Name: MastCell Knock-inFareleri Kullanarak Mast Hücrelerinin İşlevlerini Analiz Etme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Öğrenin, mast hücrelerinin işlevlerini in vivo analiz etmek için kemik iliği kaynaklı kültüre mast hücrelerinin mast hücre eksik farelere aktarım yöntemini. Akış sitometrisi ve immünohistokimya ile değerlendirme yapılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

N.G., Fransız "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" ve Philipp Vakfı'ndan burs alan; R.S., Lucile Packard Çocuk Sağlığı Vakfı ve Stanford NIH/NCRR CTSA ödül numarası UL1 RR025744 tarafından desteklenmektedir; Not: Max Kade Vakfı ve Avusturya Bilimler Akademisi'nden Max Kade Bursu ve Avusturya Bilim Fonu'nun (FWF) Schröder Bursu tarafından desteklenmektedir: J3399-B21; S.J.G., Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin U19 AI104209, NS 080062 ve Kaliforniya Üniversitesi Tütünle İlgili Hastalık Araştırma Programı'ndan destek verdiğini kabul eder; L.L.R., Artrit Ulusal Araştırma Vakfı (ANRF) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi K99AI110645'in desteğini kabul ediyor.

Tüm hayvan bakımı ve deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin yönergelerine uygun olarak ve Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin özel onayıyla gerçekleştirildi.
1. Kemik İliği Türevi Kültürlü Mast Hücrelerinin (BMCMC) Üretimi ve Karakterizasyonu.
Not: Donör BMCMC'ler, alıcı MC eksikliği olan farelerle aynı genetik arka plandaki kemik iliği hücrelerinden üretilmelidir. Erkek kökenli donör BMCMC'ler dişi farelerin engraftmenti için uygun değildir. Kadın kökenli donör BMCMC'ler hem erkek hem de kadın alıcılara başarıyla kazınacaktır.
<ol><li>Kemik İliği Çıkarma.<ol>
<li>Steril fosfat tamponlu salin (PBS) 6 kuyu kültür plakasına (fare başına 1 kuyu) dökün ve buza yerleştirin.</li>
		<li>Diseksiyon aletlerini sterilizasyon için% 70 etanolde ıslatın.</li>
		<li>Donör fareleri karbondioksit (CO2)soluma ve ardından servikal çıkık ile ötenazi edin, ardından farelere manipülasyon yerlerinde% 70 etanol püskürtün.</li>
		<li>Herhangi bir kemik epifizini kesmeden uyluk kemiği, kaval kemiği ve fibula kemiklerini çıkarmak için steril diseksiyon aletleri kullanın.</li>
		<li>Kemikleri bir kümesle sabitlerken, steril makas (veya neşter bıçakları) kullanarak tüm dokuyu kemiklerden kazıyın (ve fibulayı atın). Tüm kemikler toplanana kadar kemikleri PBS'ye buz üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Steril doku kültürü davlumbazında kalan tüm adımları uygulayın. Steril aletler kullanarak, kemikleri epulps ile sabitleyin ve medüller boşluğu ortaya çıkarmak için her iki epifizi de kesin.</li>
		<li>3 ml şırınga ve 30 G iğne ve soğuk yıkama ortamı (Dulbecco Modifiye Kartal Ortası [DMEM] ile desteklenmiş %10 fetal baldır serumu [FCS, ısı inaktive], 2 mM L-glutamin, %1 antibiyotik-antimycotic çözeltisi, 50 μM Β-mercaptoethanol), kırmızı kemik iliğini Petri kabına yıkayın.</li>
		<li>Tekrarlanan nazik aspirasyon ve fırlatma ile yıkanmış kemik iliği hücre kümelerini ayrıştırmak için aynı şırındıcı kullanın.</li>
		<li>Her fareden bir 15 ml santrifüj tüpüne havuz femoral ve tibial kemik iliği. Kemik iliği hücrelerini ve santrifüjleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da yıkamak için tüpü soğuk yıkama ortamıyla doldurun.</li>
	</ol></li>
	<li>BMCMC'ler Kültür.<ol>
<li>Süpernatantı çıkarın ve 10 ml kültür ortamında peletlenmiş kemik iliği hücrelerini kurtarın (DMEM% 10 fetal baldır serumu ile desteklenir [FCS, ısı inaktive], 2 mM L-glutamin, %1 antibiyotik-antimycotic çözelti, 50 μM Β-mercaptoethanol ve %20 WEHI-3 hücre şartlandırılmış ortam [IL-3 kaynağı olarak; alternatif olarak 10 ng/ml'de rekombinant fare IL-3 kullanın]).</li>
		<li>Hücreleri uygun boyutta doku kültürü şişesine yerleştirin(örneğin,1 fare için T25, 2 fare için T75, vb.).</li>
		<li>Hücreleri kapladıktan 1-2 gün sonra, orta ve süspansiyon hücrelerini (döküntü ve yapışkan hücreleri şişenin dibine yapışarak bırakarak) yeni bir şişeye aktarın ve taze kültür ortamı (10 ml / fare) ekleyin.</li>
		<li>Sonraki haftalarda, hücreleri her 3-4 günde bir besleyin (fare başına 10 ml kültür ortamı ekleyin). 2,5 x 105 -1x 106 hücre/ml arasında hücre yoğunluğunu koruyun. Yapışmayan hücreleri, kültür şişesinde yapışan hücre bulunmayana kadar haftada bir kez yeni bir şişeye aktarın. MC eksikliği olan farelere in vitro tahliller veya gravür için kullanmadan önce hücrelerin olgunluğunu test edin (aşağıya bakın). NOT: BMCMC'lerin tamamen farklılaşması 4-6 hafta sürecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>BMCMC olgunluğunun değerlendirilmesi.<ol>
<li>
Akış sitometrisi kullanarak.
		<ol>
<li>Hücreleri (5 x 104-5 x10 5 hücre/durum) buz gibi FACS tamponu (PBS, %0,5 FCS) ile 5 ml polistiren yuvarlak alt tüpte yıkayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj. Aspirate süpernatant.</li>
			<li>Fare önleyici CD16/32 (klon 93 veya 2.4G2) monoklonal antikorları FACS tamponunda 1:200 (2.5 μg/ml) seyreltin. Her pelede 10 μl ekleyin ve kısa bir girdapla yeniden depolanın. Fc bağlamasını engellemek için buzda 5 dakika kuluçkaya yaslanın. NOT: Kalan tüm adımlar için numuneleri doğrudan ışıktan koruyun.</li>
			<li>Seyreltik fitoerythrin (PE) konjuge anti-fare Fc φRI α (klon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) ve floresan izotiyosiyanat (FITC) konjuge anti-fare KIT (CD117; klon 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("boyama çözeltisi") veya FACS tamponunda ilgili etiketli izotip kontrol antikorları ("izotip kontrol çözümü").</li>
			<li>Engellenen hücrelerin yarısını adım 1.3.1.2)'den ek bir polistiren yuvarlak alt tüpe bölün ve bir tüpe 20 μl "boyama çözeltisi", diğer tüpe 20 μl "izotip kontrol çözeltisi" ekleyin. Buzda 30 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
			<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da 3 ml buz gibi FACS tamponu ve santrifüj ekleyin. Süpernatant atın ve peleti 1 μg/ml propidium iyodür (PI, ölü hücrelerin tanımlanması için) içeren 300 μl FACS tamponunda yeniden biriktirin. Akış sitometrisi analizine geçin (bkz. Şekil 2A).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Toluidin mavisi lekeleme kullanarak.<ol>
<li>1 x 105 hücreyi PBS ile bir kez oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleme ile yıkayın, ardından 200 μl PBS'de hücreleri aspire edin ve yeniden depolayın.</li>
			<li>Hücre süspansiyonunu mikroskop slaydına bağlı hazırlanmış bir sitokunnale aktarın ve bir sitosantrifüj kullanarak sito-santrifüjleme ile devam edin (5 dakika boyunca 40 x g).</li>
			<li>10 dakika boyunca hava kuru kaydıraklar ve pap kalem kullanarak hücrelerin etrafına balmumu daire çizin. Hücreleri kapsayacak şekilde% 0.1 Toluidin mavisi çözelti ekleyin. 1 dakika kuluçkaya yaslanın. Akan musluk suyundaki slaytları 1 dakika yıkayın, ardından 10 dakika boyunca hava kurusu slaytları yıkayın.</li>
			<li>Montaj ortamını kullanarak kapak hücreleri. Işık mikroskobu analizine geçin (bkz. Şekil 2B)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Mast Hücre eksikliği olan Farelerin BMCMC'lerle engraftment.
<ol><li>intradermal (i.d.) enjeksiyonu ile kulak gravür. NOT: BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelerin kulak pinnasına benimsenen transferi için, kulak pinna başına her biri 1 x 106 hücreden (toplam 2 x 106 hücre için) iki enjeksiyon yapmanızı öneririz. BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelerin kulak pinnaesine intradermal engraftasyonu, pasif kesesel anafilaksi (PCA)24,27modelleri, zehirlere karşı konak savunma 28 ve kronik aşırı duyarlılık (CHS) reaksiyonları29,30dahil olmak üzere birçok modelde birçok araştırmacı tarafından kullanılmıştır.<ol>
<li>Soğuk DMEM'de 4 x 107 BMCMC/ml'de (1 x 106 BMCMC/ 25 μl) hücreleri sayın ve yeniden depolayın. BMCMC çözeltisini 30 G iğne ile donatılmış 1 ml şırıngaya aktarın. Enjeksiyona kadar buzda tutun.</li>
		<li>İzofluran kullanarak 4-6 haftalık MC eksikliği olan fareleri uyuşturmak (%2,5 v/v). Anestezinin derinliğini ayak parmağıyla kıstırın, belirtilmişse izofluranları ayarlayın ve işlem boyunca solunum ve ayak parmağı sıkışma tepkisini izlemeye devam edin. Göz kuruluğu önlemek için bir Q ucu ile oftalmik merhem uygulayın.</li>
		<li>İşaret parmağı ile ventral yüzü ortaya çıkarmak ve germek için kulak pinnasının dorsal yüzünde dikey basınç oluşturun.</li>
		<li>Kulak pinnasının ventral yüzünün iki farklı bölgesine iki adet 25 μl id. bmcmc çözelti enjeksiyonu, kulağın ortasına ilk enjeksiyon ve ikinci enjeksiyonu kulak pinna ucuna doğru gerçekleştirin. In vivo deneyler yapmadan önce i.d. gravürden sonra 4-6 hafta bekleyin. Not: Deneyimlerimize göre, o zamana kadar kulak pinnasının orta kısmındaki MCs / mm2 dermis sayısı genellikle vahşi tip farelerde ilgili konumdakine benzerken, kulak pinnaesinin çevresindeki MCS / mm2 sayıları genellikle ilgili vahşi tip farelerdekilerden önemli ölçüde daha düşüktür27,28. Bu tür MC ile kaplanmış farelerle deneyler tasarlarken bu akılda tutulmalıdır(örneğin,MC işlevi üzerinde olası etkileri olan ajanlar kulak pinnaesinin orta kısmına enjekte edilmeli ve bu tür tedavilerin etkilerinin analizi de o alana odaklanmalıdır).</li>
	</ol></li>
	<li>İntraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile periton kavitesi gravür. NOT: BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelerin periton boşluğuna benimsenen transferi, fare başına 2 x 106 hücreden oluşan bir enjeksiyon gerektirecektir. MC eksikliği olan farelere BMCMC enjeksiyonları, zehirlere karşı konak savunma modelleri 31 veya bakteriyel sepsis32,33 de dahil olmak üzere çeşitli modellerde periton MC'lerin rollerini incelemek için birçok grup tarafından kullanılmıştır.<ol>
<li>Soğuk DMEM'de uygun sayıda hücre sayın ve 1 x 107 BMCMC/ml'de (2 x10 6 BMCMC/ 200 μl) yeniden depolayın. BMCMC çözeltisini 25 G iğne ile donatılmış 1 ml şırıngaya aktarın. Enjeksiyona kadar buzda tutun.</li>
		<li>4-6 haftalık MC eksikliği olan farelerin periton boşluğuna 200 μl BMCMC çözeltisinin 1 enjeksiyonunu gerçekleştirin. In vivo deneyler yapmadan önce i.p. gravürden sonra 4-6 hafta bekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>İntravenöz (yani) enjeksiyon ile gravür. NOT: BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelere enjeksiyon yoluyla benimsenen transferi, fare başına 5 x 106 hücrelik bir enjeksiyon gerektirecektir. MC eksikliği olan farelere BMCMC'lerin intravenöz (i.v.) enjeksiyonları, mesane enfeksiyonu34,astım35,akciğer fibrozis36ve antikor aracılı artrit37modelleri de dahil olmak üzere çeşitli hastalık modellerinde MCC'lerin rollerini incelemek için birçok grup tarafından kullanılmıştır.<ol>
<li>Soğuk DMEM'de uygun sayıda hücre sayın ve 2,5 x10 7 BMCMC/ml'de (5 x10 6 BMCMC/200 μl) yeniden depolayın. BMCMC çözeltisini 30 G iğne ile donatılmış 1 ml şırıngaya aktarın. Enjeksiyona kadar buzda tutun.</li>
		<li>İzofluran kullanarak 4-6 haftalık MC eksikliği olan fareleri uyuşturmak (%2,5 v/v). Anestezinin derinliğini ayak parmağıyla kıstırın, belirtilmişse izofluranları ayarlayın ve işlem boyunca solunum ve ayak parmağı sıkışma tepkisini izlemeye devam edin. Göz kuruluğu önlemek için bir Q ucu ile oftalmik merhem uygulayın.</li>
		<li>MC eksikliği olan bir farenin kuyruk damarına (veya alternatif olarak retro-orbital damara) 200 μl BMCMC çözeltisinin bir enjeksiyonunu gerçekleştirin. In vivo deneyler yapmadan önce i.v. gravürden sonra 12 hafta bekleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Engrafted Mast Hücre eksikliği Olan Farelerin Analizi.
<ol><li>Kulak engraftment analizi.<ol>
<li>Deneyin sonunda, fareleri CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık.</li>
		<li>Kulak pinnae izole ve 4 °C gece boyunca% 10 (vol/vol) tamponlanmış formalin sabitlemek. Sabit kulak pinnae'yi parafin içine gömün, 4 μm kulak pinnae bölümlerini kesin ve cam slaytlara monte edin.</li>
		<li>Slaytları oda sıcaklığında 1 dakika boyunca% 0.1 Toluidine mavi çözeltisi ile lekeleyin. Slaytları musluk suyunda 1 dakika yıkayın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava kurusu slaytları yıkayın.</li>
		<li>Montaj ortamını kullanarak kapak kaydırağında, ardından hafif bir mikroskop kullanarak pinnae bölümleri başına engrafted MC sayısını sayın. Engrafted farelerin kulak derisindeki MCS'lerin yüzdesini ve dağılımını vahşi tip farelerle karşılaştırarak engraftment verimliliğini değerlendirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Periton kavitesi gravür analizi.<ol>
<li>Periton boşluğundaki mast hücreleri sayısının değerlendirilmesi.<ol>
<li>Deneyin sonunda, fareleri CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık. Periton boşluğunu kırmadan farelerin ventral derisini dikkatlice çıkarın.</li>
			<li>25 G iğne ile donatılmış 5 ml şırınga kullanarak periton boşluğuna 5 ml soğuk veya oda sıcaklığıNDA PBS enjekte edin. Periton hücrelerinin aktive olma riskini azaltmak için soğuk PBS kullanın (peritoneal MC degranülasyonunu veya periton lavaj sıvısındaki bazı MC türevli ürünlerin seviyelerini değerlendirirken bu çok önemlidir). Periton hücrelerini toplamak için 20 saniye boyunca karın masajı yapın.</li>
			<li>Periton lavajını 22 G iğne ile donatılmış 5 ml'lik bir şırınga kullanarak yavaşça emiş yapın. Emişli lavaj hacmini kaydedin (enjekte edilen hacmin% 80'ine kadar iyileşmeyi bekleyin).</li>
			<li>Periton lavaj sıvılarını 5 ml polistiren yuvarlak alt tüpe ve santrifüjü 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da aktarın. Aspirate süpernatant. Peleti 400 μl soğuk PBS'de geri kazan.</li>
			<li>Hemositometre odası kullanarak periton hücrelerinin toplam sayısını sayın. Periton boşluğundaki engrafted MC'lerin yüzdesini ve işaretleyici ifadesini değerlendirmek için hücre süspansiyonunun yarısını akış sitometri analizi için kullanın (adım 1.3.1'de açıklandığı gibi). Mutlak peritonEal GC sayısı elde etmek için toplam periton hücresi sayısını VC'lerin yüzdesiyle çarpın.</li>
			<li>1.3.2.2 adımında açıklandığı gibi kalan hücrelerle bir sitosantrifüjasyon gerçekleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava kuru kaydıraklar ve pap kalem kullanarak hücrelerin etrafına balmumu dairesi çizin.</li>
			<li>Filtrelenmemiş May-Grünwald Boyama solüsyonu ile hücreleri 5 dakika örtün, ardından PBS'de her ikisi de oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın. Giemsa lekeli hücreleri deiyonize su ile 1:20 seyreltin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırnın. Slaytları musluk suyunda 2 kez 1 dakika yıkayın, ardından havayla kuru slaytlar.</li>
			<li>Montaj ortamını kullanarak hücreleri kapsar ve ışık mikroskobu kullanarak (en az 400 toplam hücre sayarak) engrafted MCS'lerin yüzdesini hesaplar. Engrafted farelerin periton lavajındaki MCS'lerin yüzdesini vahşi tip farelerle karşılaştırarak engraftment verimliliğini değerlendirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mezenterik pencerelerdeki mast hücrelerinin değerlendirilmesi.<ol>
<li>3.2.1 adımında açıklanan periton lavajını takiben, farelerin bağırsak sistemini açığa çıkarmak için periton zarını kesin. Fare başına 4 ila 5 mezenterik pencereyi bir slayda yerleştirin.</li>
			<li>Oda sıcaklığında Karnoy çözeltisinde (3:2:1 vol/vol/vol etanol, kloroform ve buzul asetik asit) slaytları 1 saat sabitleyin. Havayla kuru kayar ve bağırsağı çıkarın (sabit mezenterik pencereler slaytlara bağlı kalacaktır).</li>
			<li>Oda sıcaklığında 20 dk'ya kadar olan preparatları Csaba (Alcian blue/Safranin O) boyama solüsyonu ile lekelenin.<ol>
<li>500 ml Csaba lekesi yapmak için, 100 ml 1 M sodyum asetat çözeltisini 120 ml 1 M HCl ile karıştırarak 500 ml asetat tamponu hazırlayın. Daha sonra, 90 mg Safranin [kırmızı 'olgun MC'leri tanımlar], 1,8 g Alcian mavisi [mavi 'olgunlaşmamış MC'leri tanımlar] ve 2,4 g ferrik amonyum sülfatNH 4Fe(SO4)2'yi 500 ml asetat tamponuna çözün.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Montaj ortamını kullanarak kapak kaydırağında, ardından hafif bir mikroskop kullanarak mezenterik pencere başına engrafted MCS sayısını sayın. Engrafted farelerin mezenterik pencerelerindeki MCS'lerin yüzdesini ve dağılımını vahşi tip farelere karşı karşılaştırarak engraftment verimliliğini değerlendirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>I.V. gravür analizi.<ol>
<li>Deneyin sonunda, fareleri CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık ve ilgili doku(örneğin akciğer, cilt veya dalak) hasat edin ve 4 °C'de% 10 (vol/ vol) tamponlu formalin'de bir gecede sabitlenin.</li>
		<li>Sabit dokuları parafin içine gömün, 4 μm bölüm kesin ve cam slaytlara monte edin. Slaytları oda sıcaklığında 1 dakika boyunca% 0.1 Toluidine mavi çözeltisi ile lekeleyin. Slaytları musluk suyunda 1 dakika yıkayın, ardından 10 dakika boyunca hava kurusu slaytları yıkayın.</li>
		<li>Montaj ortamını kullanarak kapak kaydırağında bulunur ve ışık mikroskobu kullanarak doku bölümleri başına engrafted MCS sayısını ve dağılımını değerlendirir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

İlk açıklamasından neredeyse30yıl sonra 38 , 'mast cell knock-in' yaklaşımı, MCS'lerin vivo olarak neler yapabileceği veya yapamayacağı hakkında değerli bilgiler sağlamaya devam ediyor. MCS'lerin işlevlerinin uzun zamandır alerjideki rolleriyle sınırlı olduğu düşünülüyordu. ' Mast cellknock-in' yaklaşımı kullanılarak oluşturulan veriler, MCS'lerin diğer işlevlerin yanı sıra, belirli patojenlere karşı konak savunmasında kritik roller oynayabileceğine ve28,31 zehirlerine vey...

Mast hücreleri (MCS) pluripotent kemik iliği progenitörlerinden kaynaklanan hematopoetik hücrelerdir1-3. Kemik iliği çıkışı sonrasında, MCS progenitörleri, lokal büyüme faktörlerinin etkisi altında olgun MC'lere dönüştükleri çeşitli dokulara göç ederler1-3. Doku bazlı MC'ler, dış hakaretlere karşı ilk savunma hattı olarak davrandıkları cilt, hava yolları ve gastrointestinal sistem gibi konak-çevre arayüzlerinde stratejik olarak bulunur3-6. MC'ler genellikle "temel" fenotipik özelliklerine ve anatomik konumlarına göre alt sınıflandırılır. Farelerde iki tür MC tanımlanmıştır: "bağ dokusu tipi" MCC'ler (CTMC'ler) ve mukozal MC'ler (MBC'ler)1-3,7,8. CTMC'ler genellikle venüles çevresinde ve sinir liflerinin yakınında bulunur ve serosal boşluklarda bulunurken, MPC'ler bağırsak ve solunum mukozasında intraepithelial konumları işgaleder 1-3.
MCs9-13'ünbiyolojik fonksiyonlarını incelemek için çok sayıda metodoloji uygulanmıştır. Birçok grup, hücre hatları (HMC1 14 veya LAD215,16 insan MC hatları gibi), in vitro türevliMC'ler(insan periferik kan türevliMC'ler 17veya fare kemik iliği gibi) kullanarak in vitro yaklaşımlara odaklanmıştır. türetilmiş kültürlü MCS [BMCMC'ler]18, fetal deri türevli kültürlü MC'ler [FSCMC'ler]19 ve periton hücre türevi MC'ler [PCMCs]20) veya farklı anatomik bölgelerden ex vivo izole PCC'ler. Tüm bu modeller, MC aktivasyonunda yer alan sinyal yolları gibi MC biyolojisinin moleküler ayrıntılarını incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, MCS biyolojisinin önemli bir yönü, fenotipik ve fonksiyonel özelliklerinin(örneğin,sitoplazmik granül proteaz içeriği veya farklı uyaranlara yanıt) anatomik konum ve mikroçevrim2,7ile modüle edilebilmesidir. Vivo ile karşılaşılan bu faktörlerin tam karışımı in vitro, VC işlevleri hakkında fikir edinmek için in vivo yaklaşımları kullanmayı tercih ediyoruz9.
Yaygın olarak kullanılan WBB6F1- Kit W/W-v veya C57BL/6-Kit W-sh/W-sh fareler gibi genetik MC eksikliği olan çeşitli fare suşları vardır. Bu fareler, ana MC büyüme faktörü kök hücre faktörü (SCF)21,22için reseptör olan KIT'in (CD117) ekspresyon ve /veya aktivitesinden yoksundur. Sonuç olarak, bu fareler derin bir MC eksikliğine sahiptir, aynı zamanda c-kit mutasyonları (WBB6F1-Kit W / W-v farelerde) veya azaltılmış c-kit ekspresyasyonu ile sonuçlanan büyük kromozomal inversiyonun etkileri ile ilgili ek fenotipik anormalliklere sahiptir (C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh farelerinde)9,10,12,23. Daha yakın zamanda, c-kit-bağımsız constitutive MC eksikliği olan birkaç fare türübildirilmiştir 24-26. Tüm bu fareler ve bazı yeni indüklenen MC eksikliği olan fare türleri son zamanlarda ayrıntılı olarak gözden geçirildi9,10,13.
Burada, fare kemiği iliği türevi kültürlü MC'lerin (BMCMC' ler) üretimi, MC eksikliği olan farelere benimsenen transferleri ve farklı anatomik bölgelerde benimsenen aktarılan MC'lerin sayılarının ve dağılımının analizi için yöntemleri açıklıyoruz. Bu sözde 'mast hücre vurma' yöntemi, MC'lerin ve MC türevi ürünlerin işlevlerini değerlendirmekiçin kullanılabilir. Son yıllarda geliştirilen alternatif yaklaşımlar ışığında bu yöntemin avantajlarını ve sınırlamalarını tartışıyoruz.

<table><tbody><tr><td>% 1 Antibiyotik-Antimikotik Çözelti</td><td>Corning cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Şırınga</td><td>Şahin</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Çanak</td><td>Corning cellgro</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polistiren Yuvarlak Alt Tüp</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Buzul Fisher Scientific</td><td>A35-500</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Mavisi 8GX</td><td>Rowley Biyokimyasal Danver</td><td>33864-99-2</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6R Santrifüj</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD16/32 (klon 93) Saflaştırılmış</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml TB Şırınga BD Şırınga</td><td></td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD 22 G x 1 (0,7 mm x 25 mm) İğneler</td><td>BD Hassas Kayar İğne</td><td>205155</td><td></td></tr><tr><td>BD 25 G 5/8 İğneler</td><td>BD Şırınga</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BD 30 G x 1/2 İğneler</td><td>BD Hassas Kayma</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Blue MAX Jr, 15 ml Polipropilen Konik Tüp</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 Montaj Ortamı</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin3</td><td>Shandon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation kalemi</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>15-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E 7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu Isı ile İnaktive</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135-500ml</td><td></td></tr><tr><td>FITC Konjuge IgG2b K Sıçan İzotip Kontrolü</td><td>eBioscience</td><td>14-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>Floresein İzotiyosiyanat (FITC) Konjuge Anti-fare KİTİ (CD117; klon 2B8)</td><td>eBioscience</td><td>11-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Leke Modifiye</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GS-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald Leke</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MG-1L</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 kuyulu plakalar</td><td>Falcon</td><td>35 3046</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus Doku Gömme Orta Fisher</td><td>Marka</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>PE Konjuge IgG Ermeni Hamster İzotip Kontrolü</td><td>eBioscience</td><td>12-4888-81</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fikoeritrin (PE) Konjuge Anti-fare FceRIa (klon MAR-1)</td><td>eBioscience</td><td>12-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>Propidium İyodür Boyama Çözeltisi</td><td>eBioscience</td><td>00-6990-50</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Safranin-o Sertifikalı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü şişeleri T25 25 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü şişeleri T75 75 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Toluidin Mavisi %1 Sulu</td><td>LabChem-Inc</td><td>LC26165-2</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr></tbody></table>

' mastcell knock-in'fareleri kullanarak mast hücrelerinin İşlevlerini analiz etme

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast hücreleri (MCS) çeşitli dokularda bulunan hematopoetik hücrelerdir ve özellikle cilt, hava yolları ve gastrointestinal sistem gibi dış ortama maruz kalan bölgelerde bol miktarda bulunur. IgE'ye bağımlı alerjik reaksiyonlardaki zararlı rolleriyle bilinen MCS'ler, zehir ve istilacı bakteri ve parazitlere karşı konak savunmasında da önemli oyuncular olarak ortaya çıkmıştır. MC fenotip ve fonksiyonu anatomik konuma göre ve/veya immün yanıtların gelişim türüne veya evresine göre farklılık gösterebilecek mikroçevroronmental faktörlerden etkilenebilir. Bu nedenle, biz ve diğerleri MC işlevleri hakkında fikir edinmek için in vitro yöntemlere göre in vivo yaklaşımları tercih ettik. Burada, fare kemiğinden türetilmiş kültürlü MCC'lerin (BMCMC' ler) üretimi, genetik olarak MC eksikliği olan farelere benimsenen transferleri ve farklı anatomik bölgelerde benimsenen aktarılan MC'lerin sayılarının ve dağılımının analizi için yöntemleri açıklıyoruz. 'Mastcell knock-in' yaklaşımı olarak adlandırılan bu yöntem, son 30 yılda MCS ve MC türevi ürünlerin işlevlerini değerlendirmek için yoğun olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda geliştirilen alternatif yaklaşımlar ışığında bu yöntemin avantajlarını ve sınırlamalarını tartışıyoruz.

'Mast cell knock-in' yaklaşımına genel bir bakış Şekil 1'degösterilmiştir ve BMCMC'lerin neslini, MC eksikliği olan farelere (deneysel tasarıma göre belirtilirse sayı değişebilir) ve enjeksiyon bölgesine bağlı olarak engraftasyon ve deney arasındaki aralığı içerir (bu aralık belirtilirse değişebilir; örneğin,MC sitoplazmik granüllerde depolanan mediatörlerin içeriği zamanla sürekli artar38). Şekil 2'de IL-3 kaynağı olarak %20 WEHI-3 hücre şartlandırılmış orta...

İn vitro türevli mast hücrelerinin üretimi, mast hücresi eksikliği olan farelere işlenmeleri ve farklı anatomik bölgelerde fenotip, sayılar ve engrafted mast hücrelerinin dağılımının analizi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, masthücrelerinin işlevlerini değerlendirmek için kullanılabilir vivo .

' MastCell Knock-in'Fareleri Kullanarak Mast Hücrelerinin İşlevlerini Analiz Etme

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Aşağıdaki yöntemin genel amacı, mast hücre knockin fareleri kullanarak mast hücrelerinin in vivo fonksiyonlarını analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle kemik iliği kaynaklı kültürlenmiş mast hücrelerinin (BMC MC'ler) üretilmesi veya mast hücre eksikliği olan farelere nakledilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, BMC MC'ler mast hücre knockin fareleri oluşturmak için mast hücre eksikliği olan farelerin çeşitli anatomik bölgelerine adaptif olarak aktarılır.Nihayetinde, nakledilen mast hücrelerinin sayıları ve anatomik dağılımları, nakledilen popülasyonların yabanıl tip farelerde bulunanlara ne ölçüde benzediğini değerlendirmek amacıyla akış sitometrisi ve immünohistokimyasal analiz ile belirlenir. Bu tekniğin temel avantajı, nakledilen yabanıl tip veya genetiği değiştirilmiş mast hücresi popülasyonlarının fonksiyonlarının in vivo olarak doğrudan değerlendirilmesine olanak tanımasıdır. Bu nedenle bu yöntem; mast hücrelerinin veya ürünlerinin, insan hastalık modelleri de dahil olmak üzere fizyolojik, immünolojik veya patolojik süreçlerin fare modellerinin özelliklerine ne ölçüde katkıda bulunabileceği gibi, mast hücresi biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı ola

analyzing-functions-mast-cells-vivo-using-mast-cell-knock

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada açıklanan lipopolisakkarid meme iltihabı simüle etmek için meme, genellikle bakteriyel enfeksiyon tarafından neden olduğu bir durum ile laktasyondaki fare meme bezi içine enjekte edildiği bir tekniktir. Artan nükleer faktör kappa B (NF-kB) sinyalizasyon, içinde lipopolisakkarit enjeksiyonu sonuçlarını bir NF-KB lusiferaz muhabiri fare bioluminescent görüntüleme yoluyla görüntülendi.

Mastitis Fare Model olarak LPS Intradüktal Enjeksiyon: Sinyal bir NF-KB Reporter Transgenik aracılığı ile görsel

Bu video, mast hücrelerinin degranülasyon aktivitesini belirlemek için bir kolorimetrik testi göstermektedir. Mast hücreleri tarafından salınan enzim, substratı hidrolize eder ve renkli bir ürün üretir. Mast hücrelerinin degranülasyon aktivitesi, hücredeki toplam enzim içeriği ile normalize edilmiş hücre dışındaki enzimlerin salınım yüzdesi olarak ölçüldü.

Bir hedef kimyasalın etkisini incelemek için mast hücresi degranülasyon testi

Bu video, yetişkin farelerin periton boşluğundan olgun bağ dokusu tipi mast hücrelerini izole etmek için bir periton lavaj yöntemini göstermektedir. Periton boşluğundan primer immün hücrelerin bir karışımı izole edildikten sonra, uygun kültür koşulları altında mast hücrelerinin seçici proliferasyonu gerçekleştirilir.

Primer Mast Hücrelerini Murin Periton Boşluğundan İzole Etme Tekniği

Mast hücreleri ve bazofillerin aktivasyonuyla karakterize alerjik tepkiler, IgE çapraz bağlanması ve proenflamatuar aracıların salınması ile tahrik edilmektedir. Alerjik tepkilerin bir kantitatif olarak değerlendirilmesi allerjen vasküler geçirgenlikte değişiklikleri izlemek için Evans mavisinin kullanılması sureti ile elde edilebilir.

Farelerde Yerel Anafilaksi Ölçme

Bu protokolün amacı, mast hücresi salgısının fonksiyonel genomik analiz sağlayacak bir yöntem geliştirmektir. Protokol çıkar ve gerçek zamanlı gen ile cotrasfected bir flüoresan raportör geninin salınımının nicel değerlendirilmesine dayanır salgılama granülün en morfolojisinin analiz eder.

Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Bu protokol, fare derisinin besin açısından zengin ortamda enzimatik sindirimini ve ardından lökositleri izole etmek için gradyan ayrımını tanımlar.  Bu şekilde türetilen hücreler, çeşitli alt uygulamalar için kullanılabilir. Bu, doku ayrışma makinelerine ve daha sert tripsin ve dispas bazlı doku sindirim protokollerine etkili, ekonomik ve gelişmiş bir alternatiftir.

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Vivo klonal analizi ve kader eşleme, aortik explants ve izole düz kas hücreleri ayrıntılı burada kullanarak embriyonik ve perinatal fare aort eğitim için kullanılan protokol. Bu farklı yaklaşımlar normal gelişim embriyonik ve perinatal aort ve hastalık patogenezinde morfogenez incelenmesi kolaylaştırmak.

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

Burada, izole ve fare peritoneal mast hücreleri yetiştirmek için bir protokol mevcut. Biz de onların fonksiyonel karakterizasyonu için iki protokol tarif: hücre içi ücretsiz Ca2 + toplama ve degranulation tahlil floresan bir görüntüleme dayalı yayımlanan β-hexosaminidase Renkölçer miktar üzerinde.

Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

Bu makale bakteriyofaj lambda, enfeksiyon bir floresan etiketli versiyonu hazırlamak için prosedürü...

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

Öğrenin, mast hücrelerinin işlevlerini in vivo analiz etmek için kemik iliği kaynaklı kültüre mast hücrelerinin mast hücre eksik farelere aktarım yöntemini. Akış sitometrisi ve immünohistokimya ile değerlendirme yapılır.

' MastCell Knock-in'Fareleri Kullanarak Mast Hücrelerinin İşlevlerini Analiz Etme

Daha fazla video keşfet