Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

Bu prosedürün genel amacı, murn peritoneal makrofajları izole etmek ve toll benzeri reseptörlerin uyarılması üzerine gen ekspresyon analizi yapmaktır. Bu, ilk enjeksiyonla gerçekleştirilir. Peritona monosit göçünü artırmak ve dolayısıyla makrofaj verimini artırmak için farenin periton boşluğuna% 3.8'i brewer thi glyco ortamının yerleştirilmesi Üç gün sonra, fareyi ötenazi yapın ve hücreleri hasat etmek için periton boşluğuna soğuk ECCO'lar fosfat tampon salin enjekte edin.

Periton boşluğuna hafif bir masajın ardından, periton sıvısı dikkatlice aspire edilir. Daha sonra, elde edilen hücreler kültürlenir ve ortaya çıkan peritoneal makrofajlar akış sitometrisi ile karakterize edilir. Son adım, bu makrofajları farklı toll benzeri reseptör veya TLR ligandları ile uyarmak ve RNA'yı örneklerden izole etmektir.

Sonuç olarak, ilgilenilen genin ekspresyonunu ölçmek için kantitatif ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu kullanılır. Aşağıdaki prosedürün amacı, bira üreticisinin TIO glikol ortamını kullanarak periton mikrofajlarını yansıtarak izole etmektir. Bu besiyeri, peritona monosit göçünü artıracak ve dolayısıyla mikrofaj verimini artıracaktır.

İzole edildikten sonra, mikrofajlar, Pinterest genimiz olan hepsidinin moleküler regülasyonunu incelemek için farklı toll benzeri reseptör ligandları ile uyarılacaktır. Başlamak için, 23 gauge iğneye bağlı bir mililitrelik şırınga kullanarak metin protokolünde açıklandığı gibi% 3.8 brewer's bio glyco eight medium'u hazırlayın. Her farenin periton boşluğuna bir mililitre %3.8 brewer's bio glycol eight medium enjekte edin ve üç gün bekleyin.

Metin protokolünde açıklandığı gibi fare anestezisi ve ötenazi sonrasında her fare için yeni bir şırınga ve iğne kullanın, her farenin karnını% 70 etanol ile ıslatın. Peritonun alt orta hattı boyunca makasla yanal bir kesi yapın. Karın derisini geri çekmek ve şeffaf periton cildini ortaya çıkarmak için forseps kullanın.

Daha sonra, 20 gauge iğneye bağlı beş mililitrelik şırınga ile her farenin periton boşluğuna beş mililitre soğuk ECCO fosfat tamponlu salin enjekte edin. Periton boşluğuna hafif bir masaj yapın ve ardından herhangi bir organı delmeden sıvıyı dikkatlice aspire edin. İğneyi çıkarın ve periton sıvısını 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerine dağıtın.

Daha sonra, toplanan periton sıvısını soğutmalı bir santrifüjde 400 kez G veya 1500 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin, hücreler işlem boyunca soğuk tutulmalıdır. Süpernatanı atın ve hücre peletini RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın ve örnekleri mililitrede 1 milyon hücre hücre yoğunluğuna ayarlayın.

Makrofaj zenginleştirmesini doğrulamak için izole edilmiş hücrelerin fenotipini akış sitometrisi ile karakterize edin. Fare başına 1 milyon hücre ve doğrudan makrofajlar üzerinde eksprese edilen bir yüzey antijeni olan F four 80'e karşı antikorlar kullanmak. İzolasyondan sonra, altılı her bir oyuğa 1 milyon hücre ekleyin.

Kuyu plakası. Murin peritoneal makrofajlarını 37 santigrat derecede bir ila iki saat kültürleyerek kuyucuklara yapışmaya bırakın. İnkübasyondan sonra, ılık fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez nazikçe izleyerek yapışmayan hücreleri çıkarın.

Daha sonra hücrelere 900 mikrolitre serumsuz DMEM ekleyin. Metin protokolünde listelendiği gibi her bir toll benzeri reseptör veya TLR ligandı için 10 x stok çözeltisi hazırlayın. Daha sonra her bir oyuğa 100 mikrolitre stok çözeltisi ekleyin, böylece on kat seyreltme kültürü gerçekleştirin.

TLR ligandlarının varlığında 24 saat boyunca hücreler. Önce RNA izolasyonunu gerçekleştirmek için, tüm ortamı çıkarın ve hücreleri doğrudan altı kuyucuklu plakada şekillendirin. Her oyuğa bir mililitre triol reaktifi ekleyerek ve hücre lizatını bir pipetten birkaç kez geçirerek.

Daha sonra homojenize edilmiş numuneleri, nükleer protein komplekslerinin tamamen ayrışmasına izin vermek için oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, lizatı 1.5 mililitre RNA'lara ve DNA çılgınlığı mikro santrifüj tüplerine aktarın ve bir mililitre triol reaktifi başına 0.2 mililitre kloroform ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe etmeden önce 15 saniye boyunca elinizle kuvvetlice çalkalayın.

Daha sonra dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin. Karışımın bir alt kırmızı fenol kloroform fazına, bir ara faza ve renksiz bir üst sulu faza ayrıldığını gözlemleyin. RNA sadece sulu fazda kalır.

İnterfaz fazını bozmadan üst sulu fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra 0,5 mililitre izopropil alkol ile karıştırarak RNA'yı çökeltin. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin.

RNA çökelerek tüpün yanında ve altında beyaz bir pelet oluşturur. Süpernatanı çıkarın ve RNA peletini bir mililitre %75 etanol ile bir kez yıkayın. Numuneleri girdaplama ile karıştırın ve daha sonra dört santigrat derecede beş dakika boyunca 7.500 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, RNA'yı 10 dakika boyunca kısa bir süre havayla kurutun. Daha sonra RNA'yı 100 mikrolitre RNA içermeyen suda çözün ve 55 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından, bunu yapmak için bir spektrofotometre kullanarak RNA'yı ölçün.

Numuneleri RNA içermeyen suda 100 kez seyreltin ve 260 nanometre dalga boylarında okuyun, RNA konsantrasyonlarını eşitleyin ve üreticinin talimatlarına göre CD NA'yı sentezleyin. İlk iplikçik CD NA sentez kiti için R-T-P-C-R sistemini kullanma. Ardından, gerçek zamanlı bir DNA tespit sisteminde gerçek zamanlı PCR ile gen Mr.NA seviyelerini ölçün ve iki temizlik geni ile gen ekspresyon seviyelerini normalleştirin.

İzole edilen aynalayıcı peritoneal makrofajlar, izole makrofaj yüzdesini belirlemek ve bunları izolasyon işlemi sırasında elde edilen hücreler arasında ayırt etmek için akış sitometrisi ile karakterize edildi. Antijen F four 80'i eksprese eden hücrelerin yüzdesinin sürekli olarak %95'in üzerinde olduğu bulundu İzole edilen hücreler daha sonra birkaç TLR ligandı ve mRNA ile muamele edildi. Hepsidin düzeyleri R-T-P-C-R tolike reseptör bir ve iki, tolike reseptör dört ile ölçüldü.

Bir olik reseptör altı ve iki ligand, makrofajları yansıtmada hepsidin mRNA'sını uyarma yeteneğine sahipti. Birlikte bu sonuçlar, peritoneal makrofajları başarılı bir şekilde izole etmek, yansıtmak ve gen ekspresyonunun moleküler regülasyonunu hassas bir şekilde araştırmak için bu protokolün kullanışlılığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, peritoneal makrofajları nasıl izole edeceğinizi, tanımlayacağınızı ve kültürleyeceğinizi iyi anlayacaksınız.