Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere

Bu prosedürün genel amacı, tedavinin hücrelerin yarı katı matrislerde çoğalma yeteneği üzerindeki etkisini kantitatif olarak belirlemektir, çünkü gelişmiş yetenek, yumuşak agar testi kullanılarak hücre tümörü genisitesinin bir işaretidir, tümör genisitesi, bir hücrenin yarı katı bir AROS jeli içinde koloniler oluşturma yeteneği ile ölçülür. Transforme olmamış hücreler bu ortamda hızlı bir şekilde çoğalamadığından, yarı katı AROS jeli önce %0.6'lık bir AROS alt tabakası yapılarak oluşturulur. Daha sonra, alt tabakanın üzerine% 0.3 AROS jel tabakası içeren bir hücre eklenir.

Bu tahlilde, deney hücreleri, Dr.Subramanian tarafından geliştirilen bir peptidil, arginin, daz veya ped enzimi inhibitörü ile muamele edilir. Her hafta, tedavi olsun veya olmasın% 0.3 aros jeli olan ek bir besleme tabakası eklenir. Son adım, analiz için 70 mikrometreden büyük kolonilerin sayısını saymaktır.

Sonuç olarak, kontrol ve tedavi grubu arasındaki koloni sayısındaki farkı göstermek için ters mikroskopi kullanılır. Merhaba, benim adım Achi Huta. Baker Hayvan Sağlığı Enstitüsü'nde Dr.Scott Kros laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim.

Cornell Üniversitesi'nde, yumuşak kaplan kolonisi oluşum testi, kanser biyolojisi alanında, ilaçlara, hormonlara ve çok sayıda başka tedavi koşuluna duyarlılıkları açısından çok çeşitli kanser hücrelerinin tümör genliğini değerlendirmek gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu işleme temiz, kuru 100 mililitrelik bir cam şişeye% 3 iki hidroksietil aros hazırlayarak başlayın. 0.9 gram iki hidroksietil aro ve ardından 30 mililitre damıtılmış su ekleyin.

Karışımı 15 saniye mikrodalgada ısıtın ve hafifçe döndürün. AROS tozu tamamen eriyene kadar bu adımı tekrarlayın. Daha sonra, şişe içeren çözeltiyi 15 dakika boyunca otoklavlayın.

Agros çözeltisinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Daha ileri gitmeden önce, aroların pipette katılaşmasını önlemek için 37 santigrat derecelik bir inkübatörde birkaç beş mililitre ve 10 mililitrelik pipetleri önceden ısıtın. Kısmen tutarken, şişe kapağını gevşetin ve önceden hazırlanmış %3 iki HİDROKSİETİL aro solüsyonunu 15 saniye mikrodalgada ısıtın.

Ardından çözeltiyi ve mikrodalgayı 15 saniye daha yavaşça döndürün. ARO çözeltisini döndürürken dikkatli olun, çünkü çözelti havaya maruz kaldığında yükselir ve şişe mikrodalgasında artık katı jel varsa dökülebilir. Tarımsal çözeltinin erken katılaşmasını önlemek için sonraki adımlarda ARO çözeltisini içeren şişeyi birkaç saniye daha 45 santigrat derece su banyosunda tutun.

Ardından, Ön Isıtma pipetlerini kullanarak 12 mililitre ısıtılmış ortamı steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hemen %3'lük aros çözeltisinden üç mililitre ekleyin ve aroları ortamla karıştırmak için konik tüpü hafifçe ters çevirin. Daha sonra, herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan altı kuyulu bir kültür plakasının her bir oyuğuna bu karışımdan iki mililitre yavaşça ekleyin.

Karışımın katılaşmasına izin vermek için altı kuyucuklu kültür plakasını düz bir yüzeyde dört santigrat derecede bir saat boyunca yatay olarak inkübe edin. Karışım katılaştıktan sonra, plakayı 30 dakika boyunca 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Alt katman artık kullanıma hazırdır.

Bu prosedürün zor bir yönü, sıvı agri jeli eklemeden önce seltz'in ortamda karıştırılmasını sağlamak için tüm hücrelerin eşit olarak dağıtıldığından ve erimiş agra kabuğunun her bir oyuğa eklenmeden önce katılaşmadığından emin olmaktır. Ek olarak, kullanım sırasında çözeltilerin katılaşmasını önlemek için borular önceden ısıtılır. Hücre içeren tabakayı hazırlamak için önce tripsin gözleri MCF 10 DCIS hücreleri ve bunları mililitre başına 40.000 hücrelik bir hücre konsantrasyonuna seyreltin, daha sonra ön ısıtma pipetleri kullanarak sekiz mililitre ortam alın ve steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Konik tüpe hemen iki mililitre% 3 aros ekleyin ve aroları ortamla karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Herhangi bir baloncuk oluşturmaktan kaçının. Daha sonra, hücrelerin iki mililitresini alın ve tedaviyi takip eden kontrol olarak DMSO veya DMSO'da tek başına iki mikromolar BB kloramin ile muamele edin, hücreleri bire bir seyreltmede %0.6 aros ile karıştırın ve bir mikromolar BB kloraminin nihai konsantrasyonunu elde edin.

Daha sonra hücre aros karışımından bir mililitre alın ve altı kuyucuklu kültür plakasının alt tabakasına yavaşça ekleyin. Üst tabakanın katılaşmasını sağlamak için altı kuyucuklu kültür plakasını en az 15 dakika boyunca dört santigrat derecede düz bir yüzeye yatay olarak yerleştirin. Karışım katılaştıktan sonra, besleme katmanını eklemeden önce plakayı bir hafta boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

Önceden hazırlanmış %3'lük iki hidroksietil aro çözeltisini daha önce olduğu gibi mikrodalgada pişirerek ve agro çözelti şişesini 45 derecelik bir su banyosunda dengeleyerek katman hazırlığına başlayın, bir mililitre% 3 tarımsal çözeltiyi dokuz mililitre ılık ortamla karıştırın 50 mililitrelik konik bir tüpe ve aroları ortamla karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Karışımı BB kloramin ile işlemden geçirdikten sonra, alt ve yumuşak katmanları içeren altı kuyucuklu kültür plakasının her bir oyuğuna yavaşça bir mililitre karışım ekleyin.

Ardından, karışımın katılaşmasını sağlamak için altı kuyulu kültür plakasını en az 15 dakika boyunca dört santigrat derecede düz bir yüzeye yatay olarak yerleştirin. Besleyici tabakası katılaştıktan sonra, plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bader, koloni oluşumu gözlenene kadar hücreleri yeni ortamla doldurmak için mevcut besleyici katmanın üzerine bir mililitre% 0.3 agros ortam arıtma çözeltisi yerleştirerek bu besleme prosedürünü haftalık olarak tekrarlayın.

Yumuşak agarda iki buçuk haftalık hücre büyümesinden sonra, her oyuktaki koloni sayısı sayılır. Kantitasyonu kolaylaştırmak için bir ışık mikroskobu kullanarak, bir saydamlık üzerine bir ızgara yazdırın ve sayım sırasında hücrelerin nerede olduğunu bulmaya yardımcı olmak için ızgarayı altı kuyulu plakaya takın. Koloni büyüklüğü, her bir koloninin çapı ile ölçülür ve hangi kolonilerin puanlanacağını belirlemek için bir referans koloni boyutunu önceden tanımlamaya göre değişecektir.

Örneğin burada 70 mikrometre ve üzeri koloni boyutları veri analizine dahil edilmiştir. Saydıktan sonra, jellerin kurumasını önlemek için altı kuyulu kültür plakasını paraform ile kapatın. Daha fazla koloni oluşumunu önlemek ve gelecekteki sayım için numuneleri dört santigrat derecede saklayın.

Sonuçlar, BB kloraminin, bir ped inhibitörü varlığında MC 10 DCIS hücresinden türetilmiş kolonilerin oluşumunu önemli ölçüde inhibe ettiğini göstermektedir. DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında hem koloni oluşumunda hem de koloni boyutunda bir azalma oldu. BB kloramin ile muamele edilmiş MCF 10 DCIS hücreleri için kolonilerin boyutu ağırlıklı olarak 20 ila 100 mikrometre aralığındaydı.

DMSO kontrolü için kolonilerin büyüklüğü iki buçuk haftalık büyümeden sonra 70 ila 150 mikrometre arasında daha geniş bir aralık sergilerken, 70 mikrometreden büyük koloniler sayıldı ve analiz edildi. DMSO kontrolünde ortalama yaklaşık 3.500 koloni bulunurken, BB kloramin ile tedavi edilen grupta sadece yaklaşık 2000 koloni görülmüştür. İki buçuk haftalık yumuşak tarımdan sonra, bu, ped inhibitörü tarafından meme kanseri hücrelerinin önemli bir tümörojenik inhibisyonunu gösteren bir mikromolar BB Kloramin varlığında ortalama koloni oluşumunda %44'lük bir azalmayı temsil eder.

Bu prosedürü denerken, kullanım sırasında çözeltilerin katılaşmasını önlemek için tüm reaktifleri ve ekipmanları önceden ısıtmayı akılda tutmak önemlidir ve izlediğiniz için teşekkür ederiz.