Name: Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Öğrenin, poliakrilamid jelleri çok kuyulu plaka formatında hızlı ve ekonomik bir şekilde hazırlama yöntemini. Bu teknik, sertlik bağımlı hücre yanıtlarını incelemek için her laboratuvarın erişebileceği bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Saint Louis Üniversitesi tarafından Dr. Silviya Zustiak'a sağlanan başlangıç fonlarının yanı sıra Saint Louis Üniversitesi tarafından Dr. Silviya Zustiak'a verilen Başkanın Araştırma Fonu (PRF) hibesi ile finanse edilmiştir. Teknik yardım için Naveed Ahmed ve Keval Shah'a teşekkür ederiz.

Hidrojel-ilişkili Çözümleri ve Alikot 1. Hazırlık <ol><li> Poliakrilamid jel ön-madde çözeltisinin hazırlanması. <ol><li> Akrilamid, (A) karıştırılarak poliakrilamid jel ön-madde solüsyonu hazırlayın (w / v% 40, E r 71,08 g / Mol) ve çapraz bağlayıcı bisakrilamid (B), (a / h% 2, E 154,17 g / mol r), ve tespit edilen Tablo 1 &#39;de belirtilen hacim yüzdeleri ile iyonize su. NOT: Bu çözümler büyük partiler halinde hazırlanır ve birkaç aya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. <ol><li> DİKKAT: Akrilamid inhalasyon veya sindirim üzerine toksik olan, özellikle toz biçiminde olduğunda: bu durumda, tercihan, toksisite riskleri azaltmak / v solüsyonu ağırlık% 40 kullanılır. Eldiven, gözlük, ve bir laboratuvar önlüğü gibi, koruyucu giysiler giyerek sadece süre taşıyınız. Buzdolabında bir ışık dayanıklı, sıkıca kapalı bir kapta saklayın (&lt;23 ° C, bölgeyi iyi havalandırılmış). </li><li> DİKKAT: Bis-akrilamid, özellikle, inhalasyon ya da sindirim üzerine toksikzaman toz biçiminde: bu durumda, tercihan, toksisite riskleri azaltmak / v solüsyonu% 2 w kullanılır. Eldiven, gözlük, ve bir laboratuvar önlüğü gibi, koruyucu giysiler giyerek sadece süre taşıyınız. Buzdolabı (&lt;4 ° C, iyi havalandırılmış alan) bir ışık dayanıklı, sıkıca kapalı bir kapta saklayın. </li></ol></li></ol></li><li> Hazırlama ve N -Sulfosuccinimidyl-6- (4&#39;-azido-2&#39;-nitrofenilamino) heksanoat kullanım bölümü (Sülfo-SANPAH, E 492,40 g / mol r). DİKKAT: Sulfo-SANPAH Ciddi göz tahrişine neden olur; eldiven ve uygun göz ve yüz koruması ile anlaştım. Mağaza aldıktan sonra -20 ° C&#39;de ve önceki şişelemeden. <ol><li> Sülfo-SANPAH saklamak için: 50 mg / ml dimethylsulfoxane (DMSO) içinde Sülfo-SANPAH çözülür. Tüp başına 20 ul 50 mikro santrifüj tüplerine stok çözeltisi alikosu. Kuru buz veya sıvı azot içinde hızlı dondurma -80 ° C&#39;de ve mağaza (maksimum çapraz bağlayıcı verimliliği korumak için bir seçime bağlı, fakat tercih edilen bir aşaması). NOT: tümbölenler can birkaç ay boyunca saklanabilir. </li><li> Sülfo-SANPAH kullanmak için: kısım kısaca çözülme ve deiyonize su içinde 480 ul seyreltin. Hemen kullanın. Sulfo-SANPAH suda hızlı hidrolize: bu nedenle hızlı bir şekilde yukarıdaki tüm adımları gerçekleştirmek için dikkat çekmek. </li></ol></li><li> Amonyum persülfat (M r 228,18 g / Mol) alikotları hazırlanması. NOT: Amonyum persülfat göz, cilt ve solunum tahriş olmasına neden olur. Işlerken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Bir kimyasal davlumbaz amonyum persülfat tozu Kolu. Kuru, iyi havalandırılan bir yerde saklayın tozu. Aliquoted sonra, seyreltik çözelti çalışma tezgahı üzerinde kullanılabilir. <ol><li> Ağ / hac% 10&#39;luk bir nihai amonyum persülfat konsantrasyonu elde etmek için deiyonize su içinde amonyum persülfat çözülür. -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza. Kullanımdan hemen önce çözülme. </li></ol></li><li> Kolajen Tip I çözeltisinin hazırlanması. <ol><li> Böylece stok seyreltilmesi ile 0.2 mg / ml kollajen çözüm hazırlayınpH 7.4 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde dökülmesinden. Buz kısaca Mağaza veya seyreltme üzerine hemen kullanın. </li></ol></li></ol> 2. Hidrojel Hazırlık (Şekil 1&#39;e bakın) <ol><li> Hidrofobik cam slaytların hazırlanması. <ol><li> Bir cam plaka üzerine bir hidrofobik çözeltisinin bir kaç damla yerleştirin ve yüzey boyunca yaymak için kağıt mendil kullanmayın. Hava kurumasını bekleyin ve hidrofobik kaplama bile dışarı tekrar kağıt mendil ile silin. NOT: oda sıcaklığında bir yanıcı kabine saklayın hidrofobik bir çözüm. Kullanırken kişisel koruyucu ekipman kullanın. Iyi havalandırılan bir alanda çalışın. </li></ol></li><li> Esnek plastik destek hazırlanması. <ol><li> Hidrofobik kaplı cam plakanın boyutuna uyacak şekilde esnek plastik desteği kesti. </li><li> Hafifçe böyle bir neşter gibi keskin bir aletle yüzeyi çizilmeye esnek plastik destek hidrofobik yan işaretleyin. NOT: jel kez - tamamen şeffaf - kurur, Çizikleri esnek plastik destek tarafı jel içeren ayırt yardımcı olacaktır. Not: esnek plastik destek, bir hidrofobik ve hidrofilik bir tarafa sahiptir. Bir kez yatırılır, poliakrilamid kalıcı kolay sonraki hidrojel kullanımını kolaylaştırır plastik desteğin hidrofilik tarafına yapışır. </li></ol></li><li> Jel Hazırlanması (örneğin, miktarlar 5 ml jel prekürsör çözeltilerinde için verilmiştir). Not: jel başlangıç ​​kalınlığı, 0.5 mm olduğunda 5 mi ~ 40 jeller üretmek için yeterli olacaktır. Jel kalınlığı azalır, daha fazla jeller elde edilebilir. <ol><li> 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde arzu edilen nihai konsantrasyonu (Tablo 1) poliakrilamid ön-madde çözeltisi 4972,5 ul koyun. Açılan bir kapakla 30 dakika boyunca bir gaz tahliye açıklığının yerleştirin. NOT: Oksijen serbest radikal tuzak gibi davranır ve mevcut, polimerizasyonu inhibe eder. </li><li> Amonyum persülfat ağ / hac% 10, 25 ul ekle nihai elde etmek için (1.3 noktasına bakınız)% 0.05 amonyum persülfat konsantrasyonu. </li><li> N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiamin 2.5 ul ekle% 0.5 bir son TEMED konsantrasyon elde etmek için gazı giderilmiş jel çözeltisine (TEMED, E 116,24 g / mol r). NOT: Mağaza TEMED oda sıcaklığında bir yanıcı kabine içinde. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyen zaman kimyasal davlumbaz taşıyınız. Bu yüksek ölçüde hava ve neme duyarlı olduğu gibi sıkı bir atıl gaz altında kapalı tutun. </li><li> 5 kez - aşağı yukarı 3 pipetleme ve hafifçe karıştırın çözüm. Jel habercisi çözüm içine oksijen difüzyon önlemek için vorteks etmeyin. </li><li> Hidrofobik kaplamalı cam slayt ile esnek plastik destek ve sandviç hidrofilik yüzüne jel çözümü Pipet. Istenilen kalınlıkta (örneğin, 0.5 mm), silikon ayırıcılar ile iki slayt ayırın. Jelleşme bir göstergesi olarak kullanmak için 50 ml konik bir tüp içinde bir polimer ön-madde ile az bir miktar (~ 100 ul) bırakın. NOT:Herhangi bir boşluk kullanılabilir. 120 um - Örneğin, Parafilm tek bir şerit, bir son 100 şişmiş jel kalınlığı sağlar. </li><li> Polimerizasyon üzerine düz bir hidrojel yüzeye tespit esnek plastik destek / jel sandviç üstüne başka bir cam plaka yerleştirin. </li><li> Arzu edildiği takdirde daha az zaman daha yüksek bir ağırlık% &#39;si arasında jeller için kullanılabilir olmasına rağmen, jel, 45 dakika boyunca polimerize olsun. Jel polimerize olduğunu tespit etmek için, 50 ml konik tüp içinde kalan çözümü gözlemlemek; Geri kalan çözelti, jel ise, o zaman cam plaka üzerine jelasyon de başlatılmıştır olasıdır. Bununla birlikte, kalıp erken açılması tam bir polimerizasyonu engellemek unutmayın. </li><li> Jel oluşturulduktan sonra, üstte kovalent bağlı bir poliakrilamid jeli ile esnek plastik destek soyulabilir ve kuru hava jel tarafı yukarıya ayarlanır. Not: konveksiyon veya sıcak kurutma bu basamağını hızlandırmak için kullanılabilir. Esnek plastik destek üzerine kurutulmuş sonra, jel deposu olabilirsüresiz d. <ol><li> Poliakrilamid jeller kabarcıkları nedeniyle formu vermedi esnek plastik desteği, herhangi bir çıplak noktalar işaretleyin. Jel kuruduktan sonra bu esnek plastik desteği ile uyum gibi işaretle jel hala sulu ise. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. multiwell plaka Meclisi, Kollajen Kaplama ve Sterilizasyon <ol><li> Multiwell plakası montaj. <ol><li> Bir kez kurutulduktan sonra, arzu edilen şekillerde PA jeller kesti. <ol><li> 96 oyuklu bir plaka için, ~ 6 mm bir çapı olan bir ağır-iş delik kullanımı. Kare veya dikdörtgen şekiller halinde jeller kesmek için bir ağır kağıt kesici kullanın. Seçenek olarak ise, makas kullanın. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak 96-çukurlu plaka başına PDMS yaklaşık 500 ul hazırlayın. Çok oyuklu bir plaka tabanına jeller tutkal için, her bir göze merkezinde küçük damlacık polidimetilsiloksan (PDMS), (± 5 ul) yerleştirin. Forseps kullanarak, bir poliakrilamid yerleştirinaşağı her iyi, esnek plastik destek tarafında e jel. PDMS, tedavi, 4 saat, en az 37 ° C &#39;de Prefabrik levha bırakmak için izin verilmesi. </li></ol></li><li> Poliakrilamid jellerin Kollajen kaplama. <ol><li> Bir transfer pipet, küçük bir miktar koyun - sülfo-SANPAH (7 8 ul) jel yüzeyi eşit şekilde kaplamak için yanlara iyi ve girdap her (1.2.2 noktasına bakınız). Sülfo-SANPAH suda stabil olmadığından derhal çalışın. </li><li> 5 dakika boyunca - (365 nm, yoğunluk = 37 mW λ = 302), yüksek yoğunluklu UV lambası altında plaka yerleştirin. Aşırı sülfo-SANPAH kaldırmak için PBS ile jeller durulayın. </li><li> 50 ul 0.2 mg Pipet / ml kolajen Tip I çözelti, her oyuğa (1.4 noktasına bakınız). 4 ° C&#39;de en az 2 saat ya da O / N, oda sıcaklığında kapalı plaka bırakın. NOT: kolajen kaplama sürecini hızlandırmak için, bir transfer pipet kollajen çözümü eklemek için kullanılabilir. Genellikle, 1 - çözümün 2 damlacıkları tamamlamak için yeterli olmalıdırly jel yüzeyini kaplayan. </li><li> Kollajen bağlanmasını sağlamak üzere, en az 2 saat boyunca oda sıcaklığında plaka bırakın. </li><li> 2 saat boyunca bir doku kültür başlığı içinde fazla kolajen çözeltisi çıkarın ve UV (λ = 200 nm) altında sterilize etmek için PBS ile durulayın. </li><li> Nemlendirmek ve dengelenmeye O / N (orta bileşim için bölüm 4.1 bakınız) tam orta jeller bekletin. Hücre kadar 2 gün boyunca buzdolabında hemen veya mağaza ekim için kullanın. </li></ol></li></ol> Pensilvanya Sertlik Testi 4. Hücre Tohumculuk Not: ortak memeli hücre çizgileri için tipik olmakla birlikte, bu bölümde tarif protokolü özellikle meme kanseri MDA-MB-231 hücre çizgisi ile birlikte kullanılır (bakınız Şekil 4 ve 5). <ol><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca,% 5 tripsin / EDTA maruz bırakılarak doku kültür şişesi ile ilgili hücreler toplanır. Kültür şişesi alanının her cm 2 başına tripsin / EDTA ~ 80 ul kullanın; Örneğin fo tripsin / EDTA 2 ml kullanmakra T25 hücre kültürü şişesi. Yeniden askıya arzu edilen bir nihai hücre konsantrasyonunda% 10 cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş tam ortam içinde toplanan hücreler. Hesap zamanı iki katına hücrenin yanı sıra hücreler tahlil numaralı seribaşı olacak zamanın uzunluğu dikkate alındığında, uygun bir alt birleşik hücre konsantrasyonunu seçin. Eklenen ortam tamamen hidrojeller batığın için yeterli olduğundan emin olun. Not: hidrojeller ortam içinde önceden-dengelenmiş olan bu yana yeterli olmalıdır 100 ul hacim (3.2.6 aşama bakınız). Jeller, önceki adımda ortam içinde önceden-dengelenmiş olan bu yana çukurlu bir levha için kullanılan tipik ortam hacimleri için yeterli olmalıdır. NOT: deney herhangi bir bağlantı bağımlı bir hücre tipi için uygun olacaktır. <ol><li> Bir hemasitometre kullanarak bir ters mikroskop altında hücre sayısı. Yük 10 her hemasitometre portuna hücre süspansiyonu ul ve en az 8 kadran hücre sayısını ortalama. Almak içinNihai hücre konsantrasyonu, 10 4 hücre sayısını çarpın. NOT: Her hemasitometre kadranda hücre sayısı 20 olduğunda iyi hücre sayımı sonuçları elde edilir - 50. </li></ol></li><li> Kültür, 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde PA sertlik deneyi üzerine hücre ve% 5 CO2. 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de% 5 tripsin / EDTA maruz bırakılarak gerektiğinde hücreler toplanır. Doku kültür şişesi cm2 tripsin / EDTA ~ 80 ul kullanın. Biraz yanlara çukurlu plaka devrilme ve hidrojel dokunmadan aksine, her bir yan duvarına üzerine pipet dokunarak aspire veya pipet orta: Tüm hücre manipülasyon adımları sırasında, özel hidrojel yüzeyi bozmayacak özen gösterin. NOT: standart doku kültürü taşıma sırasında hidrojel yüzeye zarar vermemeye özel özen dışında, hücreler üzerinde seribaşı sanki sertlik deneyi aynı şekilde manipüle edilebilir üzerine numaralı seribaşınormal bir çok-yuvalı plaka. </li></ol> Pensilvanya Sertlik Testi üzerine Tohumlu Hücre 5. Görüntüleme <ol><li> Doğrudan PA sertlik deneyi Görüntü hücreleri. NOT: Herhangi bir mikroskop - ters, floresan veya konfokal, hücre görüntüleme için kullanılabilir. Not: sertlik deneyi oluşturmak için kullanılan esnek bir plastik destek tamamen saydam olan ve autofluoresce veya hücre görüntüleme ile karışmaz. Bununla birlikte, esnek plastik desteğin kendisi şeffaf olsa bile, görüntüleme yetenekleri amacı çalışma mesafesi ile sınırlı olacaktır. Esnek plastik destek keskin yüksek büyütme için azalan, 0.23 mm kalınlığında ve 10X objektif bir tipik çalışma mesafesi ~ 4 mm vardır. <ol><li> Canlı hücre görüntüleme için, mikroskop plaka tutucu ve görüntüde pozisyon PA sertlik deneyi. 2 saat altında görüntüleme oturumları tutun, ya da daha uzun görüntüleme kez bir çevre odasına sahip bir mikroskop kullanmak. </li><li> Ne zaman canlı hücre imyaşlanma amaç değil,% 0.1 deterjan ile takviye% 4 formaldehit çözeltisi içinde hücreler düzeltmek. 2 saat içinde en az oda sıcaklığında sabitleyici hücreleri bekletin. PBS ile iki kez durulayın. Belirlenmiş bir çöp bidonuna sabitleyici atık atın. Not: Hücreler hemen görüntülenebilir ya da 2 hafta süre ile, 4 ° C&#39;de PBS içinde batık saklanan. DİKKAT: Formaldehit Teneffüs ve temas halinde toksiktir. Bir kimyasal davlumbaz eldiven kullanınız. NOT: Belirli fiksatifler bazı hücre proteinlerini zarar nedeniyle Hücre tespit protokolü, daha sonra hücre boyama ve işleme protokolleri dayalı seçilmelidir. </li><li> Floresan görüntüleme için, leke multiwell plaka doğrudan istenen hücre boyası ile hücrelerin sabit. Görüntü hemen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+biological+materials+and+their+impact+on+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Soft biological materials and their impact on cell function.</a> Soft Matter. 3, 299-306 (2007).</li>
<li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+A+stiff+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: A stiff response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).</li>
<li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Watt, F. M., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+in+regulating+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).</li>
<li>Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiwell+stiffness+assay+for+the+study+of+cell+responsiveness+to+cytotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs.</a> Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).</li>
<li>Mih, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiwell+platform+for+studying+stiffness-dependent+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology.</a> PLoS One. 6 (5), e19929(2011).</li>
<li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PloS one. 7 (10), e46107(2012).</li>
<li>Herrick, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).</li>
<li>Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+matrix+elasticity+with+PEG+hydrogels+to+study+melanoma+drug+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness.</a> Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffness+influences+the+outcome+of+antitumor+drug+screening+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+hemorheology+and+microcirculation%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro.</a> Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).</li>
<li>Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Three-Dimensional+Matrix+Stiffness+in+Regulating+the+Response+of+Human+Neural+Cells+to+Toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS one. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Gobaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+niche+microarrays+for+probing+single+stem+cell+fate+in+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput.</a> Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).</li>
<li>Kumachev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+hydrogel+microbeads+with+varying+elasticity+for+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation.</a> Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).</li>
<li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+cell+function+with+geometrically+modulated+elastomeric+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates.</a> Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTse%2C+JR+%22Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]</a>. 10 (Unit 10 16), (2010).</li>
<li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li>
<li>Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+adipogenesis+of+adult+adipose-derived+stem+cells+using+substrates+that+mimic+the+stiffness+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue.</a> Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).</li>
<li>Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hepatocellular+morphogenesis+and+function+via+ligand-presenting+hydrogels+with+graded+mechanical+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance.</a> Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+mechanical+communication+through+compliant+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Cell-cell mechanical communication through compliant substrates.</a> Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).</li>
<li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li>
<li>Quinlan, A. M., Billiar, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+role+of+substrate+stiffness+in+the+persistence+of+valvular+interstitial+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolytically+degradable+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogel+scaffolds+with+tunable+degradation+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).</li>
<li>Chrambach, A., Rodbard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Science. 172 (3982), 440-451 (1971).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+substrate+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review.+E%2C+Statistical%2C+nonlinear%2C+and+soft+matter+physics%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of substrate thickness.</a> Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918(2010).</li>
<li>Chrambach, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChrambach%2C+A+%22The+Practice+of+Quantitative+Gel+Electrophoresis%22">The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis</a>. , (1985).</li>
<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
<li>Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+generating+patterned+co-cultures+with+stable+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces.</a> BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).</li>
<li>Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+molecules+and+fibronectin-mediated+cell+adhesion%3A+effect+of+proteolytic+digestion+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins.</a> The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).</li>
<li>Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creasing+instability+of+surface-attached+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Creasing instability of surface-attached hydrogels.</a> Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).</li>
<li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+creasing+instability+of+soft+polyacrylamide+cell+culture+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates.</a> Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).</li>
<li>Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+force+microscopy+on+elastic+layers+of+finite+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness.</a> Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Başlangıçta elektroforez için geliştirilen Poliakrilamid jeller, 28 şimdi rutin hücre morfolojisi, hareketliliği ve diğer hücre özellikleri arasındaki iletişimi 3,24,29 tarihinde substrat sertlik etkilerini incelemek için hücre kültürü substrat olarak kullanılır. (Şekil 2, Tablo 1 &#39;de referans 17,25,26 bakınız) polimer ön-madde konsantrasyonu basit bir değişiklikle - (300 kPa 0.3) 1 Poliakrilamid alt-tabaka sertliğinin manipülasyon vücuttaki tüm yumuşak do...

Vücutta en dokular ~ 1 GPa arasında bir elastisite modülüne sahiptir 0.1 kPa ila yumuşak kıkırdağın 100 kPa beyin, ancak, in vitro hücre araştırmalarında en doku kültür polistiren (TCP) üzerinde gerçekleştirilmiştir arasında değişen bir Young modülüne sahip yumuşak viskoelastik malzemelerdir . 1 Bu sertlik uyumsuzluğu ölçüde hücreler çevrelerine cevap şeklini etkiler. Araştırma artan vücut, 2,3 kök hücreler de dahil olmak üzere. Bunun sonucunda 4 farklı hücre tiplerinin kaderi üzerinde tabaka sertlik etkisi açıklık böylece adanmış, birden hidrojeller sertlik-bağımlı hücre anlaşılmasına yardım için geliştirilmiştir Yüzey sertliği hücre kaderi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu kanıtlar büyürken poliakrilamidin (PA), 5-7 polietilen glikol (PEG), 8,9 polidimetilsiloksan (PDMS), 10 ve aljinat içeren biyoloji. 11, en ​​çalışmalar yürütülmektedir s az sayıda küçük ölçekliörnekleri şunlardır:. Hücre tipleri veya çevresel koşullar nadir bir dizi için substrat sertlik etkisi sistematik, çok boyutlu çalışmalar. 12 Çok ümit vaat eden yüksek verimli hidrojel teknolojisi PEG-bazlı microarrays, sertlik microrods çapı ve yüksekliği ile modüle edilen agaroz hidrojel mikro, 14 ya da mikro ve nano çubuklar üretim için 13 mikroakışkan cihazlar da dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. 15 Ancak , teknolojileri, yüzeyler sofistike ve laboratuvarların sınırlı sayıda mevcuttur hazırlamak. Sertliği modüle hücre yanıtları kapsayan pek çok araştırma uygulanması, aynı zamanda Young&#39;ın modülü, yani 0.3 fizyolojik olarak uygun bir aralığı gösteren sadece ucuz ve basit değildir, poliakrilamid (PA) jelleri kullanan -. 300 kPa 16-22 Ancak, PA imalatı için yöntem Mevcut Hücre kültürü için jeller, emek yoğun ve dolayısıyla hazırlık vardırKüçük gruplar halinde ared. Hücre alt-tabakalar olarak PA jellerin hazırlanması ile ilgili zorluklardan bazıları jeller hazırlanacak olması şartı kaynaklanmaktadır: 1) oksijen yokluğunda tam polimerizasyona olanak sağlamak için, 2), düz ve pürüzsüz bir yüzeye sahip tek tip hücre olanak sağlamak üzere eki ve yayma, ve 3) kalıcı yüzen önlemek için hücre kültürü çanak altına yapıştırılmıştır. Çeşitli gruplar, büyük gruplar halinde hücre kültürü için PA jeller üretmek için çalıştılar. Semler ve diğ., Bir delikli zımba ile daha sonra &quot;kesme&quot; ve 96 oyuklu plakalara yerleştirildi PA jeller hazırlanmış kalın levhalar. 23 Bununla birlikte, bu yöntem, katı jeller, örneğin,&gt; 1 kPa bir Young modülü de, yumuşak, çünkü sınırlıdır jeller, kesmek zor, ve kolayca zarar &quot;yapışkan&quot; bulunmaktadır. MIH ve diğ., Jeller, doğrudan bir cam alt oyuklu bir plaka içinde polimerize edilmesini sağlar, daha gelişmiş bir teknik geliştirdi. <skadar&gt; 6 Bu fonksiyonlaşmış cam alt tabak içine jel çözümleri dökme ve özel coverglass dizi ile &quot;sandviç&quot; tarafından jeller oluşturarak elde edildi. 6 olsa çok umut verici, hafif kenar etkileri hala bu teknikle gözlendi. Ayrıca, teknik, birçok laboratuvarlar yanı sıra pahalı cam alt çukurlu plakalara hemen erişilebilir bir özel tasarlanmış bir dizi gerektirir. Bu kağıt kolayca herhangi bir laboratuar tarafından kabul edilebilir bir multiwell plaka PA jeller araya için basit ve ucuz bir şekilde anlatılmaktadır. Itici PA jeller olan bir hidrofobik on, ve kovalent birikmesi üzerine PA jel bağlayan hidrofil bir on, - Burada, esnek bir plastik destek iki tarafı sahip olan kullanılır. PA jel yaprak esnek plastik bir desteğe tespit sürekli yatırılır ve sonra, herhangi bir kalınlığı ya da sertlik jeller kullanım ve arzu edilen herhangi bir şekil olarak kesilmesi mümkün kılar. Bu yakloach bir PA bağlayıcı çözelti ile, cam lamelleri ya da pahalı cam alt çukurlu plakaların kuyu ya aksi takdirde piyasada mevcut değil boyutlarda özel plastik &#39;lamelleri&#39; üreten, aynı zamanda cam yüzeyler-tedavi öncesi gerekliliğini ortadan kaldırır sadece sıkıcı ve zaman alıcı bir adım. Son olarak, tek tip PA jeli yaprak büyük partiler halinde hazırlandı ve birkaç ay süreyle de hidratlanmamış saklanabilir. Özetle, burada sunulan tahlil çeşitli yönleriyle mevcut yöntemlere göre bir gelişmedir. İlk olarak, çok oyuklu bir plaka montaj işlemi verimli ve gerekli malzemelerin toplam maliyeti düşüktür. İkinci olarak, hidrojeller tek bir homojen jel, film içinde büyük partiler halinde üretilmektedir. Son olarak, ticari olarak temin edilebilir, yalnızca malzeme gerekmektedir. Analizin yarar hücre morfolojisi üzerinde alt-tabaka sertliğinin etkisinin incelenmesi ve alan yayılması ile görüntülenmiştir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>40% Akrilamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>%2 Bis-akrilamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat</td><td>Bio-Rad</td><td>161-07000</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Sülfo-SANPAH</td><td>Termo Bilimsel</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen Tip 1, Sıçan kuyruğundan, 3.68 mg / ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik çözelti &#8212; Repel Silane</td><td>GE Sağlık Biyo-Bilimleri</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Polidimehidroksioksan (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kiti]</td><td>Elsworth Yapıştırıcılar</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tyrpsin/EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44174</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Orta (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>MP Biyomedikal</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Deterjan: Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit% 37 Çözelti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>BSA bazlı hücre yapışma engelleme kiti &#8212; ECM Hücre Yapışma Dizisi Kiti</td><td>Chemicon International</td><td>ECM540</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları</güçlü</td></tr><tr><td>>esnek plastik destek &#8212; Poliakrilamid Jeller için GelBond PAG Film</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>309819</td><td></td></tr><tr><td>Cam Plakalar</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>3181345107</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Mikro santrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 ml: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka (düz tabanlı)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Pipetler (1&nbsp; ml, 2&nbsp; ml, 5&nbsp; ml, 10&nbsp; ml, 25&nbsp; ml, 50&nbsp; ml)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>1 ml: 13-678-11B, 2&nbsp; ml: 05214038, 5&nbsp; ml (FALCON): 357529, 10&nbsp; ml: 13-678-11E, 25&nbsp; ML: 13-678-11, 50&nbsp; ml: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Cam Transfer Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Uçları (1-200&nbsp; &#956; l, 101-1000&nbsp; &#956; l)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Standart Tek Kullanımlık Transfer Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM ></td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Pudrasız Muayene Eldivenleri</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Silikon ara parçalar &#8212; Silikon levha, 0,5 mm kalınlık/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Büyük/tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Işık ve Floresan Mikroskop (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Yazılımı</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>UV fırın</td><td>UVITRON</td><td>UV1080</td><td></td></tr><tr><td>Vakum odası/gaz giderici</td><td>BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Gaz giderici için vakum pompası</td><td>KNF Lab</td><td>5097482</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Davlumbazı</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Çeker Ocak</td>, <td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr>, <tr><td>Ters Mikroskop (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatörü</td>, <td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Yardımı</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Hemasitometre</td><td>Parlak Çizgi</td><td>383684</td><td></td></tr></tbody></table>

basit poliakrilamid-tabanlı sertlik bağımlı hücre yanıtların Çalışmaları multiwell sertlik deneyi

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Şu anda, in vitro hücre araştırmalarının çoğu sert doku kültürü polistiren (~ 1 GPa) üzerinde gerçekleştirilirken, vücuttaki çoğu hücre elastik ve çok daha yumuşak (0.1 – 100 kPa) bir matrise bağlıdır. Bu tür sertlik uyumsuzluğu hücre tepkilerini büyük ölçüde etkilediğinden, hücre substratları olarak hizmet etmek için geniş bir sertlik aralığını kapsayan hidrojel malzemelerin geliştirilmesine büyük bir ilgi vardır. Ucuz olan ve vücuttaki tüm yumuşak dokuların sertlik aralığını kaplayan poliakrilamid jeller, birçok araştırma grubu için tercih edilen hidrojeldir. Bununla birlikte, poliakrilamid jel hazırlığı uzun, sıkıcıdır ve yalnızca küçük partiler için uygundur. Burada, jeller için yapısal bir destek olarak kalıcı esnek bir plastik film kullanarak, poliakrilamid jellerin çok kuyulu bir plaka formatında hazırlanmasını sağlayan bir testi açıklıyoruz. Teknik, mevcut yöntemlerden daha hızlı, daha verimli ve daha az maliyetlidir ve başka türlü mevcut olmayan özel boyutlarda jellerin hazırlanmasına izin verir. Herhangi bir özel ekipman gerektirmediğinden, yöntem herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kolayca benimsenebilir ve sertliğe bağlı hücre tepkilerini anlamaya odaklanan araştırmalarda özellikle yararlı olacaktır.

Poliakrilamid (PA) hidrojelleri yaygın sertlik bağımlı hücre tepkileri test etmek için kullanılır. 17,24 akrilamid, (A) ve bis-akrilamid (B) bir çok yumuşak dokuların sertlik aralığı içinde yayılan PA jeller yapabilir çeşitli konsantrasyonlarda karıştırarak gövde - 0.3 -.. Burada 300 kPa Young modülü 1 Bununla birlikte, bunlar, poliakrilamid jellerin hazırlanması sıkıcı ve zaman genellikle, örneğin, ilaç tarama gibi &quot;yüksek verim&quot; uygulamalarda faydalarını kısıtlayıcı, alıcı 12,</sup...

Burada, poliakrilamid jellerin çok kuyulu plaka formatında hızlı, verimli ve ucuz bir şekilde hazırlanmasını sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kolayca benimsenebilir. Sertliğe bağlı hücre tepkilerini anlamaya odaklanan araştırmalarda özellikle yararlı olacaktır.

Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

Bu prosedürün genel amacı, çok kuyucuklu plaka formatında poliakrilamid jellerin hızlı, verimli ve düşük maliyetli bir şekilde hazırlanmasını sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle jel öncül çözeltisinin, hidrofobik kaplı bir cam plaka ile akrilamid yapışkanlı esnek bir plastik destek arasına sıkıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, polimerizasyon sonrası esnek plastik desteğe kovalent olarak bağlanan jelin cam plakadan soyulması ve kurumaya bırakılmasıdır.Ardından, kuru jel ve altındaki esnek plastik destek istenen şekillerde kesilir ve plastik tarafı aşağı gelecek şekilde bir çok kuyucuklu plakadaki kuyucuk tabanlarına veya başka herhangi bir hücre kültürü kabına yapıştırılır. Son adım, çok kuyucuklu plakada birleştirilen poliakrilamid jellerin, tip 1 kollajen tek tabakası gibi bir hücre yapışkan kaplama ile kaplanmasıdır. Son aşamada, alttaki poliakrilamid substratın etkisini gözlemlemek için mikroskobinin yanı sıra diğer hücre karakterizasyon teknikleri kullanılır.Özellikle, sertliğinin hücre davranışları üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu yöntemin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, diğer yöntemlerin sağlamadığı şekilde, düşük maliyetli ve zaman açısından verimli bir yolla, herhangi bir sertlik ve kalınlıktaki polijellerin işlenmesine ve bunların çok kuyucuklu plaka formatında bir araya getirilmesine olanak tanımasıdır. Prosedürün gösterimi, laboratuvarımdaki bir öğrenci tarafından gerçekleştirilecektir.İlk olarak; akrilamid, çapraz bağlayıcı bis akrilamid ve deiyonize suyu karıştırarak poliakrilamid jel öncül çözeltisini hazırlayın; Sul OPA'yı dimetil sülfokside 50 mg/mL konsantrasyonda çözün. Stok çözeltiden 20 µL'lik miktarları 10 adet mikrosantrifüj tüpüne paylaştırın. Ardından çözeltileri sıvı azot ile şok dondurun ve -80 °C'de saklayın.Ardından, nihai amonyum persülfat konsantrasyonu hacimce ağırlıkça %10 olacak şekilde amonyum persülfatı deiyonize suda çözün. Amonyum persülfat çözeltisinden 25 µL'yi 10 adet mikro santrifüj tüpüne paylaştırın ve -20 °C'de saklayın. Tip 1 kolajen stok çözeltisini pH 7.4'te 1X PBS ile seyrelterek 0.2 mg/mL'lik bir kolajen çözeltisi hazırlayın.Tüm çözeltiler kullanıma kadar buz üzerinde bekletilir. Bu aşamada, cam bir plak üzerine birkaç damla hidrofobik çözelti damlatın ve yüzeye yaymak için kağıt havlu kullanın. Plakanın havada kurumasına izin verdikten sonra, hidrofobik kaplamayı eşitlemek için tekrar kağıt havlu ile silin.Esnek plastik desteği, hidrofobik kaplamalı cam plakanın boyutlarına uygun şekilde kesin. Ardından, esnek plastik desteğin hidrofobik tarafını, skalpel gibi keskin bir aletle yüzeyi hafifçe çizerek işaretleyin. Jel hazırlığı için, istenen nihai konsantrasyondaki 4972.5 µL poliakrilamid öncül çözeltiyi 50 mL'lik konik bir tüpe ekleyin.Tüpü, kapağı açık şekilde 30 dakika boyunca bir gaz giderme haznesine yerleştirin. Bunun ardından, nihai amonyum persülfat konsantrasyonu 0.05% olacak şekilde, önceden hazırlanmış amonyum persülfat çözeltisinden 25 µL miktarını DGA'lar jel çözeltisine ekleyin. Daha sonra, nihai TM ME konsantrasyonu 0.5% olacak şekilde 2.5 µL TM ME ekleyin. Çözeltiyi, pipetle üç ila beş kez yukarı aşağı çekerek nazikçe karıştırın. Ardından, istenilen kalınlıktaki silikon ara parçaları esnek plastik desteğin hidrofilik tarafına yerleştirin.Ardından jel çözeltisini, ara parçalar arasındaki esnek plastik destek üzerine pipetleyin ve hidrofobik kaplı bir lam ile hafifçe sıkıştırın. Jelin 45 dakika boyunca polimerize olmasına izin verdikten sonra, üzerinde kovalent olarak bağlı poliakrilamid jel bulunan esnek plastik desteği soyun ve hava ile kuruması için jel tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Kuruma tamamlandığında, poliakrilamid jeli istenen şekillerde kesin.Jelleri çok kuyucuklu plakanın tabanına yapıştırmak için üretici talimatlarına uygun olarak 96 kuyucuklu plaka başına yaklaşık 500 microliters polimetilsilan hazırlayın. Pens kullanarak her kuyucuğun merkezine küçük bir damla polimetilsilan yerleştirin. Her kuyucuğa bir poliakrilamid jel, esnek plastik destek tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin.Polidimetilsiloksan kürlendikten sonra, daha önce hazırlanmış selüloz örneğinden küçük bir miktarı bir transfer pipeti yardımıyla her kuyucuğa yerleştirin ve jel yüzeyini eşit şekilde kaplamak için yanlara doğru çalkalayın. Kuyucuk plakasını beş dakika boyunca yüksek yoğunluklu bir UV lambasının altına yerleştirin. İşlem tamamlandığında, fazla selülozu uzaklaştırmak için jelleri PBS ile durulayın.Bu pipeti kullanarak, önceden hazırlanmış Tip 1 kolajen çözeltisinden her bir kuyucuğa yaklaşık 50 µL ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında en az iki saat boyunca kapalı tutun ve ardından fazla kolajen çözeltisini uzaklaştırmak için PBS ile yıkayın. Gelleri, bir doku kültürü kabininde UV ışığı altında iki saat boyunca sterilize edin.Son olarak, jelleri hidrate etmek ve dengelemek için gece boyunca tam besi yerinde bekletin. Jelleri hücre ekimi için hemen kullanın veya buzdolabında iki güne kadar saklayın; birkaç akrilamid ve bis-akrilamid konsantrasyonunun (sırasıyla A ve B olarak belirtilmiştir) bir fonksiyonu olarak Young modülünün beklendiği üzere gösterimi burada sunulmuştur.Hem depolama modülü G' hem de kayıp modülü G'', frekanstan bağımsızdır. Ayrıca, jellerin kurutulup ardından yeniden hidrate edilmesinin Young modüllerini etkilemediği doğrulanmıştır. Çapraz bağlayıcı Sulo sampa kullanılarak, herhangi bir sertlikteki hidrojeller üzerinde homojen bir kolajen kaplama elde edilebilir.Meme kanseri M-D-A-M-B 2 31 hücrelerinin poliakrilamid jeller üzerine 24 saat boyunca ekildiklerinde, 0,5 ve 1 kilo pascal'lık yumuşak jellerde yuvarlak kaldıkları; ancak 100 kilo pascal'lık sert jelde yayılıp uzayabildikleri gözlemlenmiştir. Ayrıca, esnek plastik destek üzerine hazırlanan hidrojeller şeffaftır ve kolay görselleştirme ile mikroskopiye olanak tanır. Dahası, esnek plastik destek oto floresans göstermez ve dolayısıyla floresan işaretli hücrelerin görüntülemesine müdahale etmez.Hücre morfolojisi, genel hücre yayılım alanı ve hücre daireselliği açısından daha detaylı olarak nicelendirilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, çok kuyucuklu plaka formatında poliamid jellerin ne kadar verimli ve düşük maliyetle nasıl hazırlanabileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sertliğe bağlı hücre biyolojisi çalışmaları için.

simple-polyacrylamide-based-multiwell-stiffness-assay-for-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hücresel fonksiyonları katmanlarından sertlik etkisi modellenmiş...

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

İşte biz cep sertliği ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşımın genel prensip hücre yüzeyine bir mikropipet yoluyla uygulanan iyi tanımlanmış bir negatif basınca tepki olarak zar deformasyon ölçmektir. Bu yöntem substrat bağlı hücrelerin biyomekanik özelliklerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Bu videoda, hücre dışı matris (ECM) sertliğinin yapışık hücrelerin bakteriyel enfeksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için bir test gösterilmektedir. Kollajen ile kaplı, değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller, fizyolojik ECM'nin sertliğini taklit etmek için çok kuyulu bir plaka içinde katmanlanır. İnsan endotel hücrelerinin hidrojeller üzerine yerleştirilmesi ve hücrelerin hücre içi bir kez floresan proteini eksprese etmek üzere tasarlanmış Listeria monocytogenes bakterileri ile...

Hücre Dışı Matriks Sertliğinin Bakteriyel Enfeksiyon Üzerindeki Etkisini İncelemek İçin Bir Test

Bu videoda, hücre dışı matris sertliğine bağlı Listeria monocytogenes'in endotel hücreleri yoluyla yayılımını değerlendirmek için kantitatif hızlandırılmış mikroskopi gösterilmektedir. Daha yumuşak bir hidrojel, daha sert muadillerine kıyasla endotel hücreleri yoluyla daha hızlı bakteri yayılımını kolaylaştırır ve matris sertliğinin bakteri yayılımı üzerindeki etkisini vurgular.

Hücre Dışı Matriks Sertliğine Bağlı Bakteri Yayılımını Değerlendirmek için Kantitatif Hızlandırılmış Mikroskopi

Tümörün mikro mekanik sertliği invadopodia aktivitesini artırarak ve kasılma actomyosin ile malign davranış sürüş önemli bir rol oynar. Kullanma poliakrilamid jelleri (PAAS) invadopodia ve çekiş kuvveti deneyleri bükülmezlik matris yanıt olarak kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini incelemek için kullanılabilir.

Kanser Hücreleri üzerindeki Invadopodia ve Çekiş Gücü Tahliller için poliakrilamid jeller

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Yüzeyler ile sertlik kilopascal aralıktaki hücreler yanıt fizyolojik ilgili mikro-çevre sertlik olarak çalışmaya yararlıdır. Sadece bir widefield floresan mikroskop kullanarak, yumuşak silikon jelleri, Young katsayısı ile uygun bir küre bir girinti kullanarak belirlenebilir.

Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Çok güçlü O9-1 nöral kret hücreleri ve değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller kullanılarak in vitro mekanik sinyallerin incelenmesi için ayrıntılı adım adım protokoller burada açıklanmıştır.

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

Engineered Kalp Doku İmplantasyonu takiben İmmün Yanıtların Değerlendirilmesi (EHT) Biyoparlaklık Görüntüleme

Öğrenin, poliakrilamid jelleri çok kuyulu plaka formatında hızlı ve ekonomik bir şekilde hazırlama yöntemini. Bu teknik, sertlik bağımlı hücre yanıtlarını incelemek için her laboratuvarın erişebileceği bir platform sunar.

Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Daha fazla video keşfet