Permeabilize İskelet Kası Fibers tarafından oluşturulan Maksimum İzometrik Kuvvet Ölçümü
June 16th, 2015
Kimyasal tenli, ya da permeabilize, iskelet kas liflerinin kasılma özelliklerinin analizi tek kas hücre düzeyinde kas fonksiyonunu değerlendirmek için bir güçlü bir araç sunuyor. Bu yazıda hazırlamak için geçerli ve güvenilir bir teknik anahat ve test in vitro iskelet kas lifleri geçirgenleştirildi.
Bu prosedürün genel amacı, kimyasal olarak nüfuz eden iskelet kasları örneklerinden elde edilen tek tek liflerin maksimum izometrik kuvvet üretme kapasitesini ölçmektir. Bu, önce kas lifi zarlarının kimyasal bir deterjana maruz bırakılması, böylece hücre dışı ve hücre içi içerikler arasındaki bariyerin kaldırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, küçük bir lif demetinden tek bir lifi çıkarmak ve onu deney düzeneğine tutturmaktır.
Daha sonra, tek tek fiber için en uygun sarkomer uzunluğunu ayarlamak için lazer girişim desenleri kullanılır. Son olarak, maksimum izometrik kasılma kuvvetini ortaya çıkarmak için kalsiyum uygulanır. Sonuç olarak, perme tek lif tekniği, tüm kas mimarisi ile ilişkili karmaşıklıklar olmadan iskelet kasının kasılma özelliklerinin bir değerlendirmesini sağlar.
Protokolün başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi için temel adımların öğrenilmesi zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel gösterimi yararlıdır. Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi diseksiyon, depolama ve test solüsyonlarını hazırlayarak başlayın. Ardından, USP 10 sıfır monofilament naylon sütür ipliklerinden dikiş halkaları hazırlamak için forseps kullanın.
Çift el üstü düğüm tekniğini kullanarak, test edilecek her lif için dört ilmek hazırlayın. Oluşturulduktan sonra, düğümü bir mikroskop altına yerleştirin ve boyutunu yaklaşık 750 mikrometre çapa düşürün. IPS GTI işaretlerini kılavuz olarak kullanma.
Ardından, her iki tarafta sadece ilmek ve küçük 500 mikrometre kuyrukları bırakarak fazla dikişi kesin. Açık veya iğne biyopsisi ile elde edilen küçük bir kas dokusu kütlesini, soğutulmuş diseksiyon solüsyonu içeren bir tabağa aktarın ve dokunun su altında kalmasını sağlamak için daha fazla diseksiyon solüsyonu ekleyin. Numuneyi mikroskop altında inceleyin ve liflerin uzunlamasına eksenini araştırmacının sağ omzuna doğru hizalamak için manipüle edin.
Daha sonra numuneyi, sol elinizdeki forseps ve sağdaki mikro diseksiyon makası ile köşelerden sabitleyerek tabağa sabitleyin. Lifler arasındaki uzunlamasına kenar boşlukları boyunca bir demeti nazikçe incelemeye başlayın. Forseps veya pimlerden zarar gören dokuları çıkarın ve atın.
Diseksiyon işleminin bir sonucu olarak, demetleri diseksiyon solüsyonundan iyonik olmayan bir deterjan eklenmiş 2.5 mililitre taze soğutulmuş diseksiyon solüsyonu içeren üç mililitrelik bir şişeye aktarın. Numuneyi ara sıra hafif çalkalama ile 30 dakika buz üzerinde inkübe edin ve demetlerin inkübasyon boyunca su altında kaldığından emin olun. Daha sonra demetleri taze diseksiyon solüsyonu içeren bir şişeye aktarın ve kalan deterjanı çıkarmak için hafifçe ve kısa bir süre çalkalayın.
Durulandıktan sonra, demetleri soğutulmuş saklama çözeltisi içeren bir şişeye aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, şişeyi dört santigrat derecede depodan çıkarın ve tüm demetleri bir ilaç kabına veya diseksiyon kabına aktarın. Depolamaya hazırlanırken, demetleri 200 ila 400 mikrolitre taze saklama solüsyonu ile doldurulmuş ayrı ayrı etiketlenmiş kriyo şişelerine aktarın ve demetin tüpün yan tarafına yapışmadığından veya yüzeyde yüzmediğinden emin olun.
Ardından tüpü kapatın ve numuneyi eksi 80 santigrat derecede saklayın. Burada gösterilen ve beraberindeki metin protokolünde belirtilene benzer bir deney cihazı kurun. Daha sonra ilk deney odasını rahatlatıcı çözelti ile, ikinci odayı ön yeniden aktive edici çözelti ile ve üçüncü aktive edici çözelti ile doldurun.
Haznedeki sıcaklığı, gevşetici solüsyondaki aparat ile 15 santigrat derecede sabit olana kadar ayarlayın. Hazırlanan dikiş halkalarından ikisini, hem kuvvet dönüştürücüsünden hem de uzunluk kontrol cihazından uzanan paslanmaz çelik bağlantı yüzeylerine geçirin. Daha sonra, ilgilenilen bir lif demetini yaklaşık 15 dakika buz üzerinde çözdürün ve ardından taze, soğutulmuş rahatlatıcı solüsyonla doldurulmuş silikon elastomer kaplı bir Petri kabına aktarın.
Demeti her iki ucundaki pimlerle yerine sabitleyin ve forseps kullanılarak suya batırıldığından emin olun. Bir ucundan bir lifi kavrayın ve uzunlamasına ekseni boyunca düzgün bir şekilde çıkarmaya başlayın. Lifler demetten çıkarılırken dikkatli olunmalıdır, çünkü lifler ve hücre dışı matris arasındaki yapışmalar aşırı gerilime neden olabilir ve sonuçta gerilme kaynaklı hasara yol açabilir.
Ekstrakte edildikten sonra, lifi az miktarda gevşetici solüsyonla birlikte modifiye edilmiş bir pipet ucuna sokun ve forseps ile nazikçe yönlendiren gevşetici solüsyonu içeren deney odasına aktarın. Elyafı pipet ucundan çıkarın ve uzunluk kontrol cihazına sabitleyin. İlk dikiş halkasını kullanarak, fiberin diğer ucunu kuvvet dönüştürücüsüne doğru manipüle edin ve aynı prosedürü kullanarak fiberi sabitleyin.
Mikro diseksiyon makasını kullanarak fazla sütürü çıkarın. Ardından, ikinci halkayı birincinin üzerinden geçirin ve fiberi, uzunluk kontrolörü bağlantı yüzeyinin ucunun 0,2 milimetre içindeki bir noktaya sabitleyin. Fiberin kuvvet dönüştürücü ucundaki ikinci döngü ile tekrarlayın.
Fiberi deney odasının yan duvarlarına paralel olarak hizalamak için uzunluk kontrol cihazının konumunu Y ekseni yönünde ayarlayın. Ardından, prizma yan görünümünü kullanarak fiberi inceleyin ve fiber odanın tabanına paralel olana kadar uzunluk kontrol cihazının konumunu Z ekseni yönünde ayarlayın. Elyaf herhangi bir şekilde hasar görürse, elyaf atılmalı ve yeni bir elyaf takılmalıdır.
Lazeri açın ve sahnenin konumunu, lazer fiberin merkezinden geçecek şekilde ayarlayın. Ardından, hedef ekranda kırılan ışığın istenen aralığı gözlemlenene kadar uzunluk denetleyici X ekseni mikrometre sürücüsünü kullanarak fiber üzerindeki gerilimi artırarak veya azaltarak sarkomer uzunluğunu ayarlayın. Optimal sarkomer uzunluğu ayarlandıktan sonra, en içteki iki sütür arasındaki mesafeyi ölçün.
Hazneyi, göz merceğinin dikey çapraz kılı, bir iç sütürün en iç kenarında ve sıfırda hizalanacak şekilde konumlandırın. Mikrometre sürücüsündeki dijital okuma, göz merceğinin dikey artı kılı en içteki dikişle hizalanana kadar sahneyi mikroskoba göre x ekseni boyunca çevirir. Dijital ekran, fiberin uzunluğunu gösterecek, fiberi ölçülen uzunlukta tutacak ve hem üst hem de yan görünümlerden fiberin merkezi kısmının yüksek büyütmeli bir görüntüsünü yakalamak için mikroskoba monte edilmiş kamerayı kullanacaktır.
Fiberin kesit alanını hesaplamak için bu görüntüleri kullanın. Elyafı ön yeniden aktive edici çözeltiyi içeren hazneye taşımak için hazne kontrol yazılımını kullanın ve orada üç dakika inkübe edin. Elyaf çözeltiyi inaktive ederken, pasif gerginliğini ölçün, ardından elyafı aktive edici çözeltiyi içeren hazneye hareket ettirin ve hızlı bir yükselişten önce gelen kuvvetteki bir plato ile kanıtlandığı gibi maksimum izometrik kuvvetin gelişmesine izin verin.
Ardından, fiber bağlantı noktaları arasındaki mesafede büyük ve hızlı ve kısa bir azalma uygulamak için uzunluk kontrol cihazını kullanın, ardından sıfıra karşılık gelen kuvvet dönüştürücü çıkışını belirlemek için orijinal uzunluğa hızlı bir dönüş yapın. Burada gösterilen kuvvet, bu görünümlerden eliptik şekilli bir lifin hem üst hem de yan görünümleridir. Kesit alanı, lifin uzunluğu boyunca beş noktadaki çapların ölçülmesi ve ardından elde edilen beş alanın ortalamasının hesaplanmasıyla belirlendi.
İnsan, yavaş ve hızlı kas liflerinden elde edilen kuvvet izleri, bu videoda gösterilen tekniği kullanarak hızlı liflerin yavaş liflerden daha yüksek oranda kuvvet ürettiğini göstermektedir. İnsan fare ve sıçan kas liflerinin tipik özellikleri ölçüldü ve burada sunuldu. Gösterilen aralık 25. ila 75. çeyrekleri gösterir ve N, test edilen lif sayısıdır.
Farklı türler arasındaki özgül kuvvetteki geniş çeşitliliğe dikkat edin. Burada özetlenen prosedürler, ek müdahaleler, diğerlerinin yanı sıra uzunluk kuvveti, kuvvet hızı ve kuvvet dahil olmak üzere iskelet kası fizyolojisinin önemli yönleri eklenerek tek bir iskelet kası lifinin maksimum içsel kuvvet üretme yeteneğinin değerlendirilmesiyle sonuçlanır. Kalsiyum ilişkileri ortaya çıkarılabilir.
Genel Bakış
Bu makale, in vitro permeabilizasyona uğramış iskelet kası liflerinin kasılma özelliklerini değerlendirmek için güvenilir bir teknik sunar. Yöntem, tek lif düzeyinde maksimum izometrik kuvvet üretiminin ölçülmesini sağlayarak kas fonksiyonu hakkında bilgiler verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kas Fizyolojisi
- Hücresel Biyoloji
Arka Plan
- Hücresel düzeyde kas fonksiyonunu anlamak çeşitli biyolojik çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
- Kimyasal olarak soyulmuş lifler, kasılma özelliklerinin doğrudan ölçülmesini sağlar.
- Bu teknik, tüm kas mimarisine ilişkin karmaşıklıkları basitleştirir.
- Görsel gösterimler bu protokolün öğrenilmesini kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- Bireysel kas liflerinin maksimum izometrik kuvvet üretme kapasitesini ölçmek.
- Permeabilizasyona uğramış iskelet kası liflerinin hazırlanması ve test edilmesi için detaylı bir protokol sağlamak.
- Permeabilizasyona uğramış lif tekniğinin etkinliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Kimyasal deterjanlar kullanarak kas lifi numunelerinin hazırlanması.
- Kas demetlerinden bireysel liflerin çıkarılması.
- Lazer girişim desenleri kullanarak optimal sarkomer uzunluğunun ayarlanması.
- Maksimum kasılma kuvvetini ortaya çıkarmak için kalsiyum uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Teknik, bireysel liflerin kasılma özelliklerini başarılı bir şekilde ölçer.
- Kas fonksiyonunu değerlendirmede güvenilirlik ve geçerlik gösterilmiştir.
- Görsel yardımcılar protokolün anlaşılmasını önemli ölçüde artırır.
Sonuçlar
- Permeabilizasyona uğramış lif tekniği kas kasılabilirliğini incelemek için etkilidir.
- Bu yöntem, tüm kas çalışmalarının karmaşıklıkları olmadan değerli bilgiler sağlar.
- Gelecekteki uygulamalar kas fizyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Assessing single-fiber contractility enables mechanistic de-risking of therapeutic targets in neuromuscular and metabolic disease programs. By isolating force generation from whole-tissue confounders, this approach improves target validation confidence and supports early go/no-go decisions in preclinical portfolios. The method provides quantitative, reproducible outputs that bridge basic muscle biology with translational screening efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring intrinsic force capacity at the single-cell level.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity in target pathways affecting muscle contractility.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets with dose-responsive effects on fiber-specific force.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates normalized, quantitative force readouts suitable for compound library screening.
- Operational Value: Standardizes assay conditions via sarcomere length control and calcium activation protocols.
- Scalability: Supports reuse across species and fiber types for cross-model target assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links genetic or pharmacological interventions to functional outcomes in disease-relevant muscle models.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation using consistent force metrics.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by revealing contractile liabilities early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and mechanistic follow-up in translational research.
- Discovery Biology: Tests target effects on fundamental contractile mechanisms independent of tissue architecture.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative force measurements for hit validation and lead optimization.
- Analytics: Outputs normalized force and cross-sectional area data enabling inter-condition comparisons.
- Translational Research: Connects molecular changes to functional phenotypes in preclinical muscle models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for cross-project assessment of muscle-targeting modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by isolating muscle-specific contractility.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized fiber preparation and activation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing late-stage failures due to unidentified contractile effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on dose-response in single-fiber force assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in muscle dissection, fiber isolation, and force transducer operation.
- Dependent on calibrated instrumentation including length controllers, force transducers, and laser interference systems.
- Necessitates cross-team standardization of solution preparation, storage, and activation protocols.
- Adaptation across model systems (e.g., human, rodent) requires validation of species-specific contractile norms.
- Practical limitations include fiber fragility during extraction and variability in permeabilization efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Pre-sample Preparation
2:25
Skeletal Muscle Bundle Dissection, Permeabilization, and Storage
4:48
Preparation for Single Fiber Testing
7:41
Single Fiber Testing
9:51
Results: Activation Rate of Slow and Fast Fibers During Stimulation
10:56
Conclusion
