Name: İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Öğrenin meme kanseri kök benzeri hücrelerini izole etmek ve mammosphere oluşturma verimliliğini ölçmek için yüzen küre deneyini. CD44+/CD24- hücre alt kümelerini ayırarak tümör oluşum potansiyelini değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Hilary Craft ve Sir Douglas Myers ile anılmayı İmparatorluk BRC, Sağlık Araştırmaları Ulusal Enstitüsü ve Eylem Karşı Kanser tarafından desteklenmektedir.

prosedürler aşağıda etik Imperial College, Londra tarafından onaylanmıştır. İnsan Göğüs Kanseri Hücre Hatlarında Primer Mammospheres 1. Üretim NOT: Bir steril kültür kaputu altında aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Mammosphere Ortam, 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş DMEM / F12, 100 U / ml penisilin, 100 U / ml streptomisin ihtiva eden hazırlayın. 10 ng / ml yeniden birleştirici insana ait bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF R &amp; D Systems) ve 1 x B27 ek, 20 ng / ml yeniden birleştirici insan epidermal büyüme faktörü (EGF Sigma) ilave edilerek, kullanımdan hemen önce komple ortamı hazırlar. </li><li> (Ya da seçtiğiniz bir meme kanseri hücre hattı,% 70-80 izdiham) yapışık MCF-7 veya MDA-MB-231 hücreleri içeren bir şişeye aspire medya, 1x PBS içinde iki kez yıkayın ve hücreleri trypsinize. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Mammosphere medya 1-5 ml Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri. Pipet40 mikron hücre süzgeç kapağı filtresi yukarı ve aşağı ve gerekli kullanım halinde tek hücre süspansiyonu elde etmek. Tek bir hücre süspansiyonu (değilse, 3 kez hücre süspansiyonu kadar şırınga için bir 25 G iğne kullanımı) oluşmuştur emin olmak için, bir hemasitometre kullanarak. </li><li> FACS ile gerekli izole CD44 + CD24- hücresel alt kümesi, anti-CD24-fikoeritrin (PE) ve bir anti-CD44-floresin izotiyosiyanat (FITC) ile monoklonal antikorlar 9 kullanarak edin. Alternatif olarak, bir manyetik aktive hücre sıralama, anti-CD44 ve üreticinin talimatlarına göre, anti-CD24-biotin kombine mikro ile (MACS) sistemi kullanılarak bu nüfusu izole. LD sütunlarını kullanarak LS sütunları kullanarak pozitif seçim ve negatif seçim yapın ve 17 flow sitometri tüm izole hücrelerin fenotipleri onaylayın. </li><li> Tripan mavisi kullanarak, ml başına canlı hücre sayısını hesaplayın. Not: Hücre canlılığı hemocy ızgaralara içindeki hücrelerin toplam sayısı ile bölünmüş canlı hücre sayısı olarak hesaplanmıştırtometre. Tripan mavisi almak hücreler canlı olmayan olarak kabul edilir. Aşağıdaki prosedür tam olarak yaşayabilir hücrelerin oranını belirlemek için kullanılır. <ol><li> PBS içinde tripan mavisi bir% 0.4 çözelti hazırlayın. Hücrelerin 1 ml tripan mavi stok solüsyonu 0.1 ml ilave edilir. Hemasitometre yükleyin ve düşük büyütmede mikroskop altında incelemek hemen. Toplam hücre sayısı ve mavi boyama hücreleri sayın. Canlı hücreler, = [1,00 - (mavi hücre sayısı ÷ toplam hücre sayısı)] x 100. </li><li> Kültür ml&#39;si başına canlı hücre sayısını hesaplamak için aşağıdaki formül kullanılır. Seyreltme faktörü düzeltmek için unutmayın. 10 4 x 1.1 = hücre / ml kültüre x canlı hücre sayısı </li></ol></li><li> 6-çukurlu ultra-düşük yapışkan bir plakanın her bir tam mammosphere ortam, 2 ml hücre önceden belirlenmiş bir miktarda yeniden süspanse edin. tohum yoğunluğu normalde 500-4,000 hücre / cm oyuk başına 2 hücresidir. İsteğe bağlı kullanım loW ek 24 oyuklu plakalar ortam, 0.5 ml, aynı yoğunlukta tohum hücreleri ise. NOT: Bu ilgi her hücre hatları için ekim yoğunluğu ve kültür zaman optimizasyonu öneririz. </li><li> Özellikle ilk 5 gün büyümesi aşamasında plakalar bozmadan (hücre hattı ve mammospheres boyutuna bağlı olarak), 5-10 gün boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 seviyesinde ultra düşük bağlanma 6 oyuklu inkübe . </li></ol> İnsan Meme Kanseri Klinik Örneklerden İlköğretim Mammospheres 2. Nesil Not: İnsan göğüs kanser dokusu göğüs tümörlerinin çıkarılması için cerrahi geçiren hastaların elde edilebilir. 100 E / ml penisilin ve 100 U / ml streptomisin ihtiva eden kültür ortamı içinde 50 ml steril tüplerde kadar, 24 saat boyunca buz üzerinde saklayın dokusudur. Bir steril kültür kaputu altında aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Küçük bir ortam hacmi ile 100 mm doku Petri kabı içine örnek aktarın. RemovSteril makas, scapel ve cımbız kullanarak e yağ dokusu. </li><li> DMEM / F12 2-3 ml ekleyin ve hiçbir büyük parçalar kalmayıncaya kadar steril bir scapel veya jilet ile 1 mm 3 parçaya örnek kıyma. </li><li> Doku parçaları süspanse proteolitik enzimler (3000 U / ml kolajenaz ve 1000 U / ml hiyaluronidaz) ihtiva eden 10 mi DMEM önceden ısıtılmış ve doku parçaları sindirilir kadar bir döner sallayıcı içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. Genellikle tam sindirim 1-3 saat sürer. Tümörlerin patolojik özelliklerine göre sindirim süresini ayarlayın. (Örneğin meme adenokarsinomu daha kırılgan ve daha kısa sindirim zamana ihtiyacı müsinöz karsinom göre sindirimi genellikle zordur). Hemasitometre altında 20 ul süspansiyon gözlemleyerek sindirim her ½ saat derecesini değerlendirin. </li><li> Parçaları daha sonra, 5 dakika boyunca tortu oda tem olarak 10 dakika süreyle 200 x g&#39;de 15 ml konik bir polipropilen tüp ve santrifüj süpernatan transfer etmek içinsıcaklık. Mammosphere medya 5 ml - dikkatlice 1 süpernatant ve tekrar süspansiyon hücrelerini süzün. </li><li> Elde edilir ve tek hücre süspansiyonları plaka hücre hatları için, yukarıda tarif edilen adımları 1.1-1.4 izleyin. Gerekirse 25 G ile hücre hasar hücreleri sınırlamak için 2 kez fazla şırınga geçirin. </li></ol> 3. Mammosphere Verimliliği (%) hesaplanması Şekillendirme <ol><li> Kültür döneminden sonra, 40X büyütmede mikroskop altında mammospheres (fazla 40 um) çapı sayılır. Dijital görüntü 5 rastgele bir ışık mikroskobu dijital kamera kullanarak alanlar ve satın alma yazılımı kullanarak mammospheres boyutunu belirler. Herhangi bir resim Analizi Yazılım kullanın. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak Mammosphere Şekillendirme Verimliliği (MFE%) hesaplayın: MFE (%) = (kuyu başına mammospheres içinde) / (oyuk başına tohumlanmış hücrelerin içinde) x 100 </li></ol> Kendini yenileme Değerlendirme Mammospheres 4. Seri Pasajlanması <ol><li&gt; Pipet bir 15 ml tüp içine, her kuyudan mammospheres ihtiva eden ortam. PBS ile kuyu yıkayın ve toplanan medya ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 115 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant atılır ve önceden ısıtılmış% 0.5 tripsin /% 0.2 EDTA, 500 ul pelletini. 2-3 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Tripsin nötralize etmek için FCS 500 ul ekleyin. 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. Küreleri parçalamak için aşağı mammospheres medya, pipet yukarı 100 ul süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın ve. </li><li> Hemasitometre ile hücre sayımı ve hücreler, tek bir hücre süspansiyonu olup olmadığını belirlemektedir. Bir 25 G geçmesine değilse tek hücre elde etmek için 3 kez şırınga. Birincil oluşturmada kullanılan aynı yoğunlukta bir ultra düşük bağlanma 6 oyuklu bir plakaya hücreleri Tohum. </li><li> 5-10 gün sonra, küreler&gt; 40 um saymak ve daha önce bildirilen formülü kullanarak küre oluşturan verimliliği hesaplamak. </li></ol>

<ol><li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epigenetic+switch+involving+NF-kappaB%2C+Lin28%2C+Let-7+MicroRNA%2C+and+IL6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6.</a> Cell. 139 (4), 693-706 (2009).</li>
<li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+formation+of+breast+cancer+stem+cells+and+their+dynamic+equilibrium+with+non-stem+cancer+cells+via+IL6+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).</li>
<li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+current+status+and+evolving+complexities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: current status and evolving complexities.</a> Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).</li>
<li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+cancer+stem+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm.</a> Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).</li>
<li>Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL6-mediated+suppression+of+miR-200c+directs+constitutive+activation+of+inflammatory+signaling+circuit+driving+transformation+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis.</a> Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).</li>
<li>Chen, J., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li>
<li>Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+mode+of+tumour+growth+by+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the mode of tumour growth by clonal analysis.</a> Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).</li>
<li>Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+Lgr5%2B+stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li>
<li>Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties%3A+an+early+step+necessary+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+cancer+research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59(2006).</li>
<li>Ginestier, C., Hur, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Liu, S., Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Stem+Cells+Transition+between+Epithelial+and+Mesenchymal+States+Reflective+of+their+Normal+Counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts.</a> Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 
 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558</a> 1707-1710 (1992).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3A+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem+%2F+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells.</a> Genes Dev. , 1253-1270 (2003).</li>
<li>Ponti, D., Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).</li>
<li>Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+breast+cancer+stem+cells+by+knockdown+of+CD44%3A+promising+differentiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy.</a> J Transl Med. 9 (1), 209(2011).</li>
<li>Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+formation+in+breast+carcinoma+cell+lines+depends+upon+expression+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin.</a> PloS one. 8 (10), e77281(2013).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%E2%80%99t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+mammary+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of mammary gland stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).</li>
<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
<li>Al-Hajj, M., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+solid+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and solid tumor stem cells.</a> Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).</li>
<li>Yu, F., Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((let-7+regulates+self+renewal+and+tumorigenicity+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells.</a> Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar, bu makalenin tarafsızlığına halel getirecek şekilde algılanabilecek herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Birincil ve ikincil mammospheres Başarılı değerlendirme hücreleri az küre agregasyonu ile, tek klonlar formu mammospheres yeterince düşük yoğunluklarda kaplama olan dayanır. Bununla birlikte çok düşük yoğunluklarda, çok az mammospheres istatistiksel tedavisinin etkilerini ayırt oluşturabilir. Ekim yoğunluğu onların küre oluşturan verimlilikleri de önemli ölçüde değişebilir çünkü kullanılan her hücre hattı için optimize edilmelidir (Low-E-kaderin ifade olanlar daha az istikrarlı ve daha kısa vadeli mammosphere kültürleri...

kök benzeri kanser kök hücreleri tarafından başkanlığında tümör hücre soylarının varlığı büyük ölçüde tümör heterojenite anlayışımıza ekledi. Tümörlerde bazı fenotipik çeşitlilik genetik olarak farklı klonların klonal akıbet kaynaklanan yok iken, önemli bir bileşeni epigenetik farklılıklar sonucu görünür: kanser hücrelerinin spesifik genin aktivasyonu veya baskı yoluyla kök, atası ve farklılaşmış devletler arasında (geri dönüşümlü olarak bazen) geçiş yapabilirsiniz ifade programları 1-3. Bu, şu anda modüle faktörleri veren kanser, stromal ve bağışıklık hücrelerinin komşu parakrin sinyal ile bağlantılı olarak elde edilen otokrin sinyalli bir hücrede ifade edilen gen ekspresyon programı yansıtan hücre iç ve dış faktörler yansıtır ve bu tür derecesi gibi microenviromental koşullar hipoksi 2,4,5. Yenilikçi soy izleme yaklaşımlar olsa dain vivo niş 6 varsayılan kanser kök hücrelerini incelemek için yeteneğimizi ilerleyen - 8, küre oluşturan deneyler, en az kullanılan deney koşulları altında, kök hücreleri gibi davranmaya meme kanseri hücrelerinin potansiyelini tahmin etmek popüler ve kullanışlı bir yaklaşım kalır. Genellikle daha mesenchymal- ve epitel karşılık önerilmiştir membran belirteçleri CD44 ve CD24 9 ve enzim ALDH (aldehit dehidrojenaz) aktivitesi seviyeleri, 10, belirteçlerin bunların ifadesi ile, temizleme kanser kök hücreleri için geriye dönük yöntem ile birlikte kullanılır benzeri kanser kök hücreleri sırasıyla 11. Küre oluşumu yaklaşım, ilk olarak epitel büyüme faktörü (EGF), 12 ilavesi ile yapışkan olmayan, serumsuz koşullarda tek klonlardan putatif kök hücrelerinin büyümesini sağlayan neurosphere deneyi geliştirildi, daha sonra yararlı normal ve kanserli uygulanan meme dokularında. <p claP = &quot;jove_content&quot;&gt; küre oluşturucu kurucu hücre kimliği ve küre kitle oluşturan karışık hücre tipleri, meme ya da deneylerde oluşturan diğer küre yapılabilir çıkarımlar için de geçerlidir. Düşünce Uzun vadeli sakin kemik niyetli kök hücreleri, in vivo aktivasyon lehine olacağını faktörlerin kesin kombinasyonu karşılaşmazsınız, G0 fazında dinlenmek için. mammosphere tahlil yerine mitoz bölünme için dengelisin ya da zaten 13 bölünmesi ya hücrelerin büyümesini sağlar. Bu progenitörler, bir gerçek hareketsiz hücre de, testte kullanılan EGF ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), mitojen ile çoğalır hücre aşaması olabilir. Yine de, aktif kök hücre ilişkili sinyal bir dizi 14 yolaklarıyla içerirler. Buna ek olarak, bunların oluşum oranının fare ksenograftları 2,15,16 sınırlı seyreltme deneylerinde gücü ile ölçülen bölgeden alınan doku, tümöre neden olması ile de ilgilidir &lt;/ Sup&gt;. Burada tek hücrelerin izole edilmesi ve insan göğüs kanseri hücre çizgileri ve göğüs tümörlerinin klinik örneklerde her iki primer mammospheres oluşturmak için ayrıntılı protokolleri sağlar. Biz de kendini yenileme değerlendirmek için birincil mammospheres seri pasajlar gerçekleştirmek için nasıl ve küre farklı ekim yoğunlukları arasında karşılaştırma (Şekil 1 şemaya bakınız) izin veren verimliliği oluşturan hesaplamak için nasıl açıklar.

<table><tbody><tr><td>DMEM / F12</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>100 U / ml Penisilin & Streptomisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Rekombinant insan temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)</td><td>R& D sistemleri</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>1x B27 takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12399902</td><td></td></tr><tr><td>%0,5 tripsin/%0,2 EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>First Link UK</td><td>02-00-850</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Düşük ataşman 6 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>CLS3814</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip 1A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidaz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Steril tıraş bıçakları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12443170</td><td></td></tr><tr><td>Steril neşter</td><td>Fisher Scientific</td><td>11758353</td><td></td></tr><tr><td>Steril mikro diseksiyon makas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan göğüs kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen mammosphere oluşumu testi

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Sağlıklı dokuların, birçok kan ve katı maligniteler benzer şimdi daha farklılaşmış döl yol verirken kendine yenilemek kök benzeri kanser hücrelerinin bir alt kümesi olan, hiyerarşik olarak organize edilmesi düşünülmektedir. Anlama ve gelişmiş kemo ve olmayan kök tümör kitlesi ile karşılaştırıldığında radyo-dirence sahip olabilir meme kanserinde bu kanser kök hücrelerini hedefleyen, önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. Mammosphere deneyi de yaygın olarak geriye dönük sphere- tespit kabiliyeti için kullanılır hale gelmiştir: CD44, CD24, ve ALDH aktivitesi de dahil olmak üzere Marker prospektif, bağışıklık farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşum nedenlerinin göstermek hücreleri izole etmek için (FACS), flüoresans ile aktifleştirilen hücre kullanılarak değerlendirilebilir Tek kök hücre benzeri klonlarının gelişir hücreleri oluşturur. Burada hücre kuşakları ya da primer hasta numuneleri, bunların pasajlayarak ve küre f tahmin etmek için hesaplamalar mammospheres uygun kültür için yaklaşımlar anlatılmaktadıroluşturmayan verimlilik (SFE). Önce uygun planlama ve mammosphere deneylerin yorumunda önemli hususları ve tuzaklar tartışmak.

Farklı numuneler ya da farklı muamelelere tabi olan tohumlanmıştır ilk hücreler için normalize sonra meydana mammospheres&gt; 40 um sayı açısından değişiklik gösterebilir. Üç kez yetiştirilen her bir muamele için mammosphere oluşturucu etkinliği (MFE) hesaplayın. Bu durum, farklı tohum yoğunluğu ile deneyler karşılaştırılabilir sağlar. Veri en ideal pozitif ve negatif kontroller ile, bir çubuk grafikte görüntülenir ve üçlü kuyular arasında standart sapma gösteriyor. Sürekli% 60-80 izdiham arasında en yapışmaz plakalar h...

Yüzen mamosfer tahlilleri, süspansiyon koşullarında hayatta kalan ve farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşumu gösteren kök benzeri meme kanseri hücrelerinin alt kümesini araştırabilir. Bu protokol, kök ile ilişkili transkripsiyonel manzaranın analizini kolaylaştırırken, in vivo tümörijenez için bir vekil olan küre oluşturma yeteneğinin uygun bir in vitro ölçümünü sağlar.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir kanser hücre hattı veya tümör doku örneği içindeki kök hücre benzeri hücrelerin oranını tahmin etmek ve ardışık pasajlar boyunca kendilerini yenileme kapasitelerini değerlendirmektir. Bunun için, bir kanser hücre hattı veya tümör dokusu, tek hücre süspansiyonu oluşturacak şekilde işlenir ve ardından CD 44 pozitif ve CD 24 negatif hücresel alt kümeleri izole etmek için ayıklanır. Hücreler düşük yapışma özelliğine sahip plakalara ekilir, büyümeleri için zaman tanınır ve ardından ışık mikroskobu ile küre oluşumu açısından incelenir.Sfer oluşturma verimliliği, başlangıçta ekilen hücre sayısına oranla oluşan sfer sayısının belirlenmesiyle nicelendirilir. Tek hücre süspansiyonu oluşturma, büyüme için zaman tanıma ve sfer oluşturma verimliliğini belirleme süreci ardışık pasajlar boyunca tekrarlanır ve sonuç olarak hücrelerin zaman içindeki kendini yenileme kapasitesinin bir ölçümü sağlanır. Bu yöntem, kendini yenileme gibi kök hücrelerin fonksiyonel özelliklerini sergileyen hücreleri tanımlamak için basit bir perspektif analizi ve in vivo tümörlerden gelen kök hücre sayısının kantitatif bir tahmini sunar.Sfer oluşturma analizlerinin temel ilkesi, her sferin tek bir hücreden türetildiği ve dolayısıyla klonal olduğudur. Bu nedenlerle, hücre yoğunluğu bu analizdeki en önemli parametredir çünkü sonuçların geçerliliği üzerinde kritik bir etkiye sahiptir. Steril bir kültür kabininde çalışın. Bu prosedüre %70 ila %80 konfluens düzeyindeki MCF 7 veya MDA MB 231 hücreleri ile başlayın.Balondan besiyerini aspire edin, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Ardından tripsin EDTA ekleyin ve iki ila altı dakika inkübe edin; hücreler ayrıldıktan sonra %10 FBS içeren mammos sphere besiyeri ekleyerek işlemi durdurun. Hücreler ayrıldığında, onları 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 ×g hızında santrifüjleyin.Santrifüj işleminin ardından süpernatantı dökün. Daha sonra hücreleri bir ila beş mililitre manosphere ortamında yeniden süspande edin ve hücre peletini dağıtmak için pipetle 10 kez aşağı yukarı çekin. Ardından, hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzme başlığı filtresinden geçirin ve süzüntüyü ekli tüpte toplayın.Tek hücre süspansiyonu elde etmek için, yeniden süspanse edilen hücrelerden 20 µL'lik bir alikotu hemositometreye damlatıyorum ve incelemek için bir mikroskop kullanıyorum. Burada görüldüğü gibi hücre kümeleri gözlemlenirse, süspansiyonu bir veya iki kez 25 gauge bir iğnenin içine ve dışına doğru masaj yapmak için bir şırınga kullanın. Hücreler burada gösterildiği gibi tek hücre süspansiyonu haline getirildikten sonra, floresan aktive hücre ayırma veya manyetik aktive hücre ayırma yoluyla CD44 pozitif CD24 negatif hücresel alt kümeleri izole etmek için işleme devam edin.CD 44 pozitif hücreleri pozitif seçimle ayırmak için bir LS kolon kullanın. İstenen hücreler LS kolonunun duvarlarına tutunduğu için, akışla geçen sıvıyı atın ve ardından hücreleri kolondan çıkarın. Beş mililitre tampon uygulayın ve istenen hücreleri dışarı yıkamak için kolonla birlikte verilen pistonu uygulayıp aşağı bastırın.Ardından, popülasyonu negatif seleksiyon yoluyla daha fazla saflaştırmak için bir LD kolonu kullanın. Burada CD 24 pozitif hücreler LD kolonlarına tutunur. CD 24 negatif hücreleri içeren akış sıvısını toplayın.Ardından, akış sitometrisi kullanarak izole edilen tüm hücrelerin fenotiplerini doğrulayın. Trypan blue dışlama yöntemini kullanarak, hücre süspansiyonunu uygun şekilde seyrelttikten sonra canlı hücre yoğunluğunu hesaplayın. Altı kuyuklu ultra düşük tutunumlu bir plakanın her kuyucuğuna, iki mililitre komple mammosfer ortamı içerisinde santimetrekareye 500 ile 4.000 hücre gelecek şekilde ekim yapın.Sferler gözlemlenene kadar plakları, onları rahatsız etmemeye dikkat ederek beş ila 10 gün boyunca inkübe edin. Sferler en az 40 mikron çapına ulaşana ancak henüz apoptotik döneme girmeye başlayana kadar kültüre devam edin. Meme tümörlerinin alınması için ameliyata giren hastalardan insan meme kanseri dokusu temin edin.Dokuyu, steril bir doku kültürü kabininde çalışarak, 100 units/mL penisilin ve 100 units/mL streptomisin içeren DMEM içerisinde, 50 mililitrelik steril tüplerde buz üzerinde 24 saate kadar saklayın.Steril makas, skalpel ve cımbız kullanarak örneği, az miktarda besiyeri içeren 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın. Adipöz dokuyu uzaklaştırın. İki ila üç mililitre D-M-E-M-F 12 ekleyin ve steril bir skalpel veya jilet kullanarak, büyük parça kalmayana kadar örneği incece kıyın.Doku parçaları, proteolitik enzimler içeren 10 milliliters ön ısıtılmış DMEM ile karıştırılır ve bir döner çalkalayıcıda 37 degrees Celsius sıcaklıkta bir ila üç saat inkübe edilir. Sindirim enzimleri kullanılarak canlı primat tümör hücreleri izole edilirken, hücre ölümü ile hücresel matriksten yeterli ekstraksiyon sağlanması arasında kritik bir denge vardır. Başarıyı garantilemek için bu sindirim işleminin düzenli olarak izlenmesi esastır. Her yarım saatte bir, süspansiyondan 20 microliters pipetle bir hemositometre üzerine aktarın ve sindirim derecesini değerlendirmek için bir mikroskop kullanın.Sindirime işlem tamamlandıktan sonra, fragmanların çökelmesi için beş dakika bekleyin. Ardından süpernatantı 15 mililitrelik konik polipropilen bir tüpe aktarın.Örneği oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 ×g hızında santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, süpernatantı dikkatlice dökün ve hücreleri bir ila beş mililitre mammos sphere medyumunda yeniden süspande edin. Ardından, önceki bölümde açıklandığı şekilde tek hücre süspansiyonlarını hazırlayın ve plat edin.Bu videoda, gerekiyorsa hücreleri dağıtmak için hücreleri 25 gauge şırınga ile en fazla iki kez aşağı yukarı çekin. Kültür süresinin ardından, dijital kameralı bir mikroskop altında hücreleri 40 kat büyütmede inceleyin. Beş rastgele alandan görüntüler alın.Tüm görüntüler alındıktan sonra, çapı 40 mikrondan büyük olan mikrokürelerin sayısını belirlemek için veri toplama yazılımını kullanın. Son olarak, her kuyucuktaki mikroküre sayısını, her kuyucuğa ekilen hücre sayısına bölüp 100 ile çarparak metasfer oluşum verimliliğini hesaplayın. Her kuyucuktaki mikroküre içeren ortamı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Her kuyucuğu PBS ile yıkayın ve bunu toplanan ortama ekleyin.Ardından hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 115 ×g hızında santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatanı dökün. Pelleti önceden ısıtılmış 500 µL tryphine EDTA içerisinde süspande edin ve iki ila üç dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından, trypsini nötralize etmek için 500 µL FBS ekleyin ve ardından 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, süpernatantı dökün ve peleti 100 µL mammosphere ortamında tekrar döndürün; küreleri dağıtmak için pipetle yukarı ve aşağı çekin. Tekrar bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve tek hücre süspansiyonuna dönüşüp dönüşmediklerini belirleyin.Eğer değilse, tek hücreler elde etmek için hücreleri iki kez 25 gauge bir şırıngadan geçirin; hücreleri, primer generasyonda kullanılan aynı yoğunlukta yeni bir ultra-düşük tutunma özellikli altı kuyucuklu plakaya ekin. Beş ila 10 gün sonra, 40 mikronun üzerindeki sferleri sayın ve sfer oluşturma verimliliğini tahmin etmek için daha önce olduğu gibi sfer oluşturma verimliliğini hesaplayın. Mammosferler, bu videoda açıklandığı üzere epiteliyal östrojen pozitif CF7 ve mezenkimal triple negatif MDA 231 hücre hatlarından büyütülmüştür; 40 mikronun üzerindeki mammosferlerin sayıları, her bir hücre hattı için sfer oluşturma verimliliğine dair bir tahmin sağlar.Burada görülen minimum hücre füzyon agregasyonuna, MCF 7 için santimetrekare başına 500 hücre ve MDA 2 3 1 için santimetrekare başına 1000 hücre olacak şekilde düşük yoğunluklu ekim yapıldığında ulaşıldığını unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, farklı hücre hatlarından veya cerrahi tümör örneklerinden türetilen mammosferlerin nasıl büyütüleceği ve sayılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, klonaliteyi sağlamak için hücrelerin düşük yoğunluklarda ekilmesi gerektiğini ve cerrahi örneklerden hücreler çıkarırken hücrelerin yüksek bir oranının canlı olduğundan emin olunması gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu prosedüre ek olarak, ilgili dokuların in vivo tümör genisitesini belirlemek amacıyla, immün yetmezlik gelişmiş farelere xenograft hücre popülasyonları nakli gibi diğer yöntemler uygulanmalıdır.

mammosphere-formation-assay-from-human-breast-cancer-tissues-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

HC11 lactogenic farklılaşma mammospheres olarak anılacaktır kubbeli yapıların oluşumu ile karakterize edilebilir. Yapılar, faz kontrast mikroskobu ile numaralandırılan lactogenic farklılaşma niceleme yardımcı olabilir.

Fare Meme Epitel Hücreleri lactogenic Farklılaşma sırasında Mammospheres formu

Bu videoda, meme kanseri hücre hatlarından kanser kök hücrelerinin izole edilmesi anlatılmaktadır. Bu kanser kök hücrelerini, kendini yenilemeyi değerlendirmek ve küre oluşturma verimliliğini hesaplamak için birincil mamosferler oluşturmak üzere kültüre ediyoruz ve farklı tohumlama yoğunlukları arasında karşılaştırmaya izin veriyoruz.

Birincil Mamosferlerin Üretimi: Hücre Potansiyelini Belirlemek İçin Bir Teknik

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Burada, kanser metastazında pulmoner alveoler makrofajların fonksiyonlarını incelemek için model ve yaklaşımı açıklıyoruz. Bu hücrelerin metastazdaki rolünü göstermek için, alveolar makrofajın klodronat lipozomlarla tükenmesi ile birlikte meme kanserinin sinjenik (4T1) modeli kullanıldı.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Burada, in vitro mammosphere öz-yenileme nicel tahsin sonuçlarının uygulanması ve yorumlanması açıklanmaktadır.

Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği

Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Bu deneysel protokol, BCSC'lerin meme kanseri hücre ve doku örneklerinden izolasyonunun yanı sıra BCSC fenotipini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo testleri tanımlamaktadır.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu protokol, raf malzemeleri ile birincil insan meme dokusu kullanılarak meme kanserini incelemek için bir in vitro mikrofizyolojik sistemin inşasını açıklar.

Mikrofizyolojik Sistem Kullanarak İnsan Meme Dokusunda Meme Kanseri Modellemesi

Meme epitel hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, meme kanserinin ilerlemesine, tümör büyümesine ve metastaz yapmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu çalışmada meme kanseri hücrelerinden vasküler ve/veya lenfatik endotel hücreleri ile birlikte sferoidler yapılmış ve meme kanseri araştırmaları için in vitro sistem olarak uygulanabilirliklerini ortaya koymaktadır.

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Bu protokol, tümör olmayan meme epitel hücrelerinde Apoptoz İnhibörü 5 (Api5) tarafından indüklenen kanser kök noktasını incelemek için mamosfer oluşum testinin oluşturulma yöntemini açıklar. Birincil nesil mamutsferlerden toplanan lizatlar, kök hücre benzeri özelliklerin indüksiyonunu değerlendirmek amacıyla farklı kök belirteçleri için analiz edilir.

Mamokür Testi, tümör olmayan meme epitel hücre hatlarında Api5 kaynaklı kök konumunu ortaya koydu

Öğrenin meme kanseri kök benzeri hücrelerini izole etmek ve mammosphere oluşturma verimliliğini ölçmek için yüzen küre deneyini. CD44+/CD24- hücre alt kümelerini ayırarak tümör oluşum potansiyelini değerlendirin.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Daha fazla video keşfet