra adacıklara olan insülin salgılanmasının kontrol araştırmak için kullanılabileceğini sunulmuştur.

Adacık verimi ve arıtma Normal bir vahşi tip fare, yaklaşık 200 adacık beklenmektedir. Sağlıklı adacıklar yuvarlak, parlak bir görünüm ve pürüzsüz bir sınır var. Bir altında sindirilmiş toplu az adacıklar ve asiner hücre ekli adacıklar (Şekil 3) sahipken aşırı sindirilmiş izolasyon toplu genellikle küçük ve bulanık adacıklar vardır. Daha iyi glisemik fareler 100&#39;ün altında (saydam bir görünüme sahip daha küçük adacıklar var kötü glisemik farelere kıyasla (300 adacık kada...

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Bu prosedürün genel amacı, diyabetik LEP R DB farelerden canlı adacıklar elde etmek ve canlı hücre iki foton görüntüleme yöntemiyle adacıklardaki beta hücrelerinden insülin salınımını değerlendirmektir. Bu işlem; öncelikle pankreas sindirimi için enzim karışımı, adacık kültürü için kültür medyumu ve iki foton analizi için ekstraselüler tampon gibi reaktiflerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, ötanazi uygulanmış bir farenin karnı açılır ve organı sindirmek için pankreasa enzim karışımı enjekte edilir.Ardından, eyelet'ler pankreatik sindirimden ayrılır ve kültüre edilir. Son olarak, eyelet içindeki beta hücrelerinden tekil insülin granül füzyonlarının görüntülenmesi için iki foton mikroskobu kullanılır. Nihayetinde bu protokol, araştırmacıların sağlıklı durumda ve hastalıkta insülin salgılanmasının nasıl kontrol edildiğini anlamalarına yardımcı olacaktır.Eyelet izolasyon tekniğinin temel iyileştirmesi, eyeletlerin verimini ve canlılığını artırmak için karışık enzimlerin kullanılmasıdır. İki foton görüntüleme tekniği, şu an için sağlam bir eyelet içindeki birden fazla hücreden insülin sekresyonunu kaydetmenin tek yöntemidir. Pankreatik eyeletleri izole etmek için enzimleri hazırlamak amacıyla, beş miligram liase TL içeren bir flakonu 26 mililitre DM EM ile seyreltin; tip dört kollajenazı Hank's tamponunda 0,5 miligram/mililitre konsantrasyona getirin ve ardından hazırlanan liase TL ve kollajenaz çözeltileriyle tamamlayın.Hacimce dörtte bir oranında, enzim karışımını her biri 2,5 mL olacak şekilde paylaştırın ve -20 °C'de saklayın. Bir litre su içeren büyük bir konik erlene RPMI izolasyon ortamı hazırlamak için, bir flakon RPMI 1 6 4 0 tozunu oda sıcaklığında çözün ve iki gram sodyum bikarbonat ile 4,02 gram HEPES ekleyin. pH değerini 7,4'e ayarlamak için sodyum hidroksit kullanın, ardından filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.İki foton görüntüleme için RPMI izolasyon besiyerine %10 FBS ve %1 antibiyotik ekleyerek RPMI kültür besiyeri hazırlayın. Aşağıdaki reaktifleri kullanarak sodyum açısından zengin hücre dışı tampon hazırlayın. Hücre dışı boya hazırlamak için, SRB'nin sekiz milimolar stokunu hazırlayıp hücre dışı tamponu küçük tüplere paylaştırın ve -20 °C'de saklayın.Çalışma konsantrasyonuna ulaşmak için, stok SRB'yi 1/10 oranında seyreltmek amacıyla taze hücre dışı tampon kullanın. Bir fareyi sakrifiye ettikten ve metin protokolüne uygun olarak fare gövdesini %70 etanol ile iyice spreyledikten sonra, hayvanı başı cerraha dönük, kuyruğu ise uzağa bakacak şekilde konumlandırın. V şeklinde bir flep oluşturmak için abdominal deri ve periton boyunca iki uzun lateral kesi yapın.Tüm abdominal boşluğu açığa çıkarmak için deri flebini yukarı doğru çekin. Bağırsakları kenara itin ve katlanmış doku ile ortak safra kanalını ortaya çıkarmak için karaciğeri sabit tutun. Ardından, enjekte edilen enzimlerin duodenumun içine girmesini engellemek için duodenum duvarındaki ampullaya bir vasküler klempi uygulayın.Bu, pankreatik enzimlerin pankreas kanalı reflüsüne mi, enjeksiyon bölgesine mi yoksa duodenum'a mı gireceğini belirleyen önemli bir adımdır. Ortak karaciğer kanalı ile sistik kanalın birleşim yerinin yakınındaki ana safra kanalını kanüle etmek için 31 gauge bir iğne kullanın ve ikinci bir enjeksiyon için yer bırakın. Pankreas ilk seferde perfüze edilemezse, fare ana safra kanalına yavaşça yaklaşık iki mililitre soğuk enzim karışımı enjekte edin.Klem de doğru konumdaysa, pankreas hızla perfüze edilecektir. Pankreas perfüze olduktan sonra organı hızlıca çıkarın, cam bir şişeye yerleştirin ve yaklaşık 19 dakika boyunca 37 °C su banyosunda inkübe edin. İnkübasyonun ardından, yaklaşık 20 mL soğuk izolasyon ortamı ekleyerek sindirim işlemini durdurun.Pankreası parçalamak için flakonu hafifçe çalkalayın ve bir milimetre gözenek boyutuna sahip standart bir T süzgeci aracılığıyla steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü tamamlamak için izolasyon ortamı kullanın ve 400 G'de, dört santigrat derecede bir dakika boyunca santrifüjleyin. Fren kapatılmış haldeyken, pelete izolasyon ortamı ekleyin ve onu çözün.Ardından süspansiyonu iki adet 15 mililitrelik tüpe aktarın ve ikinci kez santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ettikten sonra, her bir pelete altı mililitre yoğunluk gradyanlı hücre ayırma medyumu ekleyin ve yeniden süspande etmek için pipetleyin veya vorteksleyin. Sonra tüplerin kenarından, yoğunluk gradyanlı ayırma medyumunun üzerine yaklaşık altı mililitre izolasyon medyumunu nazikçe ekleyin ve 100 G'de, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Koparma işlemiyle birlikte üst, orta ve alt katmanları üç ayrı kaba toplayın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, üç kaptaki gözleri bir pipet kullanarak tek tek seçin. Gözlerin enzim sindiriminden sonra toparlanmalarına yardımcı olmak için çoğunluğu orta katmanda bulunacaktır.25 santimetrelik Petri kaplarında, 10 millimolar glukoz içeren altı mililitre RPMI kültür ortamı ile 40'ar adet adacık grubu hazırlayın ve iki gün boyunca kültüre edin. İnsülin sekresyonunu ölçmek için dolaylı bir analiz olarak iki foton görüntüleme yapmak üzere ortamı günlük olarak değiştirin. İki gün boyunca kültüre edilmiş adacıkları ön inkübasyona tabi tutmak için hücre dışı tamponda üç millimolar glukoz kullanarak başlayın.Çözelti sızıntısını önlemek için mikroskop tablasına 30 dakika boyunca gres sürün ve içinde lam bulunan termo kontrol odasını mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, odağını 0,8 millimolar SRB ve çeşitli glukoz konsantrasyonları içeren 500 µL ekstraselüler tampon ile doldurun. Son olarak, ön inkübe edilmiş gözcüğü odanın ortasına yerleştirin ve gözcüğün üç ila dört hücre katmanı derinliğine odaklayın.Kemirgen gözeciklerinde, insülin için yapılan immün boyama çoğu hücrenin beta hücresi olduğunu göstermektedir. Ardından, iki fotonlu mikroskop ve 60 x yağ daldırma objektif kullanarak, aniden ortaya çıkan küçük bir floresan nokta aracılığıyla tekil ekzositik olayları tanımlayın. Son olarak, tarama görüntüsü yazılımında, vahşi tip bir fare için belirlenen bir ilgi alanı üzerinden floresan sinyalinin hızlı yükselme fazı ile olayı doğrulayın.Bu videoda gösterilen protokol kullanılarak yaklaşık 200 eyelet elde edilmesi beklenmektedir. Sağlıklı eyeletler parlak, yuvarlak şeklinde ve düzgün sınırlara sahiptir. Yetersiz sindirilmiş izolasyon gruplarında ise genellikle küçük ve bulanık eyeletler ile kendisine hücreler yapışmış eyeletler görülür.Aşırı sindirilmiş birleşimde, glukoz veya yüksek potasyum gibi uyarılara yanıt olarak iki foton analizinde daha az gözlem noktası görülürken, insülin granülleri plazma membranı ile kaynaştığında, bir SRB granüllerin içine girer ve bu da yaklaşık 400 nanometre çapında ani bir floresan noktanın belirmesiyle sonuçlanır. Kaydedilen süre içerisinde, uyarana yanıt olarak gerçekleşen tüm ekzositoz olayları tanımlanır ve bu olayların konumu, belirme zamanı, süresi ve füzyon türü belirlenir. KISS ve Run veya tam füzyon gibi olaylar karakterize edilir ve tip iki diyabet modellerinde granül füzyonundaki herhangi bir kusuru değerlendirmek için değerlidir.Bu yöntem, diyabetik DB DB isletlerindeki kusurun, tekil granül füzyon kinetiğindeki bir değişiklik değil, tam granül füzyon kaybı olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Ayrıca, hastalık durumunda insülin salgılanmasındaki azalmayı etkileyen en büyük faktör, yanıt veren hücre sayısındaki azalmadır. Bu videoyu izledikten sonra, pankreas perfüzyonu ve sol taraftaki RDB farelerden islet aktivasyonu hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalı ve sağlam isletler içindeki salgı yanıtlarını değerlendirmek için iki farklı tahlili gerçekleştirebilmelisiniz.

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, hücresel dinamiklerin uzun süreli görselleştirilmesi için stabilize bir pencere aracılığıyla bir fare pankreasının intravital görüntülemesini açıklıyoruz.

İntravital görüntüleme: Stabilize bir görüntüleme penceresi aracılığıyla fare pankreasının hücresel düzeyde gözlemlenmesi için bir yöntem

Bu videoda, obez olmayan diyabetik immün yetmezliği olan bir fareye nakledilen lusiferaz eksprese eden beta hücrelerini görselleştirmek için görüntüleme tabanlı bir yöntem gösterilmektedir. Diyabetik bir fareden splenositlerin eklenmesi, substrat girişinden sonra azalan lüminesans ile görsel olarak doğrulanan ilerleyici beta hücre yıkımına yol açar.

Diyabetik Splenositlerle Mücadele Edilen İmmün Yetmezliği Olan Bir Farede Transgenik Beta Hücrelerinin Görüntülenmesi

Intraoküler nakli ve konfokal mikroskopi birleştirerek yeni bir yaklaşım aşılı dokuların içinde tek hücreli çözünürlüğe sahip uzunlamasına, non-invaziv, gerçek zamanlı görüntüleme...

Boyuna, Non-invaziv için Eye Ön Kamara içine Nakli<em&gt; In vivo</emGerçek zamanlı Tek hücreli Çözünürlük&gt; Görüntüleme

Biz pHluorin, pH-duyarlı yeşil flüoresan protein kullanarak bozulmamış adacıkları insülin ekzositozu görselleştirme için bir iletişim kuralı tanımlamak. İzole adacıkları adenovirus pHluorin vezikül kargo peptit Y birleştiğinde kodlama ile bulaşmış. Bu confocal mikroskobu tarafından insülin granül füzyon olayları algılama için sağlar.

Confocal peptit Y-pHluorin, görüntüleme: insülin granül ekzositozu olduğu gibi fare ve insan adacıkları görselleştirmek için bir teknik

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Ex vivo pankreas adacık çalışmalar diyabet araştırma için önemlidir. Onların yerli 3 boyutlu mimari kültürlü adacıkları çalışmaya varolan zaman alıcı, verimsiz ve az kullanılan tekniklerdir. Bu eser bütün kültürlü adacıkları yüksek kalitede parafin bölümleri oluşturmak için yeni, basit ve etkili bir yöntem açıklanır.

Pankreas adacık parafin kesitler için katıştırma

Burada, pankreas adacık hücreleri gibi heterojen hücre popülasyonlarında kalsiyum dinamiğinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için bir protokol saklıyız. Floresan muhabirler adacık içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir, daha sonra hareketsiz hale getirilir ve görüntülenir ve floresan yoğunluğunun dinamiğinin hücre başına analizi yapılır.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Bu protokolün amacı sürekli insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamikleri ve donör hücrelere karşı katkıda konak izlemektir. Bu bir NOD gözün ön odasına (ACE) insan adacıkları nakli ile gerçekleştirilir. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-fare alıcısı ve ardından tekrarlanan 2-foton görüntüleme.

Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal

Bu çalışma, canlı pankreas doku dilimlerinin adacık fizyolojisi ve adacık-immün hücre etkileşimlerinin incelenmesine uygulanmasını sunun.

Canlı Pankreas Doku Dilimlerinde Adacık fonksiyonu ve Adacık-İmmün Hücre Etkileşimlerinin Gözlemlenmesi

Pankreasın in vivo yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi pankreas intravital görüntüleme penceresi ile kolaylaştırıldı.

Pankreas intravital görüntüleme penceresine sahip bir Murine Modelinde Pankreasın Stabilize Boyuna In Vivo Hücresel Düzey Görselleştirmesi

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Öğrenin, Lepr Db farelerinden pankreas adacıklarını izole etme ve iki foton mikroskobisiyle canlı hücre görüntüleme yöntemini. Bu teknik, tip 2 diyabette insülin salınım mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

Lepr

Daha fazla video keşfet