' MastCell Knock-in'Fareleri Kullanarak Mast Hücrelerinin İşlevlerini Analiz Etme

Aşağıdaki yöntemin genel amacı, mast hücresi knockin fareleri kullanarak mast hücrelerinin fonksiyonlarını in vivo olarak analiz etmektir. Bu, önce kemik iliğinden türetilmiş kültürlenmiş mast hücreleri veya BMC MC'ler üreterek veya mast hücresi eksikliği olan farelere aşılama ile elde edilir. İkinci adımda, BMC MC'ler, mast hücresi knockin fareleri oluşturmak için mast hücresi eksikliği olan farelerdeki çeşitli anatomik bölgelere evlat edinici olarak aktarılır.

Sonuç olarak, evlat edinilerek transfer edilen mast hücrelerinin sayıları ve anatomik dağılımı, aşılanmış popülasyonların vahşi tip farelerde bulunanlara ne ölçüde benzediğini değerlendirmek için akış sitometrisi ve immünohistokimyasal analiz ile değerlendirilir. Bu tekniğin ana avantajı, aşılanmış duvar tipinin veya genetiği değiştirilmiş MA hücre popülasyonlarının işlevlerinin in vivo olarak doğrudan değerlendirilmesine izin vermesidir. Bu nedenle bu yöntem, MA hücrelerinin veya ürünlerinin, insan hastalığı modelleri de dahil olmak üzere fizyolojik, immünolojik veya patolojik süreçlerin fare modellerinin özelliklerine ne ölçüde katkıda bulunabileceği gibi, MA hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Genel olarak, bu yöntemi öğrenen bireyler mücadele edebilir, çünkü mast hücre engrefti ve eksikliği, BM CMC'leri oluşturmak için kullanılan yönteme, enjeksiyonun köküne, enjekte edilen BMC MC'lerin sayısına ve in vivo deneyler yapmadan önce aşılamadan bir ağırlık sonraki hafta sayısına bağlı olarak değişebilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü aşılama prosedürünün yönlerinin tam olarak nasıl gerçekleştirildiği görülmedikçe öğrenilmesi zordur. Önce kemik iliğini çıkarmak için, herhangi bir kemik epifizini rahatsız etmeden vahşi tip farelerden femur, tibia ve fibulayı toplamak için steril diseksiyon aletleri kullanın.

Her kemik disseke edilirken, forseps ile sabitleyin ve tüm yabancı dokuyu kazıyın. Daha sonra, tüm kemikler toplandığında kemiği PBS'ye buz üzerine yerleştirin, onları steril bir doku kültürü başlığına aktarın, daha sonra birer birer, her kemiği forseps ile sabitleyin ve medüller boşlukları ortaya çıkarmak için her iki epifizi kesin. Daha sonra, 30 gauge iğne ile donatılmış üç mililitrelik şırınga ve soğuk ortamın yıkanması kullanılarak, her kemikten alınan tüm kırmızı ilik yeni bir Petri kabına Tüm kemikler yıkandığında, kemik iliği hücre kümelerini ayırmak için aynı şırıngayı kullanın. tekrarlanan hafif aspirasyon ve ejeksiyon ile.

Daha sonra hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü soğuk yıkama ortamı ile doldurun ve hücreleri santrifüjleyin. Hücre peletini 10 mililitre kültür ortamında askıya alın.

Daha sonra kemik iliği hücrelerini uygun büyüklükte bir doku kültürü şişesine aktarın. Bir ila iki günlük kültürden sonra, yapışmayan hücreleri, sonraki haftalarda fare başına orta olan 10 mililitre taze kültürle birlikte yeni bir şişeye aktarın. Hücreleri her üç ila dört günde bir beslemek sadece gösterilmiştir.

Yapışmayan hücrelerin, kulak pinner Resus'a intradermal engraftman için hiçbir tutunma hücresi kalmayana kadar haftada bir kez yeni bir şişeye aktarılması. BMC MC'leri soğuk DMEM'de mililitrede dört kez 10 ila yedi hücrede askıya alın. Daha sonra hücreleri 30 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırıngaya aspire edin ve şırıngayı buzun üzerine yerleştirin.

Daha sonra, dört ila altı haftalık mast hücresi eksikliği olan alıcı farenin üst tutamıyla uygun anestezi derinliğini onaylayın ve hücreleri enjekte etmek için göz merhemi uygulayın. Kulak iğnesinin ventral yüzünü ortaya çıkarmak ve germek için işaret parmağını kullanın, kulağın sırt yüzü üzerinde dikey basınç oluşturun. Daha sonra, kulağın ortasına altı BMC MC'ye bir kez 10 kez 1 25 mikrolitre intradermal enjeksiyon uygulayın ve aynı şekilde iğnenin ucuna doğru ikinci bir 25 mikrolitre enjeksiyon yapın.

İntraperitoneal için, aşılama, BMC MC'lerini soğuk DMEM'de mililitrede 10 ila yedi hücreye bir kez yeniden süspanse eder. Daha sonra, intravenöz engraftman için mast hücre eksikliği olan alıcıların periton boşluğuna 200 mikrolitre ortamdaki altı BM CMC'ye iki kez 10 kez enjekte etmek için 25 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın. BM CMC'leri soğuk DMEM'de mililitre başına yedi hücreye 2.5 kez 10 kez yeniden süspanse edin ve daha sonra kuyruk damarı yoluyla 200 mikrolitre ortamda altı BMC MC'ye beş kez 10 enjekte edin.

İntraperitoneal aşılamadan dört ila altı hafta sonra, alıcı hayvanın periton boşluğuna beş mililitre soğuk PBS enjekte etmek için 25 gauge iğne ile donatılmış beş mililitrelik bir şırınga kullanın. Periton hücrelerini toplamak için karın bölgesine 20 saniye masaj yapın. Ardından, periton lavajını yavaşça aspire etmek için 22 gauge iğne ile donatılmış beş mililitrelik bir şırınga kullanın.

Peritoneal lavaj sıvısındaki mast hücre yüzdesi ve toplam hücre sayısı daha sonra akış sitometrisi veya histo kimyası ile değerlendirilebilir. Mezenterik pencerelerdeki mast hücrelerini değerlendirmek için, bağırsak sistemini açığa çıkarmak için periton zarını kesin. Fare başına dört ila beş mezenterik pencereyi bir slayt üzerine yerleştirin ve ardından araba gürültüsü çözümünde bir saatlik bir sabitleme yapın.

Kuluçka süresinin sonunda oda sıcaklığını ekleyin, slaytları havayla kurutun ve bağırsağı çıkarın. Sabit mezenterik pencereler kızaklara bağlı kalacaktır. Son olarak, preparatları oda sıcaklığında 20 dakika boyunca chaba boyama solüsyonu ile boyayın, bir 15 ve 45 günlük kültürden sonra BM CMC'lerin akış sitometrik analizini ve odin mavisi boyamasını temsil eder DMEM'de, IL ile takviye edilmiş üç BM CMC'nin 45 gün boyunca kültürlendiği ve %95 saf olduğu ve yüksek sayıda sitoplazmik granül içerdiği gösterilmiştir.

Bu nedenle, bu kültürlerden alınan hücreler aşılama deneyleri için uygundur, oysa 15 gün boyunca kültürlenen hücreler bu görüntülerde yer almaz. İntradermaldan dört hafta sonra kulak kuruşunun başarılı bir şekilde aşılanması, mezenterik pencerelerin aşılanması, intraperitoneal engraftmandan altı hafta sonra periton boşluğunun ve intravenöz engraftmandan 12 hafta sonra akciğerin başarılı bir şekilde aşılanması beklendiği gibi gösterilir. Yabani tip farelerden izole edilen doku örneklerinde mast hücreleri bulunurken, mast hücresi eksikliği olan hayvanlarda mast hücresi eksikliği olan farelerde mast hücresi tespit edilmemiştir.

Bununla birlikte, evlat edinilen BMC MC'ler, vahşi tip hayvanlarda gözlemlenenlere benzer yerlerde ortaya çıkar. Bu prosedürü denerken, aşılama ile deneyin incelenmesi arasındaki sürenin mast hücresi enjeksiyon bölgesine bağlı olarak değişeceğini akılda tutmak önemlidir. Aşılanmış hücrelerin olgunlaşması ve son konumu vivo alması için yeterli zaman tanımak için bu aralıklara uymak çok önemlidir.

Bu yaklaşım, kütle hücresinin ve ürünlerinin in vivo olarak neler yapabileceği veya yapamayacağı hakkında önemli bilgiler sağlamıştır ve sağlamaya devam etmektedir. Canlı hayvanlarla çalışmanın özel eğitim, deney protokollerinin uygun şekilde gözden geçirilmesi ve onaylanması ve bu prosedürleri gerçekleştirirken hayvanın acısını ve stresini azaltmaya özen göstermek de dahil olmak üzere en yüksek hayvan bakımı standartlarına sıkı sıkıya bağlı kalmayı gerektirdiğini lütfen her zaman unutmayın.