İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Yüzen mamosfer tahlilleri, süspansiyon koşullarında hayatta kalan ve farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşumu gösteren kök benzeri meme kanseri hücrelerinin alt kümesini araştırabilir. Bu protokol, kök ile ilişkili transkripsiyonel manzaranın analizini kolaylaştırırken, in vivo tümörijenez için bir vekil olan küre oluşturma yeteneğinin uygun bir in vitro ölçümünü sağlar.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir kanser hücre dizisi veya tümör dokusu örneği içindeki kök benzeri hücrelerin oranını tahmin etmek ve ardışık geçişler boyunca kendi kendini yenileme kapasitelerini değerlendirmektir. Bunu yapmak için, bir kanser hücre hattı veya tümör dokusu, tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için işlenir, bu daha sonra CD 44 pozitif ve CD 24 negatif hücresel alt kümeleri izole etmek için sıralanır. Hücreler düşük bağlantı plakalarına ekilir, büyüme için zaman tanınır ve daha sonra ışık mikroskobu küresi ile incelenir.

Şekillendirme verimliliği, başlangıçta ekilen hücre sayısına göre oluşan kürelerin sayısının belirlenmesiyle ölçülür. Tek bir hücre süspansiyonu oluşturma, büyüme için zaman tanıma ve küre oluşturma verimliliğini belirleme süreci, ardışık geçişler boyunca tekrarlanır ve sonuçta hücrelerin zaman içinde kendini yenileme kapasitesinin bir ölçüsünü sağlar. Bu yöntem, kök hücrelerin kendini yenileme gibi fonksiyonel özelliklerini sergileyen hücreleri tanımlamak için basit bir perspektif tahlilinin yanı sıra in vivo tümörlerden gelen kök hücre sayısının kantitatif bir tahminini sağlar.

Küre oluşturma tahlillerinin merkezi bir ilkesi, her kürenin klonal için orada olan tek bir hücreden türetilmesidir. Bu nedenlerden dolayı, hücre yoğunluğu bu tahlildeki en önemli parametredir, çünkü steril bir kültür başlığı altında çalışma kalitesi üzerinde kritik bir etkiye sahiptir. Bu prosedüre, %70 ila 80 oranında uyumlu olan MCF yedi veya MDA MB 2 3 1 hücresi ile başlayın.

Ortamı şişeden aspire edin, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra tripsin EDTA'yı ekleyin ve% 10 FBS içeren mamut küre ortamı ekleyerek ayırma vincini takiben iki ila altı dakika inkübe edin. Hücreler ayrıldıktan sonra, bunları 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında 200 kez G döndürün.

Santrifüjlemeyi takiben sinamekiyi boşaltın. Daha sonra hücreleri bir ila beş mililitre manosfer ortamında tekrar askıya alın, hücre peletini parçalamak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre eğitim başlığı filtresine daha fazla çalıştırın ve akışı ekli tüpte toplayın.

Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için, yeniden süspanse edilmiş hücrelerin 20 mikrolitrelik bir alikotunu bir hemo sitometreye aktarıyorum ve incelemek için bir mikroskop kullanıyorum. Burada görüldüğü gibi hücre kümeleri gözlenirse, süspansiyonu 25 gauge iğnenin içine ve dışına bir veya iki kez masaj yapmak için bir şırınga kullanın. Hücreler burada gösterildiği gibi tek bir hücre süspansiyonuna dağıtıldıktan sonra, floresan ile aktive edilmiş hücre kaynağı veya manyetik aktive hücre kaynağı yoluyla CD 44 pozitif CD 24 negatif hücresel alt kümeleri izole etmek için geri çekilin.

CD 44 pozitif hücrelerini pozitif olarak seçmek için bir LS sütunu kullanın. İstenen hücreler LS sütununun duvarlarına tutturulduğundan, akışı atın, ardından hücreleri sütundan çıkarın. Beş mililitre tampon uygulayın ve istenen hücreleri temizlemek için kolonla birlikte verilen pistonu uygulayın ve bastırın.

Ardından, negatif seçimle popülasyonu daha da saflaştırmak için bir LD sütunu kullanın. Burada LD sütunlarına bağlı CD 24 pozitif hücreleri. CD 24 negatif hücrelerini içeren akışı toplayın.

Daha sonra, akış sitometrisi kullanarak, izole edilen tüm hücrelerin fenotiplerini doğrulayın. Trian mavisi dışlama yöntemini kullanarak, hücre süspansiyonunu uygun şekilde seyrelttikten sonra canlı hücrelerin yoğunluğunu hesaplayın. Her bir kuyucuğu, iki mililitre tam mamut küresinde 500 ila 4.000 hücre santimetre kare olan altı kuyulu ultra düşük bir bağlantı plakasının tohumunu ekin. Orta.

Plakaları, küreler gözlenene kadar beş ila 10 gün boyunca rahatsız etmemeye dikkat ederek inkübe edin. Küreler en az 40 mikron çapında olana ancak henüz dönmeye başlamayana kadar kültürlemeye devam edin. Apoptotik. Meme tümörlerinin çıkarılması için ameliyat geçiren hastalardan insan meme kanseri dokusu elde edin.

Dokuyu 50 mililitrede 24 saate kadar buz üzerinde saklayın. DMEM'de mililitre başına 100 birim, penisilin ve mililitre başına 100 birim içeren steril tüpler. Steril bir doku kültürü başlığı altında çalışan streptomisin.

Numuneyi, steril makas, neşter ve cımbız kullanarak küçük bir hacim besiyeri içeren 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın. Yağ dokusunu çıkarın. İki ila üç mililitre D-M-E-M-F 12 ekleyin ve steril bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak numuneyi büyük parçalar kalmayana kadar kıyın.

Reeses, doku parçalarını ve proteolitik enzimler içeren 10 mililitre ön ısıtma DMEM'i büker ve bir ila üç saat boyunca döner bir çalkalayıcıda 37 santigrat derece inkübe eder. Sindirim enzimleri kullanılarak canlı bir primat tümör hücresi istiflendiğinde, hücre ölümü ile hücresel matriksten ins'e yeterli ekstraksiyon arasında kritik bir değiş tokuş vardır. Bu sindirimi düzenli olarak izlemek için başarının şart olduğundan emin olun Her yarım saatte bir, bir hemo sitometreye 20 mikrolitre süspansiyon pipetleyin ve sindirim derecesini değerlendirmek için bir mikroskop kullanın.

Sindirim tamamlandıktan sonra. Parçaların beş dakika boyunca çökelmesine izin verin. Daha sonra supinatı 15 mililitrelik konik bir polipropilen tüpe aktarın.

200 kez G'nizi oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin. Döndürmeden sonra, sırtüstü ajanı dikkatlice boşaltın ve hücreleri bir ila beş mililitre mamut küre ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, önceki bölümde açıklandığı gibi tek hücreli süspansiyonları hazırlayın ve plakalayın.

Bu videoda, gerekirse hücreleri dağıtmak için hücrelere 25 gauge şırınga ile en fazla iki kez yukarı ve aşağı sorun. Kültür periyodundan sonra, dijital kamera ile donatılmış bir mikroskop altında hücreleri 40 kat büyütmede gözlemleyin. Rastgele beş alanın görüntülerini elde edin.

Tüm görüntüler çekildikten sonra, çapı 40 mikrondan büyük olan mikro kürelerin sayısını belirlemek için toplama yazılımını kullanın. Son olarak, metasfer oluşturma verimliliğini hesaplayın Her bir kuyucuğundaki mamos kürelerinin sayısını, her bir oyuğa ekilen hücre sayısına 100 çarparak bölerek, her bir kuyudan mamos kürelerini içeren ortamın 15 mililitrelik bir tüpe bahse girerim. Her bir kuyuyu PBS ile yıkayın ve toplanan ortama ekleyin.

Daha sonra hücreleri 10 dakikalık oda sıcaklığında 115 kez G'de santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, sırtüstü andries'i atın. Peletleri 500 mikrolitre ön ısıtma denemesi EDTA inkübe ederek iki ila üç dakika bekletin.

İnkübasyonun ardından, tryin'i nötralize etmek için 500 mikrolitre FBS ekleyin ve ardından beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin. Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, supinatı atın ve orada peleti 100 mikrolitre mamut küresi içinde döndürün, herhangi bir küreyi ayırmak için orta pipeti yukarı ve aşağı doğru sıkın. Yine, bir hemo sitometre kullanarak, hücreleri sayın ve tek bir hücre süspansiyonuna dağılıp dağılmadıklarını belirleyin.

Değilse, tek hücreler elde etmek için bunları 25 kalibrelik bir şırıngadan iki defaya kadar geçirin, hücreleri yeni bir ultra düşük hücreye tohumlayın. Ek altı, beş ila 10 gün sonra birincil üretimde kullanılan aynı yoğunlukta kuyu plakası, 40 mikrondan büyük küreleri sayın ve küre oluşturma verimliliğini tahmin etmek için daha önce olduğu gibi korku oluşturma verimliliğini hesaplar. Atmosferler, bu videoda açıklandığı gibi epitelyal östrojen pozitif CF yedi ve mezenkimal üçlü negatif MDA 2 3 1 hücre hattından büyütüldü, 40 mikrondan büyük mamut kürelerinin sayımı, her hücre hattı için küre oluşturma verimliliğinin bir tahminini sağlar.

Burada görülen minimal hücre füzyon agregasyonunun, MCF yedi için santimetre kare başına 500 hücre ve MDA 2 3 1 için santimetre kare başına 1000 hücrede düşük yoğunluklu kaplama ile elde edildiğine dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, farklı hücre hatlarından veya cerrahi tümör örneklerinden elde edilen mammo kürelerinin nasıl büyütüleceğini ve sayılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, klonaliteyi sağlamak ve cerrahi örneklerden hücreleri çıkarırken yüksek oranda hücrenin canlı olmasını sağlamak için hücreleri düşük yoğunluklarda tohumlamayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedüre ek olarak, ilgilenilen dokuların in vivo tümör genisitesini belirlemek için immün sistemi baskılanmış farelere ksenogreft hücre popülasyonları gibi diğer yöntemler de uygulanmalıdır.