Name: Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster'da negatif jeotaksi testiyle tırmanma kusurlarını niceliksel analiz etmeyi. Bu hassas yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda genetik etkileşimleri ve ilaç hedeflerini taramak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR) Ekibi tarafından Dr. Bolduc (eş PI) ve Dr. Guy Rouleau'ya (PI) verilen bir Ekip Hibesi ile desteklenmektedir. Yöntemin geliştirilmesi ve istatistiksel analizdeki yardımları için Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, Alberta Üniversitesi sinek kulübü üyeleri ve Dr. Clayton Dickson'a teşekkür ederiz.

Drosophila melanogaster Araştırma Alberta araştırma kurallarına Üniversitesi ile uyumlu idi. 1. Fly Koleksiyonu <ol><li> Gıda ihtiva eden bir 25 mm x 95 mm toplama şişe içinde CO2 (g) anesthetization ve yer kullanarak 20 sinekler toplayın. </li><li> Yatay sinekler içeren Mağaza şişeler şişe dibinde birikebilir herhangi sıvılarda sinekleri yakalama önlemek için. </li><li> Yaklaşık 15 saat için bir kuluçka makinesi içinde% 45 nemde 22 ° C sıcaklıkta en az 21 saat süre ile sinekler inkübe edin. 12 saat ışık ile kuluçka ayarlayın: koyu döngüsü. </li></ol> 2. Tırmanma Deneyi <ol><li> Sonraki sabah, 250 ml&#39;lik bir cam içine tek bir tüpten silindire 20 sinekler aktarın. O sürekli günlük tutmak için silindirin pozisyonunu işaretleyin. Genotipleri arasındaki çapraz bulaşmayı önlemek için genotip başına bir cam silindir kullanın. Her deney ve RO sonunda yıkayıngenotipleri arasında onları tate. <ol><li> Sıcaklık ve 22 ° C ve% 40 nem oranında sırasıyla (vizyon potansiyel kusur varsa veya kırmızı ışık) ortam ışığında deneyler. Sirkadiyen ritim şaşırtmak önlemek için, her zaman günün aynı anda deneyleri. </li></ol></li><li> Bir bariyer film (balmumu filmi) bir sinekler kaçmasını önlemek için (Şekil 2) ile, silindirin üst mühür. </li><li> Bir tripod üzerinde video kamera ayarlayın. 250 ml 190 ml hattında odaklı kamera silindir (17.5 cm) mezun oldu. </li><li> Silindirin dibinde ve gıda şişeleri ölü sinekler sayısını. Mortalite olarak bu numarayı kaydedin. </li><li> Çok hafif, iç taban yüzeyine sinekler yerinden yeteri kadar kuvvet ile art arda kapalı hücreli köpük ped karşı silindir dokunun. Kamerada kayıt basın diğer elinizi kullanarak 10 kez - 5 dokunun. </li><li> Kamerada &quot;Kaydet&quot; düğmesine basın. </li><li> Vid başlateo kamera kayıt ve ayrı olmayan ritmik desen silindire altı kez dokunun. </li><li> Sinekler en son aday andan itibaren 2 dakika süreyle her deneme Davranış ve seçilen her zaman noktasında 17.5 cm (190 ml) (her 10 sn ölçmek) yüksekliğini geçen sinekler sayısını kaydedin. Not: silindir üzerinde işaretleme ml çapına bağlı olarak bir silindir modeli diğerine değişecektir. Hatayı önlemek için, kullanılan her silindir üzerinde yüksekliğini ölçmek. </li><li> Deneme sona erdikten sonra,% 95 etanol sinekler atmayın. </li><li> Tüm çoğaltır taze sinekler her zaman test edilmiştir yineleyerek 2,1-2,9 adımları. Not: 5 suret mutasyon hareket yeteneği üzerindeki güçlü bir etkiye sahip olan yeterli olabilir, ancak, 20 sinek (200 sinekler) 10 biyolojik çoğaltır küçük farklılıkları tespit etmek için önerilmektedir. </li><li> Deneyin tamamlanmasından sonra, laboratuvar bulaşık makinesi ve kuru O&#39;da silindir yıkama / N yeniden kullanılır. </li></ol> 3. Analiz <ol><li> Analyher ze videoları deneme sinek. Her 10 sn, hedef hattı geçmesi sineklerin toplam sayısını kaydedin. <ol><li> Bir sinek geri aşağı tırmanıyor ya düşerse, -1 olarak sinek ve kayıt geri aşağı tırmandı ya düştü anında aynı sayı olarak hedef çizgisini sonraki sinek sayısı. 15. sinek hedef çizgisinin altına düşerse, örneğin, bir sonraki sinek 15 inci sinek ve 16 inci olarak kabul edilir hattı (16 inci sinek) geçmeye. </li></ol></li><li> Deneme kalır sinekler sayısını elde etmek için sinekler (20) toplam sayısından mortalite çıkarma. Her zaman noktasında, hedef hattının üzerinde uçar fraksiyonu elde edilir. </li><li> Her bir zaman noktasında her bir yüzde çizilir (bkz Şekil 3). </li><li> 120 sn veri noktasında performansını analiz ve 2 grup mevcut olduğunda veya ANOVA ve Bonferroni değişiklik ile çoklu karşılaştırmalar için bir post-testi (planlı ve plansız co Tukey için student t-testi gerçekleştirinmparisons). Kolmogorov-Smirnov 17 de normallik ve eşit varyans tespit etmek için yapılır ama aynı zamanda kontrol mutant grubun dağılımlarını karşılaştırmak sınar. </li><li> Yaşlanma üzerinde veri sunmak ilerici bir açığı (Şekil 4) olup olmadığını görmek için farklı yaşlardaki sinekler 120 sn (2 gün, 1 hafta, 2 hafta) tırmanma sinekler yüzdesini arsa için. </li></ol>

<ol><li>Auluck, P. K., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+prevention+of+Parkinson+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila.</a> Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).</li>
<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+protein+synthesis+in+Drosophila+fragile+X+mutants+impairs+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory.</a> Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).</li>
<li>McBride, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+rescue+of+synaptic+plasticity%2C+courtship+behavior%2C+and+mushroom+body+defects+in+a+Drosophila+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome.</a> Neuron. 45, 753-764 (2005).</li>
<li>Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+epilepsy%3A+bss+is+a+gain-of-function+mutation+in+the+para+sodium+channel+gene+that+leads+to+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures.</a> Genetics. 187, 523-534 (2011).</li>
<li>Marley, R., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+persistent+Na%2B+current+contributes+to+seizure+in+the+slamdance+bang-sensitive+Drosophila+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant.</a> Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Mutants+Of+Drosophila+Isolated+By+Countercurrent+Distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Ganetzky, B., Flanagan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relationship+between+senescence+and+age-related+changes+in+two+wild-type+strains+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster.</a> Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+Drosophila+melanogaster+geotaxis%2C+a+complex+behavioral+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait.</a> Nature genetics. 31, 349-353 (2002).</li>
<li>Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+simple+gravity+sensing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster.</a> Nature protocols. 5, 20-25 (2010).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Botella, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+carbonyl+reductase+sniffer+prevents+oxidative+stress-induced+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration.</a> Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
<li>Chakraborty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Drosophila+Alzheimer%27s+disease+model%3A+pharmacological+rescue+of+cognitive+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects.</a> PLoS One. 6, e20799(2011).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-related+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+are+ameliorated+by+treatment+with+vinblastine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine.</a> J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).</li>
<li>Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLehmann%2C+EL+%22Nonparametrics+%3A+statistical+methods+based+on+ranks%22">Nonparametrics : statistical methods based on ranks</a>. , 1st edn, Springer. (2006).</li>
<li>Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spastin+regulates+synaptic+microtubule+networks+and+is+required+for+normal+motor+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function.</a> PLoS biology. 2, e429(2004).</li>
<li>Inlow, J. K., Restifo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+comparative+genetics+of+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular and comparative genetics of mental retardation.</a> Genetics. 166, 835-881 (2004).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila.</a> Genetics. 161, 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Drosophila önce Parkinson hastalığı 14 ve diğer nörodejeneratif koşulların 1,2 mükemmel bir modeli olduğu kanıtlanmıştır. Drosophila uygun genetik araçlar ek olarak, kendi genomu yüksek nörolojik bozuklukların 19 katılan genler için muhafaza edilir. (Bütün exome sıralama dahil) genom genetik tarama yöntemlerinin gelişi insan hareketi bozuklukları ile ilişkili aday genlerin büyük bir listesini sunmak için devam etmesi muhtemeldir. Bu durumlar için tedavilerin geliştirilm...

Parkinson hastalığı, amiyotrofik lateral skleroz, kalıtımsal spastik parapleji yıkıcı nörodejeneratif bozukluklar giderek daha kabul edilmektedir. Ne yazık ki, bu nörodejeneratif bozuklukların en işlemler olmaksızın halen devam etmektedir. Bu tür genlerin artan sayıda yol açmıştır bütün exome sıralama olarak genom, tarafsız genetik testlerin yaygın klinik kullanımı, insan lokomotif bozukluklar karışması. Bu ilerlemeye rağmen, erken ve geç aşamalarında patolojik ilerleme, bu hastalıklarda zor kalır. Drosophila kontrollü mekansal ve zamansal bir şekilde gen gereksinimi eğitimi için genetik araçları ile tek sağlar. Buna ek olarak, Drosophila gibi Parkinson 1, Alzheimer 2, zihinsel engelli 3,4 ve diğerleri arasında epilepsi 5,6 gibi nörolojik durumlar için ilaç tarama yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Amacımız etkili bir maliyet geliştirmektive güvenilir tahlil hala motorun performansında küçük değişiklikleri tespit etmek yeterli duyarlı olacağını yüksek verimli analizi izin verecek. Drosophila tırmanma davranışı üzerinde genetik mutasyon ve / veya çevresel durumun etkisini ölçmek için kullanılan çeşitli tahliller vardır. Tahlillerin çoğu olumsuz geotaxis veya tırmanma deneyi olarak bilinen tırmanmaya sinekler, doğal eğilim yararlanmak. Benzer 7 phototaxis çalışma için kullanılan karşı akım cihazı ayrıca gravitaxis incelemek için kullanılabilir ki 1967 önerdi. O günden bu yana, Ganetsky 8 ve diğerleri 9 -12 ilk tahlil üzerine inşa etmişlerdir. prensip şişe içinde sinekler bilinen bir dizi yerleştirin ve sinekler şişenin dibine düşmeye neden sert bir yüzeye şiddetle karşı flakon dokunun etmektir. Bu doğuştan gelen bir davranış olduğundan, sinekler yerçekimine karşı flakon üst tırmanmaya çalışacaktır. Bu deney, nicel ve measu olankaç sinekler res bir ayrılan süre içinde flakon üzerinde bir işaretleyici geçmiş tırmandı. Hız yerine sinekler tırmanma toplam sayısının ölçülmesi güvenilir bir parametre haline ve sinekler kriterlerin sayısı 13 anlamlı değildi durumlarda kusurları göstermiştir. Tırmanma deney Parkinson hastalığı 14 de dahil olmak üzere pek çok nöro-dejeneratif hastalıkların incelenmesinde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, nörodejenerasyon önceden patolojik çalışmalar 14 görülür burada lokomotif bozukluklar zamanda ölçemeyebilirler kaydetti. Böylece, geleneksel testin kullanılması hastalığın patogenezinde erken aşamalarında incelemek için yeteneğini sınırlayabilir. patoloji sonraki aşamalarında lokomotif kusurların görünümünü olan ilerleme tam kurtarılması için çok gelişmiş bir hastalık yansıtabilir. Bu geleneksel tırmanma testinin duyarlılığı ile potansiyel bir sorun ortaya çıkarmaktadır. gelenek potansiyel yetersizlikHafif lokomotif kusurları tespit etmek için tahlil tırmanma arası sinekler tırmanmaya gerekli olan yüksekliği isnat edilebilir. Geleneksel deneyi 15,16 ölçer sineklerin sayısı başarılı bir şekilde 20 saniye için 10 içinde 2-5 cm&#39;lik bir yüksekliğe tırmanmaya.

<table><tbody><tr><td>Drosophila stokları</td><td></td><td></td><td>Stoklar, deneylere bağlı olarak seçilir. Sineklerin çok statik veya çok ıslak olmasını önlemek için odadaki ve kuvözdeki sıcaklık ve nem kontrol edilmeli ve tutarlı olmalıdır.</td></tr><tr><td>Video kamera</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir dijital video kamera işinizi görecektir. Yakın nesneye odaklanabildiklerinden emin olun.</td></tr><tr><td>Dereceli silindir</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>Farklı dereceli silindir modelleri farklı çaplara sahip olabilir. Bu nedenle yüksekliği ölçmek önemlidir.</td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir model yapacak. Bilgisayarı, sineklerin tırmanışını izlemek ve her zaman noktasındaki sinek sayısını kaydetmek için kullandık.</td></tr></tbody></table>

nörodejeneratif hastalıkların bir drosophila modelinde tırmanma kusur kantitatif analiz

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Nörodejeneratif hastalıkların kaynaklanan kusurlar Lokomotif subklinik dejenerasyon yıl sonra, hastalığın geç başlangıçlı belirtisi olabilir ve böylece güncel tedavi tedavi stratejileri küratif değildir. Bütün exome sekanslama kullanımı sayesinde, genlerin artan sayıda insan hareket bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Bu genlerin tanımlanması rağmen, bu genler, normal lokomotif işleyişi için çok önemlidir kadar bilinmemektedir. Bu nedenle, tedavi edici ilgi yeni hedefler belirlemek için bu genlerin rolünü aydınlatmak için model organizmalar kullanan güvenilir bir tahlil, her zamankinden daha fazla ihtiyaç vardır. Biz daha önce hafif kusurların tespiti için izin verir ve zamanla bu hataları değerlendirmek için yeteneğine sahiptir negatif geotaxis testin bir hassaslaşmış versiyonunu tasarladık. Bir bardak gerçekleştirilir tahlil bir mum bariyer film ile kapatılır silindir, mezun oldu. Eşik mesafesi arttırarak 17.5 c tırmandı içinm biz hafif hareketlilik bozuklukları tespit daha büyük bir duyarlılık gözlemledik 2 dk deneme süresinin artırılması ve. Tahlil maliyetli ve yüksek tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek kapsamlı bir eğitim gerektirmez. Bu hareket kusurları ile Drosophila mutantlar aday ilaçların taranması için mükemmel bir tekniktir yapar.

Tırmanma güçlü ve tekrarlanabilir bir davranıştır. (- 30 sn 25) Gerçekten de, bir gün eski vahşi tip sinekler hızla hedef mesafesi tırmanma performansı ulaşır. Mutant sinekler hedefe tırmanmaya yetersizlik tamamlamak için hafif (ya da gecikmiş) için performans bir dizi sunuyoruz. Biz iki farklı mutant allel burada bunu göstermektedir. Birincisi Spastin geni (kaplıcalar 5.75) 18 tam bir silinmesi ile neden olduğu gen Spastin ciddi bir allel. Bu hat (kaplıca TM6b ile 5.75) &#39;de bir gün eski sinek ...

Drosophila melanogaster'de nörodejeneratif bozukluklar için bir model olarak optimize edilmiş, ucuz ve güvenilir bir negatif jeotaksi testi sunuyoruz. Hafif lokomotor kusurlara karşı daha hassas olan bu test, potansiyel genetik etkileşimlerin ve ilaç hedeflerinin taranmasına yardımcı olacaktır.

Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Bu prosedürün genel amacı, yaban tipi sineklerin ve lokomosyonla ilgili genlerde mutasyon taşıyan sineklerin tırmanma yeteneklerini nicel olarak belirlemektir. Bu işlem, öncelikle sineklerin dereceli bir cam silindire aktarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda ise silindir köpük bir ped üzerine hafifçe vurularak sinekler silindirin tabanına itilir.Hedef hattını geçen sonraki sinekler, bir video kamera kullanılarak iki dakika boyunca kaydedilir. Son adım, videoların analiz edilmesi ve her 10 saniyede hedef hattının üzerinde bulunan sinek sayısının grafik haline getirilmesidir. Nihayetinde, tırmanma deneyi, meyve sineklerinin mutant hatlarındaki tırmanma yeteneği kusurlarını belirlemek için kullanılır.Bu tekniğin veya "wild" yöntemi gibi mevcut tekniklerin temel avantajı, tırmanma yeteneğindeki küçük farklılıkları tespit edebilme kapasitesine sahip olmalarıdır. Bu yöntem, spesifik genlerin herediter spastik paraplejinin ilerleyici yürüyüş bozukluğu üzerindeki rolü gibi nörodejeneratif bozukluklar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin uygulanabilirliği, tedavi geliştirilmesine yöneliktir.Nörolojik bozukluklar için IP, ilaç yanıtını ve aday nörodejeneratif genler için mutantları test etmeye yönelik basit bir kantitatif analiz sağladığı için kullanılır. Karbondioksit kullanarak 20 sineği anestezi ederek başlayın ve tüm sinekleri içinde besin bulunan 25 mm x 95 mm'lik bir toplama tüpüne yerleştirin. Ardından, sineklerin tüpün tabanında birikebilecek herhangi bir sıvıya yakalanmasını önlemek için sinekleri içeren tüpü bir karton tepside yatay olarak saklayın. Sinekleri 12 saatlik ışık-karanlık döngüsü altında en az 21 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi sabah, sinekleri tüpten 250 mL'lik cam mezürle bir silindire aktararak tırmanma analizini hazırlayın ve sineklerin kaçmasını önlemek için üst kısmı mum filmi ile mühürleyin.Deneyi 22 °C sıcaklıkta, %40 nemde ve ortam ışığında gerçekleştirin. Uyku döngüleriyle ilgili karıştırıcı faktörleri önlemek için deneyleri her zaman günün aynı saatinde yapın. Ayrıca, silindirin tezgah üzerindeki konumunu, her gün sabit kalmasını sağlamak için işaretleyin.Silindirin tabanındaki ve besin şişelerindeki ölü sinek sayısını sayın ve bu sayıyı mortalite olarak kaydedin. Ardından, video kamerasını bir tripoda yerleştirin. Kamerayı, 250 mililitrelik dereceli silindirin 190 mililitre çizgısına çok hafifçe odaklayın.Sinekleri iç alt yüzeye kaydıracak kadar kuvvetle silindiri kapalı hücreli köpük pedine beş ila 10 kez vurun. Ardından diğer elinizle kameranın kayıt düğmesine basın. Kamera kayıt yaparken silindiri belirgin, ritmik olmayan bir örüntüyle altı kez vurun.Her denemeyi, sineklere son kez vurulduğu andan itibaren iki dakika boyunca sürdürün. Son olarak, sinekleri %95 etanol içinde imha edin. Deneme tamamlandığında, gruplar arasındaki lokomosyondaki küçük farkları tespit etmek amacıyla, her seferinde 20 taze sinek kullanarak bu tırmanma analizini 10 kez tekrarlayın.Silindirleri bulaşık makinesinde yıkayın ve deney tamamlandıktan sonra sinek performansını analiz etmek için yeniden kullanılmak üzere gece boyunca kurumaya bırakın; işleme her bir sinek deneme kaydının videolarını izleyerek başlayın. Her 10 saniyede hedef çizgiyi geçen toplam sinek sayısını kaydedin. Eğer bir sinek geri aşağı tırmanırsa veya düşerse, o sineği eksi bir olarak kaydedin ve hedef çizgiyi geçen bir sonraki sineği, geri tırmanan veya düşen sinekle aynı sayı olarak sayın.Örneğin, 15. sinek hedef çizginin altına düşerse, çizgiyi geçen bir sonraki sinek 16. değil, 15. sinek olarak kabul edilir. Ardından, deney alanında kalan sinek sayısını elde etmek için toplam sinek sayısından mortaliteyi çıkarın. Şiddetli mutasyonlarla çalışırken, her zaman noktasında hedef çizginin üzerinde kalan sineklerin yüzdesi kullanılarak, farklı tırmanma kusuru dereceleri farklı tırmanma analizleri ile görülebilir.Burada, 18 saniye sonra boş bir besin tüpünün üst kısmına tırmanan sekiz günlük sineklerin sayısı kaydedilmiş ve iki grup arasında tırmanma davranışı açısından anlamlı bir fark görülmemiştir. Öte yandan, bu protokoldeki tırmanma testi kullanıldığında, Bastin 17 dash seven over TM three mutant sinekleri, kontrollere kıyasla performans eksikliği göstermektedir. Birçok lokomotor bozukluk progresif seyrettiği için, sineklerin zaman içindeki gelişimini gözlemlemek önemlidir.İki günlükken, hedef çizginin üzerine çıkan sinek sayısında kontrollere kıyasla anlamlı bir fark vardır. Bu tırmanma performansı, mutant sinekler iki günden itibaren yaşlandıkça azalmaya devam eder.Bu deney ve analiz, yöntem kavrandıktan sonra üç saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, nörolojik bozukluklar için dola mutant modellerindeki lokomotor kusurların nasıl nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

quantitative-analysis-climbing-defects-drosophila-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Davranış testleri, lokomotor fonksiyonları ölçme öğrenme ve hafıza...

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Bu video, sinek hareketini ölçmek için basit bir yöntemi açıklar ve gerçekleştirilen tırmanma testini gösterir. Sinek tırmanma testi, negatif bir jeotaksi tepkisine dayanan genel bir motor fonksiyon testidir.

Sinek Tırmanma Deneyi: Drosophila melanogaster'de Genel Hareketi Test Etmek İçin Bir Yöntem

Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri...

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Drosophila yaygın nörodejenerasyonu incelemek için bir model sistem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, beyinde vakuol oluşumu ile tespit edildiği üzere, sayısal edilebilir dejenerasyonu bir yöntemi tarif etmektedir. Aynı zamanda dolayı bir örnek olarak işleme ve kesit kontrol ve deney sinekler tarafından deneysel prosedüre etkileri en aza indirir.

Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize<em&gt; Drosophila</em

Bu adım adım protokolü Drosophila negatif geotaxis davranışı sinekler yüzlerce ev sahipliği yapan ve eylemlerinin bir elektrik motoru ile eşitler otomatik çoklu silindir sistemi kullanarak çözümler. Eşitleme sinek negatif geotaxis davranış, dijital kaydedilen ve analiz kendi kendine tasarlanmış RflyDetection yazılım kullanarak denetlesinler.

Ateş, Drosophila modeli yetişkin tırmanma davranışı çözümlemek için bir otomatik hızlı yinelemeli negatif Geotaxis tahlil

Bu iletişim kuralı dendritik morfogenez çalışmaları için kullanılan Drosophila, nöronal dendritik arborization karmaşıklık (NDAC) kantitatif analiz üzerinde duruluyor.

Kantitatif analiz Drosophila nöronal dendritik Arborization karmaşıklığı

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

Bu işlemin amacı Drosophila melanogasterkullanarak nörodejeneratif hastalık modellerinde DLM nöromüsküler kavşaklar (NMJs) yapısal bütünlüğünü değerlendirmek için dorsal uzunlatanal kas (DLM) doku incelemektir.

Nörodejenerasyon ile Birlikte Erişkin Drosophila'da Sinaptik Dejenerasyonun Görselleştirilmesi

Mevcut protokol, Drosophila'nın lokomotor aktivitesini, hız, mesafe vb. parametreleri hesaplamak için yüksek tanımlı video kaydına dayalı olarak her karenin piksellerini segmentlere ayırmak için eklentilerle uyumlu açık kaynaklı yazılım Fiji'yi kullanarak el yapımı bir arenada sineklerin hareketini izleyerek ve analiz ederek değerlendirir.

Drosophila'da Lokomotor Aktiviteyi Test Etmek İçin Basit Bir Teknik

Bu protokol, Parkinson hastalığının alfa-sinüklein bazlı Drosophila modelinde kabızlığın modellenmesi için bir test sunar.

Parkinson Hastalığının Drosophila Modelinde Kabızlığın Ölçülmesi

Protokol, geleneksel memeli modellerine bir alternatif olarak lokomotor disfonksiyonun nicelleştirilmesi yoluyla meyve sineğindeki nörotoksisiteyi değerlendirmek için yüksek verimli, uygun maliyetli bir yöntem sunar. Farmasötik bileşiklerin, çevresel ajanların veya genetik modifikasyonların nörotoksik etkilerini hassas, tekrarlanabilir ve etik açıdan uygun bir model kullanarak değerlendirmeyi amaçlar.

Drosophila melanogaster'de Lokomotor Disfonksiyonun Nörotoksisite için Bir Okuma Olarak Davranışsal Analizi

Öğrenin Drosophila melanogaster'da negatif jeotaksi testiyle tırmanma kusurlarını niceliksel analiz etmeyi. Bu hassas yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda genetik etkileşimleri ve ilaç hedeflerini taramak için kullanılır.

Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz

Daha fazla video keşfet