Name: Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Öğrenin meme kanseri hücrelerinde tümör oluşumunu yumuşak agar koloni oluşturma deneyi ile değerlendirmeyi. BB-Cl-amidine ile PADI enzim inhibitörlerinin etkisini in vitro ortamda nicel olarak ölçün.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik tavsiyeler verdikleri için Cornell Üniversitesi'nden Dr. Richard Cerione, Dr. Marc Antonyak ve Kelly Sullivan'a ve Olympus CKX41 ters mikroskoplarını paylaştıkları için Cornell Üniversitesi'nden Dr. Gerlinde Van de Walle'ye minnettarız.

% 3 2-Hidroksietil Agaroz hazırlanması 1. <ol><li> Temiz ve kuru bir 100 ml&#39;lik cam şişe içine, damıtılmış su, 30 ml, ardından 2-hidroksietil agaroz (Agaroz VII) 0.9 g. </li><li> 15 saniye hafifçe için karışım girdap mikrodalga. Agaroz tozu tamamen eriyene kadar bu adımı en az üç kez daha tekrarlayın. </li><li> 15 dakika için çözelti içeren bir şişe otoklava. </li><li> Agaroz çözüm daha kullanımdan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Oda sıcaklığında çözelti saklayın. </li></ol> Alt Katman 2. Hazırlık:% 0.6 Agaroz Jel <ol><li> Tutarken pipet katılaşmasını agaroz önlemek için 5 ml 37 ° C kuluçka makinesi içinde 10 mi pipetler önceden sıcak birçok. </li><li> Kısmen şişe kapağı ve mikrodalga 15 saniye önceden yapılmış% 3 2-hidroksietil agaroz çözümü gevşetin. Daha sonra, yumuşak bir 15 sn için çözelti ve mikrodalga girdap. DİKKAT: Agaro dönen dikkatli olunse çözümü çözüm havaya maruz ve yayılabilir zaman yükselir çünkü. </li><li> Şişede kalan katı jel, birkaç saniye mikrodalga varsa. </li><li> Erken katılaşmasını agaroz çözüm önlemek için bir sonraki adımları sırasında 45 ° C su banyosunda agaroz solüsyon içeren şişe tutun. </li><li> 37 ° C su banyosu içinde sıcak MCF10DCIS ortamı. Not: MCF10DCIS ortam DMEM / F12,% 5 at serumu,% 5 penisilin streptomisin oluşur. </li><li> Aktarım steril 50 ml konik bir tüp içine önceden ısıtılmış pipetler kullanılarak% 3 agaroz çözeltisi 3 mi. </li><li> Hemen sıcak MCF10DCIS medya 12 ml ekleyin ve hafifçe medya ile agaroz karıştırmak için konik tüp ters. Bu koloni sonradan sayım engel olacak herhangi bir kabarcıkları oluşturmak için çalışın. </li><li> Yavaşça hava kabarcıklarını oluşturucu olmayan bir 6-yuvalı kültür plakasının her bir oyuğuna, bu karışım 2 ml ekleyin. </li><li> 6-çukurlu kültür plakası Horizonta inkübelly, 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de, düz bir yüzeye karışımın sertleşmesine izin vermek. </li><li> Karışım katılaşmasından sonra, 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin. alt tabaka artık kullanıma hazırdır. </li></ol> Hücre içeren katmanın 3. hazırlanması:% 0.3 agaroz jel <ol><li> Trypsinize MCF10DCIS hücreler 4 x 10 4 / ml&#39;lik bir hücre konsantrasyonuna seyreltilmesi ve. </li><li> Bir steril 50 ml konik bir tüp içine önceden ısıtılmış pipetler ve transferi ile% 3 agaroz 2 ml alın. </li><li> Hemen konik tüp MCF10DCIS medya 8 ml ekleyin ve hafifçe medya ile agaroz karıştırmak için ters. Herhangi kabarcıkları oluşturan kaçının. </li><li> (0 uM (DMSO) ya da 1 uM) MCF10DCIS hücreleri (4 x 10 4 / ml) 2 ml alın ve BB-CLA ile tedavi edilir. </li><li> Bir 1: 1 seyreltme,% 0.6 agaroz ile hücrelerin karışımı. </li><li> Hücre-agaroz karışımının 1 ml alın ve yavaşça 6 oyuklu kültür p alt tabakanın üzerine eklemekGeç (2 x 10 4 hücre / ml). </li><li> Üst tabaka katılaşmaya izin vermek için en az 15 dakika boyunca 4 ° C &#39;de, düz bir yüzeye yatay 6 oyuklu kültür plakasına yerleştirin. </li><li> Karışım katılaşmasından sonra, besleme tabakanın ilave edilmeden önce bir hafta boyunca 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin. </li></ol> Besleyici Katman 4. Hazırlanması:% 0.3 Agaroz Jel <ol><li> Mikrodalga 15 saniye önceden yapılmış% 3 2-Hidroksietil agaroz çözüm. yavaşça başka bir 15 saniye için çözüm ve mikrodalga girdap. </li><li> 45 ° C su banyosu içinde agaroz çözelti şişe dengelenmesi. </li><li> 37 ° C su banyosunda MCF10DCIS medyayı ısıtın. </li><li> 50 ml konik bir tüp içine, sıcak MCF10DCIS ortam 9 ml% 3 agaroz çözeltisi 1 ml karıştırın ve yavaşça ortam ile agaroz karıştırmak için ters. Hava kabarcıkları oluşturarak kaçının. </li><li> BB-CLA ile karışım (0 uM (DMSO) ya da 1 uM) tedavi edin. </li><li> Yavaşça için olmayan (bu karışıma 1 ml ekleMing alt ve yumuşak tabakalar ihtiva eden 6 oyuklu kültür plakasının her oyuğuna) kabarcıklar. </li><li> Karışım, katılaşmaya izin vermek için en az 15 dakika boyunca 4 ° C &#39;de, düz bir yüzeye yatay 6 oyuklu kültür plakasına yerleştirin. </li><li> Besleyici tabakası katılaşır sonra, 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin. </li><li> Koloni oluşumu gözlenir kadar yeni medya ile hücreleri doldurmak için mevcut besleyici tabakası üzerine% 0.3 agaroz / orta / işleme çözeltisinin 1 ml kaplayan bu beslenme prosedürü haftalık tekrarlayın. Not: Agar yumuşak ve besleyici tabakalar bundan dolayı, besleyici tabaka ile ilgili ilave besinler kolaylıkla hücreler ulaşmak için hücre içeren bir tabaka halinde yayılır, çok yumuşak ve. </li></ol> 5. Veri Toplama <ol><li> Yumuşak agar içinde hücre büyümesinin 2.5 hafta sonra, her bir göze, bir ışık mikroskobu kullanarak koloni sayısı. Ölçümü kolaylaştırmak için, bir şeffaflık üzerine ızgara yazdırmak ve ızgara takmak6-plaka hücreleri sayma sırasında nerede bulmanıza yardımcı olmak için. (Her koloninin çapı ile miktarı gibi) koloni büyüklüğü değişebilir olduğundan, atılır olan koloniler belirlemek için bir referans koloni boyutunu önceden tanımlamak. Örneğin, 70 mikron ya da veri analizinde büyük bir koloni boyutları içerir. </li><li> Daha fazla koloni oluşumunu ve gelecekteki sayım önlemek için 4 ° C&#39;de örnekleri saklayın. Kurumasını önlemek için jeller Parafilm ile 6-kuyu kültür plaka Seal. </li></ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).</li>
<li>Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+peptidylarginine+deiminase+enzymes+in+disease+and+female+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).</li>
<li>Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+peptidylarginine+deiminase+enzymes+and+protein+citrullination+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis.</a> Biochem Res Int. , 895343(2012).</li>
<li>McElwee, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PADI2+as+a+potential+breast+cancer+biomarker+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target.</a> BMC Cancer. 12, 500(2012).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+disrupts+NET+formation+and+protects+against+kidney%2C+skin+and+vascular+disease+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.</a> Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).</li>
<li>Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+evaluation+of+human+tumor+chemosensitivity+in+the+soft-agar+assay+and+its+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).</li>
<li>Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+tumor+colony+growth+in+soft+agar+by+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum.</a> Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).</li>
<li>Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+soft+agar+assay+for+identification+of+anticancer+compound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound.</a> J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

yumuşak agar içinde koloni oluşumu oranı hücre tipi 9 bağlı olarak değişir. Bu nedenle, hücre sayısı optimize edilmiş ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır ile başlayın. Önerilen bir başlangıç ​​aralığı oyuk, 6 oyuklu plaka kullanılarak göz başına 4 ila 10 x 02-1 Ekim x 5 arasındaki hücreleridir. Buna ek olarak, koloni büyüklüğü her bir hücrenin büyüme hızına bağlı olarak değişir. Bu nedenle, koloni boyutu için önceden tanımlanmış bir cut-off aşağı kantitatif analizler için bireysel koloni...

Hem dönüşmemiş (normal) hem de dönüştürülmüş hücreler, 2B tek katmanlı bir kültürde kolayca çoğalabilir. Bu yapışık hücre büyümesi biçimi, mitojenik stimülasyonun yokluğunda hücrelerin genellikle mikro çevreleri içinde hızlı bir şekilde bölünmediği in vivo olarak meydana gelenden oldukça farklıdır. Öte yandan yumuşak agar testi, 2D kültür sistemlerinden farklıdır, çünkü bir hücrenin yarı katı bir agaroz jel1 içinde süspansiyon halinde çoğalma ve koloniler oluşturma yeteneğini ölçerek tümörjeniteyi ölçer. Bu ortamda, transforme olmamış hücreler, hücre dışı matrikse (ECM) ankraj yokluğunda hızla çoğalamaz ve anoikis olarak bilinen bir süreç olan apoptoza maruz kalırlar. Buna karşılık, malign transformasyon geçiren hücreler, fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K)/Akt ve Rac/Cdc42/PAK gibi sinyal yollarının aktivasyonu nedeniyle ankraj bağımlılıklarını kaybederler. Bu nedenle, bu hücreler yarı katı yumuşak agar matrisi2 içinde büyüyebilir ve koloniler oluşturabilir.
Yumuşak agar testinin yaygın bir kullanımı, PADI inhibitörleri gibi spesifik bileşiklerin in vitro tümör büyümesini baskılayıp baskılayamayacağını test etmektir. Genel olarak, koloni sayısı veya koloni boyutları, hücresel tümörjenisitedeki farklılıkları değerlendirmek için kontrol ve tedavi grupları arasında karşılaştırılabilen testten elde edilen kantitatif okumalardır. Bu nedenle, koloni oluşumunun artan ilaç konsantrasyonu ile ters orantılı olduğu bulunursa, ilacın in vitro olarak etkili bir tümörjenisite inhibitörü olduğu sonucuna varılabilir. Öte yandan, ilaç koloni oluşumunu etkilemiyorsa, ilaç ya uygun dozda değildir ya da etkili bir tümörjenik inhibitör değildir. Bir ilacın anti-tümör etkisini test etmek için yumuşak bir agar testi kullanmanın yanı sıra, bu test aynı zamanda belirli bir gen ile tümör oluşumu arasındaki ilişkiyi araştırmak için de kullanılabilir. Örneğin, PADI2 ekspresyonunun baskılanmasının tümörjenite üzerindeki etkisi, PADI2'ye özgü siRNA tedavisi ile ele alınabilir.
PADI'ler, sitrülinasyon veya deimination3-5 olarak bilinen bir işlemde pozitif yüklü arginin kalıntılarını nötr yüklü sitrüline dönüştürerek proteinleri translasyon sonrası olarak değiştiren kalsiyuma bağımlı enzimlerdir. Yakın zamanda peptidilarginin deiminaz 2'nin (PADI2) yeni bir meme kanseri biyobelirteç olarak işlev görebileceğini ve PADI inhibitörlerinin erken evre meme kanserleri için aday tedavileri temsil ettiğini bulduk6. Örneğin, daha önce bir "pan-PADI" inhibitörü olan Cl-amidin'in 2D tek tabakalar kullanarak meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını baskıladığını ve inhibitörün 3D tümör sferoidlerinin büyümesini baskıladığınıgöstermiştik 6. Bu raporda, bu çalışmaları genişletiyoruz ve yeni bir PADI inhibitörü olan BB-CLA'nın MCF10DCIS meme kanseri kolonilerinin büyümesini baskılamadaki etkinliğini test ederek yumuşak agar testinin faydasını vurguluyoruz7. Bu deney için MCF10DCIS hücreleri kullandığımızı not ediyoruz, çünkü bunlar transforme edilmemiş insan MCF10A hücrelerinin onkojenik türevleridir ve yüksek kararlı durum PADI2 protein8 seviyeleri içerdikleri için. PADI2 enzimatik aktivitesinin bu hücre hattının tümörjenisitesinde anahtar bir rol oynadığını ve PADI2 aktivitesinin BB-CLA aracılı inhibisyonunun kanser ilerlemesini baskılayacağını varsayıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axiopot Carl</td><td>Zeiss Mikroskopi</td><td>1021859251</td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Donör At Serumu</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2-Hidroksietilagaroz: Tip VII, düşük jelleşme sıcaklığı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

yumuşak agar koloni oluşturma deneyi kullanılması meme kanseri hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Tümör ilerlemesinin mekanizmalarını in vivo olarak araştırmadaki doğal zorluklar göz önüne alındığında, hücrelerin yarı katı matrislerde çoğalma yeteneğini ölçen yumuşak agar koloni oluşumu testi (bundan böyle yumuşak agar testi olarak anılacaktır) gibi hücre bazlı tahliller, kanser araştırmalarının ayırt edici özelliği olmaya devam etmektedir. Bu tekniğin konvansiyonel 2D tek tabakalı veya 3D küresel hücre kültürü tahlillerine göre önemli bir avantajı, 3D hücresel ortamın in vivo olarak görülene yakın taklididir. Daha da önemlisi, yumuşak agar testi, yeni bileşiklerin veya tedavi koşullarının hücre çoğalması ve göçü üzerindeki etkilerini titizlikle test etmek için ideal bir araç sağlar. Ek olarak, bu tahlil, genetik bozulmalar bağlamında hücre dönüşüm potansiyelinin kantitatif değerlendirmesini sağlar. Yakın zamanda peptidilarginin deiminaz 2'yi (PADI2) potansiyel bir meme kanseri biyobelirteç ve terapötik hedef olarak tanımladık. Burada, PADI inhibitörü BB-Cl-amidinin (BB-CLA) insan duktal karsinomu in situ (MCF10DCIS) hücrelerinin tümörjenitesi üzerindeki etkilerini test ederek klinik öncesi anti-kanser çalışmaları için yumuşak agar testinin faydasını vurguluyoruz.

yumuşak agar koloni oluşturma deneyi kanser hücrelerinin tümör oluşum nedenlerinin belgeleyen çok geniş bir uygulama aralığı için kullanılabilir. Bu tekniğin önemli bir avantajı, yan-katı bir matris seçici bir ankrajdan bağımsız bir şekilde prolifere olabilir hücrelerin büyümesini yana olmasıdır. Bu özellik esas olarak, kanser hücreleri tarafından değil, normal hücreler tarafından sergilenir. Öncelikle ilaçlar ile tümör büyüme inhibisyonu etkinliğini test etmek için, meme kanseri hücrelerinin bedenindeki, aşırı ekspresy...

Burada, bir peptidilarginin deiminaz (PADI) enzim inhibitörü olan BB-Cl-amidin'in in vitro meme kanseri tümörjenitesi üzerindeki etkilerini test etmek için yumuşak agar koloni oluşumu testinin kullanımını belgeliyoruz.

Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Bu prosedürün genel amacı, hücrelerin yarı katı matrislerde proliferasyon yeteneği üzerindeki tedavi etkisini nicel olarak belirlemektir; çünkü artırılmış proliferasyon yeteneği, hücrelerin tümörjenikliğinin belirgin bir özelliğidir. Yumuşak agar testi kullanılarak tümörjeniklik, hücrelerin yarı katı bir AROS jel içerisinde koloni oluşturma yeteneği aracılığıyla ölçülür. Transforme olmamış hücreler bu ortamda hızla çoğalamadığı için, yarı katı AROS jel önce %0,6 AROS alt tabakası oluşturularak hazırlanır. Ardından, alt tabakanın üzerine hücre içeren %0,3 AROS jel tabakası eklenir.Bu deneyde, deneysel hücreler Dr. Subramanian tarafından geliştirilen bir peptidil arginin deiminaz (pad) enzim inhibitörü ile işleme tabi tutulur. Her hafta, işlem uygulanmış veya uygulanmamış 0,3% agar jelinden oluşan ek bir besleme katmanı eklenir. Son adım, analiz için 70 micrometers'dan büyük koloni sayısının belirlenmesidir.Son olarak, kontrol ve tedavi grubu arasındaki koloni sayısı farkını göstermek için ters mikroskop kullanılır. Merhaba, ben Achi Huta. Baker Hayvan Sağlığı Enstitüsü'nde Dr. Scott Kros'un laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim.Cornell Üniversitesi'nde, yumuşak kaplan kolonisi oluşum testi; geniş bir yelpazedeki kanser hücrelerinin ilaçlara, hormonlara ve diğer birçok tedavi koşuluna karşı duyarlılıkları açısından tümör jenisitesinin değerlendirilmesi gibi kanser biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre, temiz ve kuru 100 mililitrelik bir cam şişe içerisinde %3'lük iki hidroksietil aros hazırlayarak başlayın. 0,9 gram iki hidroksietil aros ekleyin ve ardından 30 mililitre distile su ilave edin.Karışımı 15 saniye boyunca mikrodalgaya tutun ve nazikçe çalkalayın. AROS tozu tamamen çözünene kadar bu adımı tekrarlayın. Ardından, çözeltinin bulunduğu şişeyi 15 dakika boyunca otoklavlayın.Agros çözeltisinin oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Devam etmeden önce, arosun pipet içinde katılaşmasını önlemek için birkaç adet beş mililitrelik ve 10 mililitrelik pipeti 37 °C'lik bir inkübatörde önceden ısıtın. Kısmi işlem sırasında, şişe kapağını gevşetin ve önceden hazırlanmış %3'lük iki HYDROXYETHYL aro çözeltisini 15 saniye boyunca mikrodalgada ısıtın.Ardından çözeltiyi nazikçe çalkalayın ve 15 saniye daha mikrodalgada ısıtın. ARO çözeltisini çalkalarken dikkatli olun; çünkü çözelti havayla temas ettiğinde yükselir ve şişede kalıntı katı jel varsa mikrodalgada taşabilir. Sonraki adımlar sırasında, agro çözeltinin vaktinden önce katılaşmasını önlemek için ARO çözeltisini içeren şişeyi birkaç saniye daha 45 °C'lik bir su banyosunda tutun.Ardından, önceden ısıtılmış pipetler kullanarak 12 mililitre ısıtılmış besiyerini steril bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hemen üç mililitre %3'lük aros çözeltisi ekleyin ve arosu besiyeri ile karıştırmak için konik tüpü nazikçe tersyüz edin. Daha sonra, hava kabarcığı oluşturmadan bu karışımdan ikişer mililitreyi altı kuyucuklu bir kültür plakasının her bir kuyucuğuna nazikçe ekleyin.Karışımın katılaşması için altı kuyucuklu kültür plağını düz bir yüzeyde, dört derece Celsius'ta bir saat boyunca yatay olarak inkübe edin. Karışım katılaştıktan sonra plağı 30 dakika boyunca 37 derece Celsius'luk bir inkübatöre yerleştirin. Alt katman artık kullanıma hazırdır.Bu prosedürün zor bir yönü, tüm hücrelerin eşit olarak dağıtıldığından ve eritilmiş agara benzer kabuğun her bir kuyuya eklenmeden önce katılaşmadığından emin olmaktır; böylece sıvı agri gel eklenmeden önce seltzlerin medyum içinde karıştırılması sağlanır. Ek olarak, taşıma sırasında solüsyonların katılaşmasını önlemek için pipetler önceden ısıtılır. Hücre içeren tabakayı hazırlamak için öncelikle MCF 10 DCIS hücrelerini tripsinizle ayırın ve mililitre başına 40.000 hücre konsantrasyonuna seyreltin, ardından önceden ısıtılmış pipetler kullanarak sekiz mililitre medyum alın ve steril bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.Konik tüpe hemen iki mililitre %3 aros ekleyin ve arosu ortamla karıştırmak için tüpü nazikçe ters çevirin. Kabarcık oluşumundan kaçının. Ardından, iki mililitre hücre alın ve bunları iki mikromolar BB kloramin (DMSO içinde) ile işleyin veya kontrol olarak yalnızca DMSO uygulayın; işlem sonrası hücreleri, nihai konsantrasyonu bir mikromolar BB kloramin olacak şekilde bire bir dilüsyonla %0,6 aros ile karıştırın.Ardından, hücre aros karışımından bir mililitre alın ve altı kuyucuklu kültür plağının alt katmanına nazikçe ekleyin. Üst katmanın katılaşması için altı kuyucuklu kültür plağını dört °C'de düz bir yüzeye yatay olarak en az 15 dakika boyunca yerleştirin. Karışım katılaştıktan sonra, besleme katmanını eklemeden önce plağı bir hafta boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde bekletin.Önceden hazırlanmış %3'lük iki hidroksietil aro çözeltisini daha önce olduğu gibi mikrodalga fırında ısıtarak ve agro çözelti şişesini 45 °C'lik bir su banyosunda dengeleyerek besleme tabakası hazırlama işlemine başlayın. 50 ml'lik konik bir tüp içinde bir mililitre %3'lük agro çözeltiyi dokuz mililitre sıcak besiyeri ile karıştırın ve arosların besiyeri ile karışması için tüpü nazikçe ters çevirin. Hava kabarcığı oluşumundan kaçının. Karışımı BB kloramin ile işlemden geçirdikten sonra, karışımın bir mililitresini alt ve yumuşak tabakaları içeren altı kuyucuklu kültür plakasının her bir kuyucuğuna nazikçe ekleyin.Ardından, karışımın katılaşması için altı kuyucuklu kültür plağını düz bir yüzeyde, dört santigrat derecede en az 15 dakika boyunca yatay konumda bekletin. Besleyici tabaka katılaştıktan sonra, plağı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Koloni oluşumu gözlemlenene kadar, mevcut besleyici tabakanın üzerine bir mililitre %0,3 agros ortam tedavi çözeltisi ekleyerek hücreleri yeni besiyeri ile yenilemek için bu besleme işlemini haftalık olarak tekrarlayın.Yumuşak agarda iki buçuk haftalık hücre büyümesinin ardından, her kuyudaki koloni sayısı sayılır. Sayımı kolaylaştırmak için bir ışık mikroskobu kullanarak, hücrelerin konumunu belirlemeye yardımcı olmak amacıyla bir şeffaf folyoya ızgara yazdırın ve bu ızgarayı altı kuyucuklu plakaya yapıştırın. Koloni boyutu, her koloninin çapı ile belirlenir ve değişkenlik gösterecektir; hangi kolonilerin sayılacağını belirlemek için referans bir koloni boyutu tanımlayın.Örneğin burada, 70 micrometers veya daha büyük koloni boyutları veri analizine dahil edilmiştir. Sayım işleminden sonra, jellerin kurumasını önlemek için altı kuyucuklu kültür plağını paraform ile mühürleyin. Daha fazla koloni oluşumunu önlemek ve gelecekteki sayımlar için örnekleri dört degrees Celsius'te saklayın.Sonuçlar, BB kloraminin bir PAD inhibitörü varlığında MC 10 DCIS hücre kaynaklı kolonların oluşumunu önemli ölçüde inhibe ettiğini göstermektedir. DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında hem kolon oluşumunda hem de kolon boyutunda bir azalma görülmüştür. BB kloramin ile işlem görmüş MCF 10 DCIS hücreleri için kolon boyutları ağırlıklı olarak 20 ile 100 mikrometre aralığındaydı.DMSO kontrolündeki kolonilerin boyutları, iki buçuk haftalık büyüme sonrası 70 ile 150 mikrometre arasında daha geniş bir aralık sergilese de, 70 mikrometreden büyük olan koloniler sayılmış ve analiz edilmiştir. DMSO kontrolünde ortalama yaklaşık 3.500 koloni bulunurken, BB kloramin uygulanan grupta yalnızca yaklaşık 2000 koloni görülmüştür. İki buçuk haftalık yumuşak agar kültürü sonrası bu durum, bir mikromolar BB Kloramin varlığında ortalama koloni oluşumunda %44'lük bir azalmaya karşılık gelmekte olup, inhibitörün meme kanseri hücreleri üzerinde anlamlı bir tümorajenik inhibisyon sağladığını göstermektedir.Bu prosedürü uygularken, çözeltilerin işlem sırasında katılaşmasını önlemek için tüm reaktiflerin ve ekipmanların önceden ısıtılması gerektiğiniye dikkate almak önemlidir; izlediğiniz için teşekkürler.

utilization-soft-agar-colony-formation-assay-to-identify-inhibitors

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Bu videoda, bir PADI enzim inhibitörü ve BB-Cl-amidin'in in vitro meme kanseri tümörjenitesi üzerindeki etkilerini test etmek için bir yumuşak agar koloni oluşumu testi açıklanmaktadır. Bu test aynı zamanda genetik bozulmalar bağlamında hücre dönüşüm potansiyelinin kantitatif değerlendirmesini de sağlar.

Yumuşak Agar Koloni Oluşumu Deneyi: Yeni Bileşiklerin Kanser Hücresi Proliferasyonu Üzerindeki Etkilerini Test Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, akciğer kanseri hücrelerinin süresiz olarak çoğalma ve bireysel koloniler oluşturma yeteneğini belirlemeye yardımcı olan koloni oluşumu testi açıklanmaktadır. Bir antikanser ajanının koloni oluşturan hücreler üzerindeki etkisini, ortaya çıkan kolonilerin sayısındaki ve/veya boyutundaki değişiklikleri analiz ederek analiz edebiliriz.

Koloni Oluşumu Deneyi: Antikanser Ajanların Koloni Oluşturan Akciğer Kanseri Hücreleri Üzerindeki Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Bu video, antikanser bileşiklerle tedaviye yanıt olarak lösemik hücreler tarafından oluşturulan kolonilerin sayısını tanımlamaya ve saymaya yardımcı olan metil selüloz bazlı koloni oluşum birimi veya CFU testi protokolünü açıklar.

Metil Selüloz Bazlı CFU Testi: Lösemik Hücrelerde Anti-kanser Bileşiklerinin Koloni Oluşumu Üzerindeki Etkisini Belirlemeye Yönelik Bir Yöntem

Yumuşak agar koloni oluşum testi, in vitro hücresel ankrajdan bağımsız büyümeyi doğrulamak için kullanılan bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, transforme olmuş hücrelerin tümörjenik potansiyelinin ve proteinlerin transforme olmuş hücreler üzerindeki tümör baskılayıcı etkilerinin tespiti için sıkı bir yöntem göstermektir.

Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi

Bu prosedür, bir aspirin-fumarat prodürününün anti-NFκB ve anti-kanser kök hücre aktivitesini nasıl sentezlediğimizi ve karakterize ettiğimizi gösterecektir.

NFKB Aktivite ve Meme Kanseri Kök Hücreler önler Sentezi ve bir Aspirin-fumarat ön-ilacının Karakterizasyonu

Genellikle kültürlü hücreler üzerinde bileşiklerin bir dizi potansiyel sitotoksisite değerlendirmek için gereklidir. Burada, 96-iyi formatında toksik bileşikler için güvenilir bir tarama stratejisi açıklar.

Düşük-Orta Throughput'ta Kültürlü Memeli Hücrelerinde Hücre Büyümesini ve SağkalımLarını Etkileyen Bileşikleri Belirleme Stratejisi

İn vitro hücre invazyonu assay, protein matrisini içeren hücre kültürü eklemlerini kullanarak invazyon ve göç için hücresel potansiyelin ölçülmesi ile kanser metastifinin potansiyelini ölçmek için kullanılır. Hücreler protein matrisinde ve gözenekli membrandan, bir kemoçekiciye doğru göç etmek ve sonra ışık mikroskobu ile ölçülebilir.

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Bu protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmayı ve hücre canlılık testleri ve mikroskobik incelemeler kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmeyi açıklamaktadır.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Bu deneysel protokol, lncRNA'nın koloni oluşturan testlerle birleştirerek lncRNA'nın osteosarkom hücre çoğalması üzerindeki etkisini niceleyen istikrarlı, maliyet etkin ve verimli bir yöntem sunar.

Koloni Oluşumu Testi LncRNA Knockdown Osteosarkom Hücrelerinin Proliferatif Kapasitesini Tespit Ediyor

Öğrenin meme kanseri hücrelerinde tümör oluşumunu yumuşak agar koloni oluşturma deneyi ile değerlendirmeyi. BB-Cl-amidine ile PADI enzim inhibitörlerinin etkisini in vitro ortamda nicel olarak ölçün.

Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere (Video) | JoVE Journal

Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere

Daha fazla video keşfet