Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, çok kuyucuklu plaka formatında poliakrilamid jellerin hızlı, verimli ve düşük maliyetli bir şekilde hazırlanmasını sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle jel öncül çözeltisinin, hidrofobik kaplı bir cam plaka ile akrilamid yapışkanlı esnek bir plastik destek arasına sıkıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, polimerizasyon sonrası esnek plastik desteğe kovalent olarak bağlanan jelin cam plakadan soyulması ve kurumaya bırakılmasıdır.

Ardından, kuru jel ve altındaki esnek plastik destek istenen şekillerde kesilir ve plastik tarafı aşağı gelecek şekilde bir çok kuyucuklu plakadaki kuyucuk tabanlarına veya başka herhangi bir hücre kültürü kabına yapıştırılır. Son adım, çok kuyucuklu plakada birleştirilen poliakrilamid jellerin, tip 1 kollajen tek tabakası gibi bir hücre yapışkan kaplama ile kaplanmasıdır. Son aşamada, alttaki poliakrilamid substratın etkisini gözlemlemek için mikroskobinin yanı sıra diğer hücre karakterizasyon teknikleri kullanılır.

Özellikle, sertliğinin hücre davranışları üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu yöntemin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, diğer yöntemlerin sağlamadığı şekilde, düşük maliyetli ve zaman açısından verimli bir yolla, herhangi bir sertlik ve kalınlıktaki polijellerin işlenmesine ve bunların çok kuyucuklu plaka formatında bir araya getirilmesine olanak tanımasıdır. Prosedürün gösterimi, laboratuvarımdaki bir öğrenci tarafından gerçekleştirilecektir.

İlk olarak; akrilamid, çapraz bağlayıcı bis akrilamid ve deiyonize suyu karıştırarak poliakrilamid jel öncül çözeltisini hazırlayın; Sul OPA'yı dimetil sülfokside 50 mg/mL konsantrasyonda çözün. Stok çözeltiden 20 µL'lik miktarları 10 adet mikrosantrifüj tüpüne paylaştırın. Ardından çözeltileri sıvı azot ile şok dondurun ve -80 °C'de saklayın.

Ardından, nihai amonyum persülfat konsantrasyonu hacimce ağırlıkça %10 olacak şekilde amonyum persülfatı deiyonize suda çözün. Amonyum persülfat çözeltisinden 25 µL'yi 10 adet mikro santrifüj tüpüne paylaştırın ve -20 °C'de saklayın. Tip 1 kolajen stok çözeltisini pH 7.4'te 1X PBS ile seyrelterek 0.2 mg/mL'lik bir kolajen çözeltisi hazırlayın.

Tüm çözeltiler kullanıma kadar buz üzerinde bekletilir. Bu aşamada, cam bir plak üzerine birkaç damla hidrofobik çözelti damlatın ve yüzeye yaymak için kağıt havlu kullanın. Plakanın havada kurumasına izin verdikten sonra, hidrofobik kaplamayı eşitlemek için tekrar kağıt havlu ile silin.

Esnek plastik desteği, hidrofobik kaplamalı cam plakanın boyutlarına uygun şekilde kesin. Ardından, esnek plastik desteğin hidrofobik tarafını, skalpel gibi keskin bir aletle yüzeyi hafifçe çizerek işaretleyin. Jel hazırlığı için, istenen nihai konsantrasyondaki 4972.5 µL poliakrilamid öncül çözeltiyi 50 mL'lik konik bir tüpe ekleyin.

Tüpü, kapağı açık şekilde 30 dakika boyunca bir gaz giderme haznesine yerleştirin. Bunun ardından, nihai amonyum persülfat konsantrasyonu 0.05% olacak şekilde, önceden hazırlanmış amonyum persülfat çözeltisinden 25 µL miktarını DGA'lar jel çözeltisine ekleyin. Daha sonra, nihai TM ME konsantrasyonu 0.5% olacak şekilde 2.5 µL TM ME ekleyin. Çözeltiyi, pipetle üç ila beş kez yukarı aşağı çekerek nazikçe karıştırın. Ardından, istenilen kalınlıktaki silikon ara parçaları esnek plastik desteğin hidrofilik tarafına yerleştirin.

Ardından jel çözeltisini, ara parçalar arasındaki esnek plastik destek üzerine pipetleyin ve hidrofobik kaplı bir lam ile hafifçe sıkıştırın. Jelin 45 dakika boyunca polimerize olmasına izin verdikten sonra, üzerinde kovalent olarak bağlı poliakrilamid jel bulunan esnek plastik desteği soyun ve hava ile kuruması için jel tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Kuruma tamamlandığında, poliakrilamid jeli istenen şekillerde kesin.

Jelleri çok kuyucuklu plakanın tabanına yapıştırmak için üretici talimatlarına uygun olarak 96 kuyucuklu plaka başına yaklaşık 500 microliters polimetilsilan hazırlayın. Pens kullanarak her kuyucuğun merkezine küçük bir damla polimetilsilan yerleştirin. Her kuyucuğa bir poliakrilamid jel, esnek plastik destek tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin.

Polidimetilsiloksan kürlendikten sonra, daha önce hazırlanmış selüloz örneğinden küçük bir miktarı bir transfer pipeti yardımıyla her kuyucuğa yerleştirin ve jel yüzeyini eşit şekilde kaplamak için yanlara doğru çalkalayın. Kuyucuk plakasını beş dakika boyunca yüksek yoğunluklu bir UV lambasının altına yerleştirin. İşlem tamamlandığında, fazla selülozu uzaklaştırmak için jelleri PBS ile durulayın.

Bu pipeti kullanarak, önceden hazırlanmış Tip 1 kolajen çözeltisinden her bir kuyucuğa yaklaşık 50 µL ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında en az iki saat boyunca kapalı tutun ve ardından fazla kolajen çözeltisini uzaklaştırmak için PBS ile yıkayın. Gelleri, bir doku kültürü kabininde UV ışığı altında iki saat boyunca sterilize edin.

Son olarak, jelleri hidrate etmek ve dengelemek için gece boyunca tam besi yerinde bekletin. Jelleri hücre ekimi için hemen kullanın veya buzdolabında iki güne kadar saklayın; birkaç akrilamid ve bis-akrilamid konsantrasyonunun (sırasıyla A ve B olarak belirtilmiştir) bir fonksiyonu olarak Young modülünün beklendiği üzere gösterimi burada sunulmuştur.

Hem depolama modülü G' hem de kayıp modülü G'', frekanstan bağımsızdır. Ayrıca, jellerin kurutulup ardından yeniden hidrate edilmesinin Young modüllerini etkilemediği doğrulanmıştır. Çapraz bağlayıcı Sulo sampa kullanılarak, herhangi bir sertlikteki hidrojeller üzerinde homojen bir kolajen kaplama elde edilebilir.

Meme kanseri M-D-A-M-B 2 31 hücrelerinin poliakrilamid jeller üzerine 24 saat boyunca ekildiklerinde, 0,5 ve 1 kilo pascal'lık yumuşak jellerde yuvarlak kaldıkları; ancak 100 kilo pascal'lık sert jelde yayılıp uzayabildikleri gözlemlenmiştir. Ayrıca, esnek plastik destek üzerine hazırlanan hidrojeller şeffaftır ve kolay görselleştirme ile mikroskopiye olanak tanır. Dahası, esnek plastik destek oto floresans göstermez ve dolayısıyla floresan işaretli hücrelerin görüntülemesine müdahale etmez.

Hücre morfolojisi, genel hücre yayılım alanı ve hücre daireselliği açısından daha detaylı olarak nicelendirilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, çok kuyucuklu plaka formatında poliamid jellerin ne kadar verimli ve düşük maliyetle nasıl hazırlanabileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sertliğe bağlı hücre biyolojisi çalışmaları için.