Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz

Bu prosedürün genel amacı, harekette yer alan genler için vahşi tip sineklerin ve mutant sineklerin tırmanma yeteneğini ölçmektir. Bu, önce sineklerin cam dereceli bir silindire aktarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, silindiri köpük dolgu üzerine hafifçe vurarak sinekleri silindirin dibine kaydırmaktır.

Hedef çizgiyi geçen sonraki sinekler, iki dakikalık bir süre boyunca bir video kamera kullanılarak kaydedilir. Son adım, videoları analiz etmek ve her 10 saniyede bir hedef çizginin üzerindeki sinek sayısını çizmektir. Sonuç olarak, tırmanma testi, meyve sineklerinin mutant hatlarının tırmanma kabiliyetindeki kusurları belirlemek için kullanılır.

Bu tekniğin veya vahşi yöntem gibi mevcut tekniklerin temel avantajı, tırmanma kabiliyetindeki küçük farklılıkları tespit etme yeteneğine sahip olmasıdır. Bu yöntem, kalıtsal spastik parapleji üzerindeki spesifik genlerin ilerleyici yürüyüş bozukluğu üzerindeki rolü gibi nörodejeneratif bozukluklar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin anlamı, tedavinin geliştirilmesine yönelik bir eğilimdir.

Nörolojik bozukluklar için IP, çünkü aday nörodejeneratif genler için ilaç tepkisini ve mutantları test etmek için basit bir kantitatif test sağlar: Karbondioksit kullanarak 20 sineği uyuşturarak başlayın ve tüm sinekleri yiyecek içeren 25 milimetreye 95 milimetrelik bir toplama şişesine yerleştirin. Daha sonra, sinekleri içeren şişeyi, şişenin dibinde birikebilecek herhangi bir sıvıya hapsolmalarını önlemek için yatay olarak bir karton tepside saklayın. Sinekleri, ertesi sabah 12 saatlik açık karanlık bir döngü altında en az 21 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin, sinekleri şişeden 250 mililitrelik cam dereceli bir silindire aktararak tırmanma testini ayarlayın ve herhangi bir sineğin kaçmasını önlemek için üst kısmı balmumu filmi ile kapatın.

Deneyi ortam ışığında 22 santigrat derece ve %40 nemde gerçekleştirin. Uyku döngüleriyle karışıklıkları önlemek için her zaman günün aynı saatinde deneyler yapın. Ayrıca, her gün sabit tutmak için silindirin konumunu tezgah üzerinde işaretleyin.

Silindirin altındaki ve gıda şişelerindeki ölü sineklerin sayısını sayın, bu sayıyı ölüm oranı olarak kaydedin. Ardından, video kamerayı bir tripoda kurun. Kamerayı 250 mililitre dereceli silindirin 190 mililitrelik çizgisine çok hafif bir şekilde odaklayın.

Silindiri, sinekleri iç alt yüzeye çıkarmak için yeterli kuvvetle kapalı hücreli bir köpük pede beş ila 10 kez vurun. Ardından diğer elinizi kullanarak kameradaki kayıt düğmesine basın. Ardından, kamera kayıt yaparken silindire ritmik olmayan belirgin bir düzende altı kez dokunun.

Her denemeyi, sineklerin en son dokunulduğu andan itibaren iki dakika boyunca gerçekleştirin. Son olarak, sinekleri %95 etanol içinde atın. Deneme tamamlandıktan sonra, gruplar arasındaki küçük hareket farklılıklarını tespit etmek için her seferinde 20 taze sinek kullanarak bu tırmanma testini 10 kez tekrarlayın.

Silindirleri bulaşık makinesinde yıkayın ve deney tamamlandıktan sonra tekrar kullanılmak üzere gece boyunca kurutun Sinek performansını analiz etmek için, her bir sinek deneme kaydının videolarını izleyerek başlayın. Her 10 saniyede bir hedef çizgiyi geçen toplam sinek sayısı. Bir sinek geri tırmanırsa veya düşerse, bu sineği eksi bir olarak kaydedin ve hedef çizgiyi geçmek için bir sonraki sineği geri tırmanan veya düşen sinekle aynı sayı olarak sayın.

Örneğin, 15. sinek hedef çizginin altına düşerse, çizgiyi geçen bir sonraki sinek 16. değil, 15. sinek olarak kabul edilir. Ardından, deneme arsasında kalan sinek sayısını elde etmek için ölüm oranını toplam sinek sayısından çıkarın. Ciddi mutasyonlarla çalışırken her zaman noktasında hedef çizginin üzerindeki sineklerin yüzdesi, farklı tırmanma deneyleri kullanılarak farklı derecelerde tırmanma kusuru görülebilir.

Burada, 18 saniye sonra boş bir yiyecek şişesinin tepesine tırmanan sekiz günlük sineklerin sayısı, iki grup arasında tırmanma davranışında önemli bir fark göstermeden kaydedildi. Öte yandan, bu protokolden elde edilen tırmanma testini kullanarak, Bastin 17, TM üç mutant sinek üzerinde yedi çizgi, kontrollere kıyasla performansta bir eksiklik göstermektedir. Birçok lokomotif bozukluğu ilerleyici olduğundan, sineklerin zaman içindeki evrimini gözlemlemek önemlidir.

İki günlükken, hedef çizginin üzerine çıkan sinek sayısında önemli bir fark vardır. Kontrollerle karşılaştırıldığında. Bu tırmanma performansı, mutant sineklerin yaşlanışı iki günden güne kadar azaldıkça azalmaya devam eder.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu deney ve analiz üç saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, nörolojik bozukluklar için dola mutant modellerinde lokomotif kusurlarının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.