Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, poli akrilamid jellerin çok kuyulu bir plaka formatında hızlı, verimli ve ucuz bir şekilde hazırlanmasını sağlamaktır. Bu, hidrofobik kaplı bir cam plaka ile bir akrilamid yapıştırıcı esnek plastik destek arasındaki jel öncü çözeltisi olan ilk sandviçleme ile gerçekleştirilir. İkinci adım, polimerizasyon üzerine esnek plastik desteğe kovalent olarak bağlanan jeli cam plakadan soymak ve kurumaya bırakmaktır.

Daha sonra, kuru jel ve alttaki esnek plastik destek, istenen şekillerde kesilir ve plastik tarafı aşağı bakacak şekilde çok kuyulu bir plakanın veya başka bir hücre kültürü kabının kuyu tabanlarına yapıştırılır. Son adım, çok kuyulu plakaya monte edilmiş poli akrilamid jelleri, tek katmanlı bir kollajen tipi gibi bir hücre yapışkan kaplama ile kaplamaktır. Sonuç olarak, altta yatan poli akrilamid substratın etkisini gözlemlemek için mikroskopi ve diğer hücre karakterizasyon teknikleri kullanılır.

Özellikle, hücre davranışları üzerindeki sertliği. Bu yöntemin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, polijellerin herhangi bir sertliğinin ve kalınlığının yanı sıra bunların çok kuyulu bir plaka formatında, düşük maliyetli ve zaman açısından verimli bir şekilde, diğer yöntemler tarafından karşılanmayan bir şekilde birleştirilmesine izin vermesidir. İşlemin gösterilmesi laboratuvarımda öğrenci olarak yapılacaktır.

İlk olarak, akrilamid, çapraz bağlayıcı bis akrilamid ve deiyonize su, Sul OPA'yı mililitre başına 50 miligramda dimetil sülfo içinde karıştırarak poli akrilamid jel öncü çözeltisini hazırlayın. 20 mikrolitre stok çözeltisini 10 mikro santrifüj tüpüne alın. Daha sonra yanıp sönün, çözeltileri sıvı nitrojen içinde dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Daha sonra, hacimce ağırlıkça %10'luk sülfat konsantrasyonu başına nihai bir amonyum elde etmek için sülfat başına amonyumu deiyonize suda çözün. Eloqua sülfat çözeltisi başına 25 mikrolitre amonyumu 10 mikro santrifüj tüpüne koyun ve negatif 20 santigrat derecede saklayın. Kollajen tip bir stok çözeltisini pH 7.4'te bir XPBS'de seyrelterek mililitre kollajen çözeltisi başına 0.2 miligramlık bir hazırlayın.

Tüm çözeltiler kullanılana kadar buz üzerinde tutulur. Bu noktada, bir cam tabağa birkaç damla hidrofobik solüsyon damlatın ve yüzeye yaymak için kağıt mendil kullanın. Plakanın kurumasına izin verdikten sonra, hidrofobik kaplamayı eşitlemek için tekrar kağıt mendille silin.

Hidrofobik kaplamalı cam plakanın boyutuna uyacak şekilde esnek bir plastik destek kesin. Ardından, esnek plastik desteğin hidrofobik tarafını, neşter gibi keskin bir aletle yüzeyi hafifçe çizerek işaretleyin. Jel hazırlığı için, 50 mililitrelik konik bir tüpe istenen nihai konsantrasyonda 4972.5 mikrolitre poli akrilamid öncü çözeltisi ekleyin.

Tüpü, kapağı açık olarak 30 dakika boyunca bir gaz giderme odasına yerleştirin. Bunu takiben, sülfat başına %0,05'lik bir nihai amonyum konsantrasyonu elde etmek için DGA'nın jel çözeltisine sülfat çözeltisi başına önceden hazırlanmış 25 mikrolitre amonyum ekleyinArdından %0,5'lik bir nihai TM ME konsantrasyonu elde etmek için 2,5 mikrolitre TM me ekleyin Çözeltiyi üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. Ardından, esnek plastik desteğin hidrofilik tarafına istenen kalınlıkta silikon ara parçaları yerleştirin.

Ardından jel solüsyonunu, ara parçalar arasındaki esnek plastik desteğe pipetleyin ve hidrofobik kaplamalı cam sürgülü ışıkla sandviç yapın. Jelin 45 dakika polimerize olmasına izin verdikten sonra, üstüne kovalent olarak tutturulmuş poli akrilamid jel ile esnek plastik desteği soyun ve jel tarafı yukarı bakacak şekilde kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra poli akrilamid jeli istediğiniz şekillerde kesin.

Jelleri çok kuyulu bir plakanın dibine yapıştırmak için üreticinin talimatlarına göre 96 Kuyulu plaka başına yaklaşık 500 mikrolitre polimetil soan hazırlayın. Forseps kullanarak her kuyucuğun ortasına küçük bir Polimetil soane damlası yerleştirin. Her bir iyi esnek plastik destek tarafına bir poli akrilamid jel yerleştirin.

Poli dimetil suboxanı sertleştirdikten sonra, bir transfer pipeti ile her bir oyuğa önceden hazırlanmış selüloz sampadan az miktarda yerleştirin ve jel yüzeyini eşit şekilde kaplamak için bir yandan diğer yana döndürün. Kuyu plakasını beş dakika boyunca yüksek yoğunluklu bir UV lambasının altına yerleştirin. Bittiğinde, fazla çelloyu çıkarmak için jelleri PBS ile durulayın.

Bu pipeti takiben, daha önce hazırlanmış olan kolajenden yaklaşık 50 mikrolitre Tip bir solüsyon içine konulur. Fazla kollajen çözeltisini çıkarmak için PBS ile duruladıktan sonra plakayı en az iki saat oda sıcaklığında kapalı bırakın. Jelleri UV ışığı altında bir doku kültürü başlığında iki saat sterilize edin.

Son olarak, jelleri nemlendirmek ve dengelemek için gece boyunca tam ortamda bekletin. Hemen hücre oturması için jeller kullanın veya birkaç akrilamid ve bis'in bir fonksiyonu olarak iki güne kadar genç modülü buzdolabında saklayın. Sırasıyla A ve B olarak belirtilen akrilamid konsantrasyonları burada beklendiği gibi gösterilmiştir.

Hem depolama modülü G prime hem de kayıp modülü G çift prime frekanstan bağımsızdır. Jellerin kurutulmasının ve ardından yeniden sulandırılmasının gençlerin modülünü etkilemediği de doğrulandı. Crosslinker Sulo sampa kullanılarak, herhangi bir sertlikteki hidrojeller üzerinde homojen bir kollajen kaplama elde edilebilir.

Meme kanseri M-D-A-M-B 2 31 hücrelerinin 24 saat boyunca poli akrilamid jeller üzerine ekildiğinde, yumuşak 0.5 ve bir kilo paskal jeller üzerinde yuvarlak kaldığı, ancak sert 100 kilo paskal jel üzerinde yayılabildiği ve uzabildiği gözlendi. Ek olarak, esnek plastik desteğin üzerine yapılan hidrojeller şeffaftır ve kolay görselleştirme ve mikroskopi sağlar. Ayrıca, esnek plastik destek otomatik olarak floresan yaymaz ve bu nedenle floresan etiketli hücrelerin görüntülenmesine müdahale etmez.

Hücre morfolojisi, genel hücre yayılma alanı ve hücre döngüselliği açısından daha da ölçüldü. Bu videoyu izledikten sonra, poliamid jellerin çok kuyulu bir plaka formatında ne kadar verimli ve ucuz bir şekilde monte edileceğini iyi anlamalısınız. Sertliğe bağlı hücre biyolojisinin incelenmesi için.