Name: Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Öğrenin fare periton makrofaj izolasyonu ve Toll-benzeri reseptör uyarımı sonrası gen ifadesi analizi yöntemini. Bu protokol immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi bir hibe ile desteklenmiştir (NSERC, hayır 298515-2011 hibe). AL doktora almıştır Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi ve MS burs (hayır verin. MOP123246 CIHR), Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri bir hibe desteklenmiştir.

Tüm işlemler Centre de recherche du Centre Hospitalier de l&#39;Université de Montréal kurumsal Hayvan Bakım Komitesi (CRCHUM) tarafından onaylandıktan sonra Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi&#39;ne göre yapıldı. 1. İzolasyon, Kimlik ve Kültür Kemirgen Periton Makrofagların <ol><li> % 3.8 bira tiyoglikolat orta hazırlayın. Bunu yapmak için, damıtılmış su içinde 1000 ml tiyoglikolat vasatı içinde 38 g askıya almak için. Tamamen orta çözmek için kaynamaya çözüm getirin. 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklav ile sterilize edin. RT 18 at, karanlıkta 3 aya kadar saklayabilirsiniz. NOT: Bulanıklık bakteriyel kontaminasyon işaret eden gelişirse atın. Steril tutulması durumunda çözüm karanlıkta bir yıla kadar muhafaza edilebilir. </li><li> Her MZ&#39;nin periton boşluğu içine% 3.8 Brewer, tiyoglikolat vasatı 1 ml enjekte edilir, 23 G iğne takılı 1 ml şırınga kullanılarakse 3 gün bekleyin ve. Her fare için yeni şırınga ve iğne kullanın. </li><li> Sodyum pentobarbital (100 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile fareler anestezi ve servikal dislokasyon ile farelerin euthanize. Solunum hızı kontrol ederek uygun anesthetization onaylayın. Genellikle hızlı Solunum fare derin anestezi yapılmadan olduğunu göstermektedir. </li><li> % 70 etanol ile her bir farenin karın yıkayın. Bir makas kullanarak, periton alt orta hat boyunca bir yanal kesi yapmak. </li><li> Bir forseps kullanarak, şeffaf periton cilt ortaya çıkarmak için karın cilt geri çekin. 20 G iğne takılı 5 mi şırınga kullanarak, her bir farenin karın boşluğu içine soğuk DPBS 5 ml enjekte edilir. </li><li> Periton boşluğuna üzerinde yumuşak bir masaj yapın ve sonra herhangi bir organı delinmesiyle olmadan dikkatlice sıvıyı aspire. İğneyi çıkarın ve 50 ml konik santrifüj tüplerine periton sıvısı dağıtmak. </li><li> Soğutuculu santrifüj 400 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj.Hücreler tüm prosedür sırasında soğuk kalmalıdır. RPMI ortamı 1640 süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini atın. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak, hücrelerin sayısı ve 1 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğuna kadar ayarlayın. </li><li> F4 / 80 karşı fare ve Antikorların başına 1 x 10 6 hücreleri kullanılarak akış sitometrisi ile izole edilmiş hücrelerin fenotipini karakterize (bir yüzey antijeni makrofajlar üzerinde ifade edilir). </li></ol> 2. Hücre Tedavileri <ol><li> Doğrudan, izolasyondan sonra, her kuyuya 1 x 10 6 hücre ekleyin. 37 ° C&#39;de 1 saat ila 2 içinde kültürlenmesi ile 6-çukurlu plakalara yapışmaya sıçan periton makrofajları, bırakın. Hafifçe sıcak PBS ile 3 kez yıkanarak yapışmayan hücreler çıkarın. </li><li> Daha sonra, 900 ul serum içermeyen DMEM içinde kültür hücreleri, şu TLR ligandlar varlığında, 24 saat süre ile (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0.5 mg / ml); Poli (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) LPS-TLR4 (100 ng / ml); flagellin&#39;e TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 ug / ml); ODN1826-TLR9 (1 uM). NOT: Her ligand 10x stok solüsyonu için hazırlayın. Bu şekilde, bir 10-kat seyreltme yapılarak, her bir ikincisi, 100 ul ekle. </li></ol> 3. RNA İzolasyon <ol><li> Bir pipet ile birkaç kez her kuyuya, 1 ml Trizol eklenmesi ve hücre lizatı geçen altı oyuklu plakalar içinde doğrudan tüm orta ve lize hücreleri çıkarın. Nükleoprotein kompleksinin tam bir ayrışma izin vermek için, oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca homojenize örnekleri inkübe edin. </li><li> 1.5 ml lizat transfer RNase- ve DNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpleri. 1ml TRIzol başına 0.2 ml kloroform ekleyin. 15 saniye boyunca elle kuvvetli bir şekilde tüpleri çalkalanır ve 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Bir düşük değerli kırmızı renkte bir faz (fenol-kloroform) ayrılarak karışımı, bir faz ve renksiz bir üst sulu faz dikkate alınmalıdır. RNA, sulu faz içinde özel olarak kalır. </li><li> Traninterfazda bozmadan, yeni bir tüpe Sfer dikkatle üst akıcı faz. Izopropil alkol, 0.5 ml ile karıştırılarak bu RNA hızlandırabilir. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de 10 dakika santrifüj boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. RNA tüpün yan ve alt beyaz pelet oluşturan çökeltileri. </li><li> Süpernatantı. % 75 etanol içinde bir kez 1 mL RNA pelet yıkayın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 7500 x g&#39;de vorteks ve santrifüj ile örnekleri karıştırın. Kısaca RNA (10 dakika boyunca hava kuru) kurutun. 0.1 mi DEPC (RNaz içermeyen su) içinde RNA eritin ve 55 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak RNA niceliğini. Bunu yapmak için numuneler DEPC su içinde 100 kez seyreltilmesi ve 260 nm dalga boyunda okundu. RNA konsantrasyonu daha sonra olacak: OD 260 x 40 ng / ul x seyreltme faktörü. </li><li> RNA konsantrasyonları eşitlemek ve İlk Strand cDNA Sentezi Kit RT-PCR Sistemi kullanılarak üreticinin talimatlarına göre cDNA sentez. Olaraküreticinin talimatlarına göre gerçek zamanlı PCR, bir gerçek zamanlı DNA tespit sisteminde (45 devir) ile gen mRNA seviyelerini ölçer. Örnek β-aktin ve GAPDH için iki temizlik geni ile gen ekspresyon düzeyleri Normale. NOT: ml 500 ug / RNA konsantrasyonu Normale ve cDNA sentezi için 0.5 ug kullanın. </li></ol>

<ol><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophic+macrophages+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trophic macrophages in development and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Koury, M. J., Ponka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+erythropoiesis%3A+the+roles+of+folate%2C+vitamin+B12%2C+and+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron.</a> Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).</li>
<li>Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-heme+induction+of+heme+oxygenase-1+does+not+alter+cellular+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism.</a> J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).</li>
<li>Hershko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+iron+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Hematol%22%5BJournal%5D)">Storage iron regulation.</a> Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).</li>
<li>Collins, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Withholding+iron+as+a+cellular+defence+mechanism--friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe.</a> Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).</li>
<li>Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+reticulo-endothelial+cell+in+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism.</a> Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).</li>
<li>Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signal+adaptor+protein+MyD88+is+required+for+sustained+endotoxin-induced+acute+hypoferremic+response+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice.</a> Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).</li>
<li>Zumerle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+hepcidin+in+the+liver+recapitulates+the+hemochromatotic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype.</a> Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).</li>
<li>Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+expression+and+iron+transport+in+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).</li>
<li>Nemeth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin%2C+a+putative+mediator+of+anemia+of+inflammation%2C+is+a+type+II+acute-phase+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein.</a> Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).</li>
<li>Nemeth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+regulates+cellular+iron+efflux+by+binding+to+ferroportin+and+inducing+its+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization.</a> Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).</li>
<li>Constante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+Hfe+in+basal+and+induced+hepcidin+levels+in+iron+overload+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+X+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+thioglycolate+on+phagocytic+and+microbicidal+activities+of+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages.</a> Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).</li>
<li>Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+thioglycollate+on+macrophage+lysosomal+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes.</a> Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).</li>
<li>Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+products+in+aged+thioglycollate+medium+enhance+the+elicitation+of+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages.</a> J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).</li>
<li>Layoun, A., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+wall+constituents+induce+hepcidin+expression+in+macrophages+through+MyD88+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling.</a> Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).</li>
<li>Oppenheim, J. J., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarmins%3A+chemotactic+activators+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alarmins: chemotactic activators of immune responses.</a> Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).</li>
<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+recognition+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li>
<li>Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+gene+expression+in+activated+and+resting+primary+macrophages+by+IL-10%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10.</a> J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+murine+macrophages+from+bone+marrow%2C+spleen+and+peritoneum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum.</a> BMC Immunol. 14 (6), (2013).</li>
<li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).</li>
<li>Cannon, G. J., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+capacity+for+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The macrophage capacity for phagocytosis.</a> J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).</li>
<li>Wang, Y., Harris, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in renal disease.</a> J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).</li>
<li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li>
<li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica%3A+defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).</li>
<li>Schleicher, U., Bogdan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+culture+and+flow-cytometric+characterization+of+primary+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages.</a> Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Makrofajlar hayatta kalmak için çok önemlidir ve immünolojik hedefler için ana işlemek için cazip bir hedef sağlar. TLR ve diğer tanıma moleküllerinin keşfi immünolojik tartışmaların merkezine makrofajlar yaptık. Makrofajlar sitokinler, hasar ile ilişkili molekül model molekülü (DAMPS), 20 ve patojenlerin (PAMPs) 21 grupları ile ilişkili moleküller de dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara, yanıt. Bu farklı uyaranlara yanıt makrofaj aktivasyonu seyrini temsil etmektedir ve genellikle gen ekspresyonu ...

retiküloendotelyal fagositik sistemi, kemik iliği, kan, karaciğer ve dalak gibi çeşitli dokularda ve organlarda hücrelerden oluşmaktadır. Makrofajlar yoğun bunlar, özellikle doğuştan katılmak ve kontrol bağışıklık tepkilerini ve net enfeksiyonları uyarlamalı vücudun etrafında dağıtılır. Host savunmasında rollerine ilave olarak, makrofajlar, yara iyileşmesi ve doku homeostazını 1,2 muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca, makrofajlar bağışıklık işlevi sadece önemli değil, aynı zamanda aktif demir homeostazda 3 katılacak. Vücutta demir yaklaşık% 80&#39;i yaşlanmış makrofajlar tarafından fagosite 4 hangi zaman, eritrositler içinde hemoglobin bulunur. Günlük, bu makrofajlar eritrosit kaynaklı demir 25 mg geri dönüşüm ve plazma 5 içine ulaşım sağlamaktadır. Ayrıca, enfeksiyon ve enflamasyon sırasında, pro-inflamatuar makrofajlar demir availabili azaltmak için serum demir çekilmekhem sistemik ve yerel düzeylerde 6-8 patojenlerin için ty. Makrofajlar ve özellikle hepatositler demir metabolizmasının 9, 10 master regülatörü olarak kabul edilir hepsidin adında bir antimikrobiyal peptid üretmek Yanı sıra, çalışmalar göstermiştir. Hepsidin esas inflamatuar uyaranlara artmış ve kronik inflamasyon 11-13 üzerine makrofaj demir haciz kısmen sorumludur. Makrofajlarda hepcidin ifadesi çok iyi anlaşılamamıştır, biz bu yönetmelikte Toll benzeri reseptörler olası rolünü (TLR) okudu. TLR&#39;ler öncelikle makrofajlar üzerinde bulunan ve aktivasyon merkezi bir rol oynarlar. Buna ek olarak, karaciğer LPS kaynaklı Hepsidin sentezleme TLR4 13 bağlıdır. Bu nedenle, çalışma çalıştırmak için, Sıçan peritonal makrofajları izolasyonu dayanan bir yöntem kullanılır. Makrofaj hücre dizileri genel olarak, makrofaj saplama kullanılanler; yine genişletilmiş kültür geni kaybını kışkırtmak ve bu hücre hatlarında bağışıklık fonksiyonları azalmış olabilir. Bu nedenle, periton boşluğundan makrofajların izolasyonu önemlidir. Fare periton boşluğu makrofajlar 13-15 hasat için ideal bir siteyi sunuyor. İzole fare periton makrofajlar onların immünolojik fonksiyonu ile ilgili çeşitli çalışmalar için uygundur. Ancak, periton makrofajların sayısı geniş çalışmalar için yetersiz ve fare başına yaklaşık 1 x 10 6 makrofajlar tahmin edilmektedir. Bu nedenle, makrofaj üretimini artırmak için, örneğin tiyoglikolat gibi steril ortaya çıkarma maddesi, hücre hasat Yukarıdaki periton boşluğu içine enjekte edilmiştir. Tiyoglikolat enjeksiyonundan sonra, fare başına makrofajların verimi 10-kat artmıştır. Makrofajlar verim, makrofajlar alımı, MA içinde elde edilen, bir enflamatuvar yanıtı indükleyen bir tahriş edici olarak Brewer, tiyoglikolat vasatı eylemleri artışa rağmeny, ancak gerekli değildir, gen ekspresyonunu etkiler. Bu nedenle, muamele edilmemiş makrofaj oluşan bir kontrol grubudur, her bir deney içinde dahil edilmelidir. Bizim ellerde, çok inflamasyon ile uyarılır hepsidin ifade periton makrofajlar ortaya dışı muamele tiyoglikolatın saptanmadı. Ayrıca, çalışmaların Bira tiyoglikolat sayıda makrofajların, fakat bunlara 16 aktive etmediğini göstermiştir. Öte yandan, Bira tiyoglikolat makrofajlar lizozomal enzim bir artış ancak yutulur mikroorganizmaları öldürme 17 azalma gösterdi ortaya çıkardı. Olmayan tetiklenen makrofajlar 16 ile karşılaştırıldığında, ancak, fagositik kapasitesi etkilenmedi. Yemekler kültürlenen sonra peritoneal makrofajlar nedenle periton boşluğu izole diğer hücre türünden bunların ayrılmasına izin veren, yapışkan hale gelir. Daha sonra izole edilmiş makrofajlar, farklı TLR agonistleri ile tehdit edildi.Son olarak, mRNA, kültürlenmiş hücrelerden ekstrakte edildi ve gen ekspresyonu kantitatif ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanılarak analiz edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6 fareler</td><td>Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, ABD)</td> <td>475</td><td></td></tr><tr><td>Tiyoglikolat</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td> <td>19032-500G</td><td></td>%</tr><tr><td>70 etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr>% <tr><td>10 sodyum pentobarbital (Fare anestezisi için kullanılır (80 mg / kg, ip))</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Fosfat tamponlu salin (DPBS), buz üzerine yerleştirilir ve makrofajların hasat edilmesine hizmet eder</td><td>WISENT INC Canada (QC)</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI ortamı 1640 (Penisilin, streptomisin, L-glutamin ve% 10 fetal buzağı serumu ile takviye</td>).<td>WISENT INC Kanada (QC)</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>1 ve 5 ml şırıngalar</td><td>BD ABD (NJ)</td><td></td><td></td></tr>309659 <tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Corning Incorporated (NY, ABD)</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyel lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg / ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, ABD)</td><td>TLRL-pm25</td><td></td></tr><tr><td>Poliiyonozin&ndash; polisitidlik asit (Poli(I:C)) (10 mg/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, ABD)</td><td>Escherichia</td> coli 055:B5'ten (100 ng/ml)InvivoGen (San Diego, ABD)L2880'den saflaştırılmış <td></td></tr><tr><td>flagellin Salmonella typhimurium (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, ABD)</td><td>TLR-FLIC-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Lipoprotein sentetik FSL1 (100 ng/ml)InvivoGen (San Diego, ABD)TLR-FSL <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 uzun terminal tekrarından türetilen ssRNA, ssRNA40 (1 & mu; g/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, ABD)</td><td>TLR-LRNA-40</td><td></td></tr><tr><td>Tip B CpG oligonükleotid ODN1826 (1 & mu; M)</td><td>InvivoGen (San Diego, ABD)</td><td>11B16-MM</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen, (Burlington, ON, Kanada)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>20 G ve 23 G iğneler</td><td>BD ABD (NJ)</td><td></td><td></td></tr>305175 <tr><td>Makaslı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml buz üzerine yerleştirilmiş konik tüpler</td><td>Sarstedt (Newton, MA, ABD)</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Kan Hücreleri Lizis Tamponu</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td> <td>R7757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4 / 80 antikor</td><td>BIO-RAD (CA, ABD),</td><td></td><td></td></tr> MCA497APC <tr><td>CD16 / CD32 antikorları</td><td>Pharmingen, {Mississauga, ON, CA)</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>Coulter Epics Elite sayacı, Coulter, (Hialeah, FL, ABD)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1.5 ml Eppendorf tüpleri</td><td>Axygen Scietific (CA, ABD)</td> <td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific (ON, Kanada)</td> <td>UN1888</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>JT Baker (PA, ABD)</td> <td>70566</td><td></td></tr><tr><td>% 75 etanol (DEPC ile arıtılmış suda)</td> <td>Ticari Alchohols (QC, Kanada)</td> <td>17394</td><td></td></tr><tr><td>% 0.01 dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış su (gece boyunca bekletilsin ve otoklav)</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>216.542.8</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript RT-PCR sistemi</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Kanada)</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Gene 3000</td><td>Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Kanada)QuantiTect</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SYBR Green I PCR kitleri</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Kanada)</td><td>204141</td><td></td></tr></tbody></table>

fare periton makrofagların izolasyonu toll-benzeri reseptörler uyarım üzerine gen İfadesi analizi yapacak

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Enfeksiyon ve inflamasyon sırasında dolaşımdaki monositler kan dolaşımına bırakın ve onlar makrofajlar içine ayırt dokulara, göç. Makrofajlar mikroorganizmaların geniş bir yelpazede evrimle korunmuş moleküler şekilleri tanıyan yüzey Toll-benzeri reseptörler (TLR), ifade eder. TLR genellikle gen ekspresyonu değiştirilmesi ile ilişkili makrofaj aktivasyonunda önemli bir rol oynar. Makrofajlar pek çok hastalıkta önemli ve tedavisi için çekici bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. Aşağıdaki protokol, bira, tiyoglikolat vasatı kullanılarak sıçan periton makrofajları, izole edilmesi için bir prosedür açıklanmaktadır. İkincisi buna göre bu 10 kat makrofaj verim çıkaracağız, periton içine monosit göçü artıracak. Pek çok çalışma, kemik iliği, dalak veya periton türetilmiş makrofajlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ancak, periton makrofajlar izolasyon üzerine daha olgun olduğu gösterilmiştir ve bunların fonksiyonel olarak daha kararlı edildiSığ ve fenotip. Böylece, fare periton boşluğuna izole makrofajlar farklı immünolojik ve metabolik çalışmalarda hizmet verebilir önemli bir hücre popülasyonu sunuyoruz. İzole bir kez, makrofajlar farklı TLR ligandları ile uyarıldı ve dolayısıyla gen ifadesi değerlendirildi.

İlk akış sitometrisi ile izole edilmiş sıçan periton makrofajları, karakterize edilir. Bunu yapmak için, özellikle yalnızca makrofajlar tarafından ifade edilen markerler tanır (F4 / 80) antikorları kullanılmıştır. Bu karakterizasyon izole makrofaj yüzdesini belirlemek için ve izolasyon işlemi sırasında elde edilen hücreler arasında onları ayırmak için gereklidir. (Şekil 1) gösterildiği gibi, hücrelerin yüzdesi F4 / 80 sürekli olarak% 95 üzerinde olduğu tespit edilmiştir antijeni eksprese eden. Daha sonr...

Burada murin peritoneal makrofajları izole etmek için basit bir protokolü açıklıyoruz. Bu prosedürü, Toll benzeri reseptörlerin uyarılması üzerine gen ekspresyon analizi yapmak için RNA ekstraksiyonu takip eder.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Bu prosedürün genel amacı, fare periton makrofajlarını izole etmek ve toll-benzeri reseptörlerin stimülasyonu üzerine gen ekspresyon analizi gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle monositlerin peritona göçünü artırarak makrofaj verimini yükseltmek amacıyla farenin periton boşluğuna %3,8'lik brewer thi glyco ortamı enjekte edilerek gerçekleştirilir; üç gün sonra fare ötanize edilir ve hücreleri toplamak için periton boşluğuna soğuk ECCOs fosfat tamponlu salin enjekte edilir.Peritonal boşluğa hafif bir masaj uygulandıktan sonra, peritonal sıvı dikkatlice aspire edilir. Ardından, elde edilen hücreler kültürlenir ve açığa çıkan peritonal makrofajlar akış sitometrisi ile karakterize edilir. Son adım ise, bu makrofajların farklı toll benzeri reseptör veya TLR ligandları ile stimüle edilmesi ve örneklerden RNA izole edilmesidir.Nihayetinde, ilgilenilen genin ekspresyonunu ölçmek için kantitatif ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu kullanılır. Aşağıdaki prosedürün amacı, bira TIO glikol medyumu kullanarak peritoneal makrofajları izole etmektir. Bu medyum, peritona monosit migrasyonunu artıracak ve böylece makrofaj verimini yükseltecektir.İzole edilen makrofajlar, hedef genimiz olan hepsidinin moleküler düzenlemesini incelemek için farklı toll benzeri reseptör ligandları ile stimüle edilecektir. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı şekilde, 23 gauge iğnelerin takılı olduğu bir mililitrelik şırıngalar kullanarak %3,8'lik brewer's bio glyco eight ortamı hazırlayın. Her bir farenin peritonal boşluğuna bir mililitre %3,8'lik brewer's bio glycol eight ortamı enjekte edin ve üç gün bekleyin.Metin protokolünde açıklandığı üzere farelerin anestezi ve ötanazisinden sonra, her fare için yeni bir şırınga ve iğne kullanın; her farenin karnını %70 ethanol ile ıslatın. Makasla peritonun alt orta hattı boyunca lateral bir insizyon gerçekleştirin. Karın derisini geri çekmek ve şeffaf peritoneal deriyi açığa çıkarmak için pens kullanın.Ardından, 20 gauge iğnelerin takılı olduğu beş mililitrelik şırıngalarla her farenin peritonal boşluğuna beş mililitre soğuk ECCOs fosfat tamponlu salin enjekte edin. Peritonal boşluğa nazikçe masaj yapın ve ardından herhangi bir organı delmeden sıvıyı dikkatlice aspire edin. İğneyi çıkarın ve peritonal sıvıyı 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerine aktarın.Ardından, toplanan periton sıvısını soğutmalı bir santrifüjde 10 dakika boyunca 400 ×g veya 1500 RPM'de santrifüjleyin; hücreler prosedür boyunca soğuk tutulmalıdır. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini RPMI 1640 besiyerinde yeniden süspande edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve örnekleri mililitre başına 1 milyon hücre yoğunluğuna ayarlayın.Makrofaj zenginleştirmesini doğrulamak için izole edilen hücrelerin fenotipi akış sitometrisi ile karakterize edilmelidir. Fare başına 1 milyon hücre ve makrofajlar üzerinde doğrudan eksprese edilen bir yüzey antijeni olan F4/80'e karşı antikorlar kullanılır. İzolasyondan sonra, altılı kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 1 milyon hücre ekleyin.Kuyu plakası. Fare peritonal makrofajlarının kuyulara tutunması için 37 °C'de bir ila iki saat boyunca kültüre edin.Ardından hücrelere 900 µL serumsuz DMEM ekleyin. Metin protokolünde listelendiği şekilde, her bir toll benzeri reseptör veya TLR ligandı için 10x stok çözeltileri hazırlayın. Daha sonra her bir kuyucuğa 100 µL stok çözelti ekleyerek on kat seyreltilmiş bir kültür oluşturun.Hücreleri TLR ligandlarının varlığında 24 saat bekletin. RNA izolasyonunu gerçekleştirmek için öncelikle tüm besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri doğrudan altı kuyucuklu plaklarda lize edin. Her kuyucuğa bir mililitre triol reajenti ekleyerek ve hücre lizatını bir pipet yardımıyla birkaç kez çekip bırakarak işlemi tamamlayın.Ardından, nükleer protein komplekslerinin tamamen ayrışmasını sağlamak için homojenize edilmiş örnekleri oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından lizatı 1,5 mililitrelik RNA ve DNA korumalı mikro santrifüj tüplerine aktarın ve her bir mililitre triol reaktifi için 0,2 mililitre kloroform ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe etmeden önce 15 saniye boyunca elle kuvvetlice çalkalayın.Ardından, 4 °C'de 15 dakika boyunca 12,000 ×g'de santrifüj edin. Karışımın alt kısımda kırmızı fenol kloroform fazı, bir ara faz ve üst kısımda renksiz sulu faz şeklinde ayrıştığını gözlemleyin. RNA yalnızca sulu fazda kalır.Ara fazı bozmadan, üstteki sulu fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, 0,5 mililitre izopropil alkol ile karıştırarak RNA'yı çöktürün. 4 °C'de, 10 dakika boyunca 12.000 ×g'de santrifüjleyin.RNA, tüpün yan ve alt kısmında beyaz bir pelet oluşturarak çöker. Süpernatantı uzaklaştırın ve RNA peletini bir mililitre %75 etanol ile bir kez yıkayın. Örnekleri vorteksleyerek karıştırın ve ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca 7.500 ×g'de santrifüjleyin.Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra, RNA'yı 10 dakika boyunca kısaca havada kurutun. Ardından RNA'yı 100 µL RNA içermeyen suda çözün ve 55 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, miktarı belirlemek için bir spektrofotometre kullanarak RNA'yı kantifiye edin.Numuneleri RNA'sız su ile 100 kat seyreltin ve RNA konsantrasyonlarını eşitlemek için 260 nanometre dalga boyunda okuma yapın, ardından üretici talimatlarına göre cDNA sentezleyin. Birinci zincir cDNA sentez kiti için RT-PCR sistemi kullanın. Daha sonra, gen ifadesi düzeylerini iki housekeeping geni ile normalize ederek, gerçek zamanlı bir DNA tespit sisteminde real-time PCR ile mRNA seviyelerini ölçün.İzole edilen peritoneal makrofajlar, izole edilen makrofajların yüzdesini belirlemek ve bunları izolasyon işlemi sırasında elde edilen hücreler arasından ayırt etmek için akış sitometrisi ile karakterize edildi. F4/80 antijenini eksprese eden hücrelerin yüzdesinin tutarlı bir şekilde %95'in üzerinde olduğu bulundu. İzole edilen hücreler daha sonra çeşitli TLR ligandları ve mRNA ile muamele edildi. Hepsidin seviyeleri, toll benzeri reseptör 1 ve 2 ile toll benzeri reseptör 4 için RT-PCR ile ölçüldü.Bir folik reseptör altı ve iki ligand, ayna makrofajlarda hepcidin mRNA'sını stimüle edebilmiştir. Bu sonuçlar birlikte, ayna periton makrofajlarını başarıyla izole etmek ve gen ekspresyonunun moleküler düzenlemesini kesin bir şekilde araştırmak için bu protokolün kullanışlılığını kanıtlamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, ayna periton makrofajlarının nasıl izole edileceği, tanımlanacağı ve kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız.

isolation-murine-peritoneal-macrophages-to-carry-out-gene-expression

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Periton boşluğuna memelilerde doğuştan gelen bağışıklık yanıtları için çok önemli olan farklı bağışıklık hücre popülasyonlarının içerir. Verimli bir izolasyon yöntemi, bu hücrelerin biyokimyasal ve fonksiyonel analizler için gereklidir. Burada fare periton boşluğuna hücrelerin izolasyonu için kapsamlı bir yöntem sağlar.

Fare Periton Boşluk Hücreleri İzolasyon

Bu video, intravenöz immünoglobulin ve bakteriyel lipopolisakkarit kullanılarak bir farenin peritoneal makrofajlarının aktivasyonunu göstermektedir. Ko-stimülasyon, peritoneal makrofajları, immün düzenleyici aktiviteye sahip anti-inflamatuar makrofajlara aktive eder.

Bir Murin Modelindeki Antikorlara Yanıt Olarak Peritoneal Makrofajların İn Vivo Aktivasyonu

Bu videoda, floresan mikroskobu ile apoptotik fare timositlerinin peritoneal makrofaj aracılı efferositozunu analiz etmek için bir prosedür gösterilmektedir.

Apoptotik Timositlerin Peritoneal Makrofajlarla Efferositozunun Analizi

Bu protokolde, Amaxa Nucleofector 96 kuyulu Mekik Sistemini kullanarak murin makrofaj hücre hatlarını siRNA'larla verimli bir şekilde transfekte etmek, makrofajları lipopolisakkarit ile uyarmak ve inflamatuar sitokin üretimi üzerindeki etkileri izlemek için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Antikor bazlı ilaçlara inflamatuar hastalıkları tedavisinde devrim. Belirli hedefleri üzerinde doğrudan etkileri sahip olmanın yanı sıra, antikorlar makrofajlar anti-inflamatuar olmak için etkinleştirebilirsiniz. Bu protokolü nasıl anti-inflamatuar makrofaj açıklar harekete geçirmek-ebilmek var olmak istimal fare kemik iliği makrofajlar ve Periton makrofajlar kullanarak içinde vivo biçilen in vitro .

Fare kemik iliği ve Periton makrofaj harekete geçirmek antikor bazlı ilaçlara etkileri değerlendirilmesi

Burada, apoptotik tirositler ve periton makrofajlar hazırlamak ve effersitoz verimliliğini ve apoptotik tirositlerin özel inhibitörü-aracılı engellemesini analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol yapay boncuk ve bakteri dahil olmak üzere diğer parçacıklar hücre aracılı boşluk geniş bir uygulama vardır.

Makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel Analizi

Burada, bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan temassız parakrin sinyalçalışmasını kolaylaştırmak için geçirgen membran destekleri kullanan bir yöntem salıyoruz. Sistem makrofaj aktivasyonu sönümleme tümör salgılanan faktörlerin rolünü incelemek için münasip olduğunu.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Periton dokusunda yerleşik makrofajlarda gen fonksiyonunun araştırılması için in vivo, lentiviral vektörler kullanılarak adım adım bir protokol gösteriyoruz.

Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Öğrenin fare periton makrofaj izolasyonu ve Toll-benzeri reseptör uyarımı sonrası gen ifadesi analizi yöntemini. Bu protokol immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında güvenilir sonuçlar sağlar.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

Daha fazla video keşfet