Name: Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Öğrenin, COMET assay yöntemiyle insan kanından izole edilen lökositlerde DNA hasarını ölçerek oksidatif stresi dolaylı olarak değerlendirmeyi. Bu teknik, düşük maliyetli ve güvenilir bir analiz sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mali oksidatif stres üzerinde araştırma desteklemek için, Triesen Liechtenstein, LHW Stiftung teşekkür etmek istiyorum.

Basel Üniversitesi&#39;nde gerçekleştirilen comet ile ilgili çalışmalar, Göz Hastalıkları Anabilim Dalı Basel Yerel Etik Kurulu tarafından kabul edildi Reaktifler 1. Hazırlık <ol><li> Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (PBS) (Ca ++, Mg ++ serbest) PBS (1 L paket) ve ortam dH 2 O 990 ml ekleyerek çözeltisi hazırlayın. 7.4&#39;e pH ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Yokedici çözelti hazırlayın: 1000 mi dH 2 O içinde 2.5 M NaCl (146.1 g), 100 mM EDTA (37.2 g) ve 10 mM Trizma bazı (1.2 g) ekleyin hazırlamak için </li><li> 1500 mi dH 2 O 10 M NaOH, 30 ml ve 7.5 ml arasında 0.2M EDTA, QS ekleyerek elektroforez tamponu (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) hazırlayın ve iyice karıştırın. toplam hacim jel kutu kapasitesine bağlıdır. Önceki&gt; 13 olan bir pH sağlamak için tampon pH ölçümü, kullanımı. </li><li> 0.4 M Tris ihtiva eden nötralizasyon tamponu hazırlayın (&amp; # konsantre edildi, (48.5 g ~ 800 mi dH 2, O, pH&#39;ı 7.5&#39;e ayarlamak üzere eklenmiştir)62; dH 2 O ile 10 M HCI) 1,000 ml Oda sıcaklığında çözelti saklayın. </li><li> Boyama çözüm hazırlayın. Etidyum bromür (EtBr; 10x stok, 20 ug / ml), oda sıcaklığında 50 mi dH 2 O ve mağaza EtBr 10 mg ekleyin. 1x Stok - 9 ml dH 2 O ile 1 ml karıştırın DİKKATLİ! Bilinen bir kanserojen olarak yeterli önlem ile EtBr tutun. </li></ol> Lökosit 2. izolasyonu <ol><li> Venöz ponksiyon ile heparin gibi bir anti-pıhtılaştırıcı, insan kan örnekleri (20 mi) elde edilir. </li><li> Böyle Histopaque bir yoğunluk gradyan hücre ayırıcı kullanılarak lenfositleri ayırın. <ol><li> 600 ul hücre ayırıcı sıvı üzerinde 1 PBS veya (FBS&#39;siz) RPMI oranı ve katmanın: Kısaca, 1 kan sulandırmak. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca santrifüje 1800 x g. PBS / RPMI 3-5 ml &#39;Buffy&#39; kat aspire ve lenfositler pelet 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj edilir. </li><li> (Sadece PBS arasındaki sınır yukarıdan RPMI lenfositleri AlBir pipet kullanarak) ve hücre ayırıcı sıvı. Plazma ve her bir tüp hücre ayırıcı sıvı katman arasındaki ara lökosit bantları çıkarın ve bir 50 ml tüp içine toplar. </li></ol></li><li> Soğuk Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ile 50 ml toplam hacmi getirmek. 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücre süspansiyonu DMEM ile üç kez yıkayın. </li><li> Bir hemositometre kullanılarak hücrelerin toplam sayıları sayın. PBS hücrelerin askıya alma ve 10 7 hücre / tüp mikrosantrifüj tüpler içine veya or. </li><li> Pipet 5 ml&#39;lik bir plastik tek bir tüp içine hücre 0.4 ml. 40 ° C de 1.2 ml% 1 düşük jelleşme sıcaklıklı agaroz ekleyin. Karıştırın ve hızlı bir şekilde ve bir önceden kaplanmış sürgünün agaroz kaplı yüzey üzerine hücre süspansiyonu 1.2 ml pipetleyin. Kabarcıklar üreten kaçının. </li><li> Agaroz, yaklaşık 2 dakika boyunca jel izin verin. Jelleşme için kullanılan zaman ve sıcaklık ile tutarlı olun ve bu agaroz tamamen lizis çözeltisi içinde daldırarak önce ayarlanmış olduğundan emin olun. S tamamen sonraet, ~ 4 ° C&#39;de çözüm parçalama içine daldırın. </li></ol> 3. Lizis ve elektroforez NOT: açıklanan prosedür pH&gt; 13 alkali koşullar altında elektroforez içindir. <ol><li> ~ 4 ° C&#39;de en az 2 saat sonra, yavaşça parçalama Çözüm slaytları çıkarın. Yer mümkün olduğunca birbirine onları yakın kayma, bir ucu yakınında yatay jel kutusunun yan yana slaytlar. </li><li> Sıvı seviyesi tamamen slaytlar (agaroz üzerinde kabarcıkları önlemek) kapsar kadar taze yapılmış pH&gt; 13 elektroforez tamponu ile tampon rezervuarları doldurun. </li><li> 20 dakika DNA çözülmesi ve aside karşı duyarlı bir hasar ekspresyonuna izin vermek için kızağı alkalin tampon içinde bekletin. </li><li> 25 volt (~ 0.75 V / cm) güç kaynağı açın ve yükseltilmesi veya tampon seviyesini düşürerek 300 miliamper akım ayarlayın. 30 dakika boyunca slaytlar Electrophorese. </li><li> Gücü kapatın. Yavaşça tamponu ve p slaytlar asansörbir drenaj tepsisine dantel. Bilge kaplamaz nötralizasyon Tampon slaytlar bırakın. Slaytlar en az 5 dakika bekletin. Slaytlar boşaltın ve iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 80 ul 1x Etidyum Bromür (EtBr) ile slaytlar Leke ve 5 dakika bekletin ve daha sonra fazla leke çıkarmak için soğuk distile su daldırma. Ardından slayt üzerinde bir lamel yerleştirin ve hemen saklayın. Mağaza kuru koşullarda oda sıcaklığında bir ay boyunca kayar. Not: Diğer DNA lekeleri (örneğin, SYBR yeşili) de kullanılabilir. Dikkat! En boyalar mutajenik olduğu gibi koruyucu eldiven giyin. </li></ol> DNA Breaks 4. sayısallaştırılması <ol><li> DNA hasarını görselleştirmek için, 40X objektif floresan mikroskop altında EtBr lekeli DNA slayt gözlemleyin. </li><li> DNA göçünü uzunluğu ve göç DNA (Şekil 1A) yüzdesinin ölçülmesiyle hücrelerinde nicel DNA hasarını değerlendirmek. Bagaj an ve Zeytin-Mome DNA hasarını (Şekil 1B) ölçmeknt. Kuyruk Moment ve Zeytin -Moment tanımları önceden 8-10 verilmiştir. NOT: Bizim tecrübelerimize göre bu parametrelerden biri tarafından sopa yeter. Hücreler mikroskop lamı ve fotoğraflar hücreleri üzerinde tarar otomatik bir araç ayarlayarak fotoğraflandı. DNA kırılmalarının Niceleme görüntü analiz yazılım paketleri tarafından yapılabilir. Özel hücrelerin görüntü yakalama ve DNA hasarı ölçmek için yapılan birkaç farklı yazılım paketleri vardır. Biz deney boyunca aynı yazılım paketini kullanmanızı öneririz. laboratuvar teknisyeni sağlam hücre veya kuyrukluyıldız bilgisayarda atılır tanımlayan ve üzerinde fare ile tıklar. kuyrukluyıldız veya sağlam hücre sonra otomatik puanlanır. </li></ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+fields+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li>
<li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay%3A+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li>
<li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li>
<li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer%3A+role+of+lipid+peroxidation%2C+DNA+damage%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li>
<li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair%3A+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li>
<li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li>
<li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tob+Induc+Dis%22%5BJournal%5D)">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li>
<li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li>
<li>Gaivão, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+comet+assay%3A+insights%2C+uses%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304(2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li>
<li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li>
<li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li>
<li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage%3A+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li>
<li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood%3A+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li>
<li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol+Nutr%22%5BJournal%5D)">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li>
<li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station%5BTitle%5D)+AND+%22Electromagn+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li>
<li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li>
</ol>

İsveçli bilim adamları Östling ve Johanson hücrelerinde 1 DNA hasarını ölçmek için kuyruklu yıldız tahlil kullanmak için kendi alanında ilk edildi. Nötr koşulların iki bilim adamı kullanılan, ancak, sadece, çift sarmallı DNA kırılmalarının saptanmasına olanak. Singh ve ark., Daha sonra, çift ve tek dallı DNA kırılmaları değerlendirmek ve aside karşı duyarlı bir sitesi 12 tespit olabilir hassas bir sürümü üretilen alkalin koşullar altında kullanım için tahlil, adapte edilmiştir. Ilk gelişimi için, deney farklı hücre tipleri 13-15 DNA hasarı türleri değerlendirmek için uygun hale getirmek için çeşitli aşamalarda modifiye edilmiştir. Tüm teknikler ile olduğu gibi, teknik ayrıntılara titiz dikkat doğru sonuçlar elde etmek için 16 önemlidir. Bizim deneyime dayalı, en iyi sonuçlar elde edilir, eğer her metodolojik adım gelen ölçümü-bir uzman laboratuvar techn tarafından kuyrukluyıldız gerçekleştirilen çözüm hazırlığıicians. taze ve doğru bir şekilde hazırlanmış medya, yeterli pipet teknikleri, tam zamanlama ve taze hazırlanmış lökositlerin (daha önce sonuç bölümünde belirtildiği gibi) kullanım kullanımı doğru sonuçlar elde etmek için 17 lizis ve jel elektroforezi için sırayla gereklidir. Bu tahlilde tüm bireysel adımlar güvenilir sonuçlar elde etmek için aynı derecede önemlidir. Genel iyi sonuçlarda 16 elde edilir kuyrukluyıldız ölçümü kadar çözüm hazırlık her metodolojik adım uzman laboratuvar technicians.Important tarafından yapılırsa görünüyor taze ve doğru hazırlanmış medya kullanımı yeterli pipet teknikleri, tam zamanlama ve zaten sonuç bölümünde tahlil 17 yeterli sonuçlar elde etmek lizis ve jel elektroforezi için taze hazırlanmış lökositlerin kullanımı olarak anılacaktır. Diğer metodolojiler yapmak gibi, kuyruklu yıldız tahlil tekniği onun Deniz Ken vardırTages ve sakıncaları. Hassas bir yöntemle olmak, tahlil DNA kırılmaları artırmak ve böylece sonuçlarını etkileyebilecek olan faktörler (örneğin, UV ışık) savunmasızdır. Araştırılmaktadır olan hariç, oksidatif stres geliştirmek her faktör, kaçınılmalıdır. Stresörler oksidatif stres lökositlerin değil, aynı zamanda tüm diğer kan ortamlar ve lenfositlerin değil sadece seviyesini artırabilir. Daha önce belirtildiği gibi oksidatif stres 18,19 ölçme birçok farklı ve daha doğrudan yolları vardır. kuyruklu deney belli avantajlara sahiptir, birçok yöntemlerden biridir. Bunlar, nispeten düşük maliyetli, (&lt;10,000 hücre) gerekli hücrelerin az sayıda hasta başına gereken kan dolayısıyla küçük numuneler, hücreleri (yaklaşık olarak 3 gün) DNA hasarına ölçmek için gereken zaman göreceli olarak kısa bir süre, duyarlılık içerir ve farklı hücre tipleri de eşek DNA hasarı olan yaygın uygulanabilirliği. Biz bu deneyimi vardı çünkü Geçmişte biz lökositler ile çalışmayı tercihhücre tipi ve planlanan belirli bir çalışma için de geçerlidir. Kuyruklu tahlilin diğer bir avantajı, farklı türde ve DNA hasarının düzeylerini tespit etmek için kullanılabilir ve böylece bu tür DNA onarım çalışmaları, takviye çalışmalarda ya da genotoksisite çalışmaları gibi oksidatif stres yanında çalışmalar çeşitli alanlarda uygulanabilir olmasıdır. Oksidatif stres artık birden fazla hastalığın patogenezinde kritik bir rol oynuyor olarak kabul edilmektedir. kuyruklu yıldız tahlil metodu, oksidatif stres 18,19 ölçme birçok yollardan biri ise, nispeten basit, çok yönlü ve ucuz. Hakim olduğunda, bu yöntem, oksidatif stres rol 8-10,20,21 oynadığı tüm tıp alanlarında kullanılabilir.

Comet tahlil ilk İsveçli bilim adamları Östling ve Johanson 1 tarafından geliştirilmiştir. DNA, negatif yüklü bir moleküldür. Elektroforez sırasında, küçük hasarlı DNA fragmanları daha hızlı bir pozitif yüklü anot 2 doğru okuyun. DNA fragmanları küçük, anoda doğru daha hızlı göç sağlam, hasarsız DNA ve hasar görmüş DNA fragmanlarının 3 oluşan bir &quot;kuyruk&quot; oluşan &quot;kafa&quot; ile, tipik bir &quot;kuyruklu yıldız&quot; oluşturulur. Hasarlı DNA 5 oldukça dengeli DNA kırıkları nesil tutmak vücutta 4 farklı mekanizmalarla, tarafından tamir edilebilir. Ancak, denge DNA kırılmalarının lehine ise, sonları birikebilir ve sonuçta bir hastalığın gelişimine katkıda bulunacaktır. Bizim DNA belirli bir zamanda 6 yaklaşık 0,000165% hasar uğrar. Tek şeritli DNA sonları DNA çift iki sarmal birinde bir arıza bakınızDNA çift sarmal her iki ip kolları hasar gördüğünde, çift iplikçikli DNA kırılmaları kaynaklanır ise. Bu tür bir hücre yaşı, sigara dumanı, çeşitli ilaç ve oksidatif stres 7-9 olarak belirli bir zamanda DNA kırılmalarının miktarını arttırmak çeşitli faktörler vardır. Geliştirilmiş DNA kırılmalarının giden tüm faktörler sabit tutulduğu, daha sonra kuyruklu testin vasıtasıyla DNA kırılmalarının miktar oksidatif stres iyi dolaylı bir parametredir. comet yöntemi Oftalmoloji dahil tıpta giderek günümüzde kullanılmaktadır. Bunun bir nedeni, oksidatif stres daha bir yöntem, dolaylı miktarlarının saptanması için oksidatif stres ile çeşitli hastalıklar 8-11 ve kuyruklu testin bir patogenetik mekanizması olarak kabul olmasıdır.

<table><tbody><tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td> <td>Qualigens</td> <td>(CPW59)</td><td></td></tr> <tr><td>Disodyum EDTA</td><td>HiMedia</td> <td>(RM1370)</td><td></td></tr> <tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Sigma</td> <td>(E-8751)</td><td></td></tr> <tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td> <td>(1077-1)</td><td></td></tr> <tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) (Ca ++, Mg ++ içermez)</td> <td>HiMedia</td> <td>(TS1006)</td><td></td></tr> <tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Jel elektroforezi için gerekli malzemeler</td></tr><tr><td>Normal Erime Agaroz (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Erime Noktası Agaroz (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Metanol - Qualigens Lameller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(No. 1, 24 x 60 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetör ve Uçlar</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları, Konvansiyonel / Mikro jel elektroforez (MGE) slaytları</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sistemik oksidatif stresin bir dolaylı tedbir olarak comet assay

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Oksijen olmadan yaşayamam yüksek ökaryotik organizmalar; Henüz, paradoksal olarak, oksijen onlara zararlı olabilir. farklı pi * Anti-yapıştırma yörüngelerde bulunan iki eşleşmemiş elektrona sahip olduğundan oksijen molekülü kimyasal nispeten atıl olduğunu. Bu iki elektron kendi eksenleri etrafında aynı yönde, yani paralel bir dönüş vardır. Oksijen molekülü değil, çok reaktif olmasının nedeni budur. Oksijen aktivasyonu iki farklı mekanizma ile ortaya çıkabilir; ya bir zaman (tek değerli azaltma) az bir elektronun yoluyla azaltma yoluyla, ya da yeterli enerji emilimi sayesinde eşleşmemiş elektronların birinin dönüşünü ters. Bu reaktif oksidatif türlerinin (ROS) üretimine yol açar. İnsan vücudu fizyolojik halde ROS ortadan kaldırır olan bir dizi yol vardır. ROS üretim onarım kapasitesi, oksidatif stres sonuçları ve zararları farklı moleküller aşarsa. Oksidatif stres beni olabilen birçok farklı yöntem vardırasured. Bu yazıda ayrıca DNA kırıkları ölçümünü sağlayan &quot;kuyruklu tahlil&quot; olarak bilinen hücre jel elektroforezi adlı yöntemlerden biri üzerinde duruluyor. Oksidatif stres dışında DNA hasarına yol açabildiği bilinmektedir tüm faktörler sabit tutulduğu takdirde, kuyruklu tahlili ile ölçülen, DNA hasar miktarı oksidatif stres iyi bir parametredir. prensibi basittir ve DNA molekülleri negatif yüklü gerçeği dayanır. Sağlam bir DNA molekülü bu elektroforez sırasında göç etmez böyle büyük bir boyutu vardır. DNA tatili, ancak, anoda doğru elektrik alanında hareket küçük parçalar halinde mevcut sonuç eğer. Daha küçük fragmanlar hızlı göç ederler. Fragmanları farklı boyutlara sahip olarak elektroforez nihai sonucu belirgin bir çizgi, ancak daha ziyade bir kuyruklu şekline sahip bir sürekli değildir. Sistem hücresinde DNA kırıkları ortaya çıkan &quot;kuyrukluyıldız&quot; ve böylece bir ölçümü sağlar.

Kuyruklu testin yöntemi tekrarlanabilir sonuçlar vermektedir rağmen, çeşitli faktörlere göre etkilenebilir. Böyle bir faktör, lökositlerin önceden liziz ve jel elektroforez ya da bu aşama taze hazırlanmış lökositler üzerinde gerçekleştirilir olup dondurularak olsun ya da değildir. Gösterir Şekil 2 bu lökositler liziz ve jel elektroforezi p-DNA önce dondurularak saklandı, Grup 2 sonları parçalama ve jel -electrophoresis taze hazırlanmış hücreleri üzerinde yapıldığını Grup 1 daha anlamlı olarak daha yüksek idi. Tahlil da dolaylı olarak sistemik oksidatif stresi değerlendirmek için de kullanılabilir. Tablo 1 sigara içen ve sağlıklı kişilerde bagaj an ve zeytin an için tanımlayıcı istatistikleri gösterir. veri daha fazla günlük sigara yarım paket sigara dolaşan lökositlerin 9 ssDNA sonları iki katına çıktığını ortaya koymaktadır. <img alt="Şekil 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="Şekil 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Şekil 1. (A) kuyrukluyıldız tahlil analizleri sırasında kullanılan mikroskop yansıtır. (B) Δ parlak baş ve kuyruk (daha küçük DNA fragmanlarını hasarlı) ile tipik bir &quot;kuyruklu&quot; anlatıyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Lökositler taze hazırlanmış lökositler lizis ve jel elektroforez önce kullanıldığı zaman daha (Grup 2) dondurularak zaman Şekil 2. ssDNA sonları anlamlı derecede yüksekti. <imgalt = &quot;Tablo 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tablo 1. Sigara içenler ssDNA&#39;nın iki katından daha fazla sayıda sağlıklı sigara içmeyen eşleştirilmiş yaş ve cinsiyete göre tatili vardı.

Comet tahlil farklı faktörler tarafından uyarılan DNA kırılmaları, ölçer. DNA hasarına yol açan (oksidatif stres hariç) tüm faktörler sabit tutulması durumunda, DNA hasar miktarı oksidatif strese iyi bir dolaylı bir parametredir. Bu protokolün amacı, oksidatif stresin dolaylı ölçümü için kuyruklu yıldız tahlil kullanmaktır.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Bu prosedürün genel amacı, oksidatif stresin dolaylı ölçümü için COMET analizini kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle insan kan örneklerinden lökositlerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise hücreler düşük erime noktalı agar ile karıştırılır ve lamlar üzerine immobilize edilir.Ardından, hücreler iki saat boyunca lize edilir ve ardından lamlar dium bromür ile boyanarak elektroforez uygulanır. DNA, floresan mikroskobu ile görüntülenir. Son olarak, DNA kırılmaları, floresan mikroskobu verilerinin yazılım analizi ile nicelleştirilir.Günümüzde oksidatif stresin, elbette göz hastalıkları da dahil olmak üzere birçok hastalığın patogenezinde kritik bir rol oynadığını biliyoruz. Oksidatif stresi ölçmenin birçok farklı yolu vardır. Bunu dolaylı olarak ölçmenin bir yolu, komet deneyi aracılığıyladır.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, oksidatif stresi dolaylı olarak ölçebildiğimiz basit, düşük maliyetli ve güvenilir bir taktik olmasıdır. Bu deney için lökositler, lenfositleri ayırmak amacıyla antikoagülan ile venöz ponksiyon yoluyla elde edilen insan kan örneklerinden izole edilecektir; öncelikle kanı PBS ile bire bir oranda seyreltin. Ardından üzerine 600 µL histo pack gibi bir yoğunluk gradyanlı hücre ayırıcı sıvı ekleyin ve 4 °C'de 20 dakika boyunca 1.800 G'de santrifüjleyin.Buffy coat tabakasını üç ila beş mililitre PBS içine aspire edin ve 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Lenfositleri bir pipet yardımıyla toplamak için, PBS ile hücre ayırıcı sıvı arasındaki sınırın hemen üzerinden lenfositleri geri alın. Her tüpün plazma ve hücre ayırıcı sıvı katmanları arasındaki ara yüzeyden lökosit bantlarını uzaklaştırın ve tek bir 50 mililitrelik tüpte toplayın.Toplam hacmi soğuk PBS ile 50 mililitreye tamamlayın. Hücre süspansiyonunu PBS ile 300 G'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, bir hemositometre kullanarak toplam hücre sayısını belirleyin.Hücreleri PBS içinde süspande edin ve mikrosantrifüj tüplerine tüp başına 10 milyon hücre olacak şekilde pipetle aktarın. 1,5 mL'lik tek kullanımlık plastik bir tüpe 0,4 mL hücre ekleyin. 500 µL %1 düşük jelleşme sıcaklığına sahip agar içine 50 µL hücre süspansiyonu ekleyin.40 °C'de önceden hazırlanmış agarose karışımından 50 µL hücre süspansiyonunu, önceden kaplanmış bir lamın agarose kaplı yüzeyine hızla pipetleyin. Agarose'un 4 °C'de yaklaşık iki dakika boyunca jelleşmesini bekleyin. Jelleşme için kullanılan süre ve sıcaklık konusunda tutarlı olun ve lizis prosedürüne geçmeden önce agarose'un tamamen donduğundan emin olun.Agroz tamamen donduğunda, lamları dört derece Celsius'ta en az iki saat boyunca bir liz solüsyonuna batırın. Ardından, lamları liz solüsyonundan nazikçe çıkarın. Lamları yatay bir jel kutusunun bir ucuna yakın bir yere yan yana yerleştirin ve birbirlerine mümkün olduğunca yakın olacak şekilde kaydırın.Tampon rezervuarlarını taze hazırlanmış, pH değeri 13'ten büyük elektroforez tamponu ile doldurun. Burada gösterilen prosedürün elektroforez için olduğunu unutmayın. pH değeri 13'ten büyük alkali koşullar altında, sıvı seviyesi lamları tamamen kapatana kadar tampon rezervuarlarını doldurun.Arosların üzerinde hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. DNA'nın açılmasına ve alkali ile duyarlı hasarın ortaya çıkmasına izin vermek için lamı 20 dakika boyunca alkali tampon çözeltide bekletin. 20 dakika sonra, güç kaynağını 25 volta ayarlayın ve tampon seviyesini yükselterek veya düşürerek akımı 300 miliampere ayarlayın.Elektroforez lamlarını 30 dakika boyunca çalıştırın. 30 dakika sonra gücü kapatın. Lamları tampon çözeltiden nazikçe kaldırıp bir süzme tepsisine yerleştirin ve lamların üzerini damla damla nötralizasyon tamponu ile kaplayın.Slaytların en az beş dakika boyunca beklemesini sağlayın. Slaytları süzün ve kaplama işlemini nötralizasyon tamponu ile iki kez daha tekrarlayın. Ardından, slaytları bir mililitre 1x etyum bromür ile beş dakika boyunca boyayın.Etil bromür bilinen bir karsinojen olduğundan koruyucu eldiven giyin. Beş dakika sonra, fazla boyayı uzaklaştırmak için lamları soğutulmuş distile suya daldırın. Ardından her lamın üzerine bir lamel yerleştirin.Lamları hemen saklayın. Boyanmış lamlar, kuru koşullarda dört derece santigrat sıcaklıkta bir ay boyunca saklanabilir. DNA hasarını görselleştirip değerlendirmek için, etidyum bromür ile boyanmış DNA lamını 40 x objektifli bir floresan mikroskobunda inceleyin.Mikroskobun üzerinde tarama yapan otomatik aracı ayarlayın, comet assay'deki hücrelerin lamını hazırlayın ve fotoğraflarını çekin. DNA hasarı, DNA migrasyon uzunluğu ve migre olan DNA yüzdesi ölçülerek hücrelerde kantitatif olarak değerlendirilmiştir. Siyah ok başı, parlak bir baş ve kuyruğa sahip tipik bir comet'i göstermektedir.Baş kısmı sağlam, hasarsız DNA'dan oluşurken, kuyruk kısmı daha küçük hasarlı DNA fragmanlarından oluşur. COMET analizi tekrarlanabilir sonuçlar verse de, analizin taze hazırlanmış lökositler üzerinde yapılıp yapılmaması gibi çeşitli faktörlerden etkilenebilir. Bu grafikte, kuyruk momenti, kuyruk uzunluğu ile kuyruk DNA miktarının çarpımı olarak tanımlanmıştır.Toplam DNA'nın DNA yüzdesi; liz ve elektroforez öncesinde kriyoprezervasyon uygulanan ikinci grup lökositleri, taze hazırlanan birinci grup lökositlere göre anlamlı derecede daha yüksek tek zincirli DNA kırıkları göstermektedir. Bu analiz, sistemik oksidatif stresi dolaylı olarak değerlendirmek için de kullanılabilir. Burada, zeytin momenti, kuyruktaki toplam DNA yüzdesi ile baş ve kuyruk bölgelerinin kütle merkezleri arasındaki mesafenin çarpımını temsil eder.Yaş ve cinsiyet açısından eşleştirilmiş sigara içenler ve sağlıklı deneklerden elde edilen sonuçlar, günde yarım paket sigara içmenin dolaşımdaki lökositlerdeki tek zincirli DNA kırılmalarının sayısını iki katından fazla artırdığını ortaya koymaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu tekniğin; nispeten düşük maliyeti, ihtiyaç duyulan hücre sayısının azlığı ve dolayısıyla hasta başına gereken kan örneğinin küçük olması ve hücrelerdeki DNA hasarını belirlemek için gereken sürenin nispeten kısa olması gibi çeşitli avantajları bulunmaktadır.

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Video, zararlı ajanlara maruz kaldıktan sonra DNA hasarını tespit etmek için kuyruklu yıldız testini göstermektedir. Alkali koşullar altında, DNA gevşer ve denatüre olur ve elektroforez üzerine, hasar görmemiş ve hasar görmüş DNA, agaroz jeli içinde farklı şekilde göç ederek kuyruklu yıldız şeklinde bir yapı oluşturur. Yavaş göç eden hasarsız DNA, dairesel kuyruklu yıldız kafasını oluştururken, hızla göç eden hasarlı DNA parçaları, uzun kuyruklu yıldız kuyruğunu oluşturur.

Hücrelerde DNA Hasarı Tespiti için Comet Deneyi

Bu video, biyolojik örneklerdeki oksidatif stresi değerlendirmek için tiyobarbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) testini göstermektedir.

İnsan Serumunda Oksidatif Stresi Değerlendirmek için Tiyobarbitürik Asit Reaktif Maddeler Testi

Comet assay alkali labil siteleri ve hipokampal nöronlar da dahil olmak üzere tüm hücrelerde DNA üzerinde DNA-DNA/DNA-protein çapraz bağlantılar dahil tek ve çift zincir kırıkları, tespit etmenin en etkin yoludur. Yöntem DNA hasar miktarının farklılıklara bağlı olarak, bir elektrik alanı içinde DNA diferansiyel göç yararlanır.

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

Biz burada görülmemiş verimlilik ile DNA hasarı kuyrukluyıldız tahlil tespiti sağlayan bir platform açıklar. Cihaz desenler mikroarreylerinin içine memeli hücreleri ve 96 örneklerinin paralel işleme sağlar. Yaklaşımı temel düzeyde DNA hasarı, pozlama kaynaklı DNA hasarı ve DNA onarım kinetik analizini kolaylaştırır.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

Alkali kuyruklu yıldız testi, ökaryotik hücrelerde DNA ipliği kırılmalarını ölçer. Bir Endonükleaz III veya insan 8-oksoguanin-DNA-N-glikosilaz sindirim adımı ekleyerek, test oksidatif DNA hasarını etkili bir şekilde tespit edebilir. Sıçan karaciğerinde DNA hasarını tespit etmek için bu tahlilleri kullanma yöntemlerini açıklıyoruz.

Sıçan Karaciğer DNA Strand Breaks ve Oksidatif DNA Hasar Ölçüm Vivo Alkali Comet Assay ve Enzim-modifiye Alkali Comet Tahlili

Kuyruklu yıldız tahlil tek ve çift iplikçikli DNA içeren DNA hasarı tatili algılamak için verimli bir yöntemdir. Kemoterapi tedavi edici etkisini değerlendirmek için kanser hücrelerinin DNA hasarı ölçmek için alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri tarif.

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

Bu protokol, DNA hasarı değerlendirmek için kuyruklu yıldız testinde kullanılmak üzere nekropsi sırasında yüksek kaliteli dondurulmuş doku örnekleri hazırlamak için çeşitli prosedürler açıklar: 1) kıyılmış doku, 2) gastrointestinal sistemden kazınmış epitel hücreleri, ve 3) küp doku bir doku kıyma cihazı kullanarak homojenizasyon gerektiren örnekler.

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

Kuyruklu yıldız tahlili, DNA hasarını tespit etmenin popüler bir yoludur. Bu çalışma, kuyruklu yıldız testinin temsili varyantlarında slaytları çalıştırmaya yönelik bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, numune sayısını önemli ölçüde artırırken, tahlil çalışma süresini, slayt manipülasyonlarının sayısını ve jellere zarar verme riskini azalttı.

Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Bu protokol, kuyruklu yıldız tahlilinin uygulanması yoluyla FLT3 mutant hücrelerinde tip I ve tip II inhibitörlerin neden olduğu DNA hasarındaki farkı ölçmek için etkili bir yöntemi açıklamaktadır.

Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi

Hasret hücreler (DPS) gelen DNA-bağlayıcı protein bakteriyel stres mücadelede önemli bir rol oynar. Bu makalenin arıtma...

Bir uygulama<em&gt; In vitro</emDPS Protein Stres Arabuluculuk Özellikleri gözünüzde canlandırın için&gt; DNA Koruma Testi

Öğrenin, COMET assay yöntemiyle insan kanından izole edilen lökositlerde DNA hasarını ölçerek oksidatif stresi dolaylı olarak değerlendirmeyi. Bu teknik, düşük maliyetli ve güvenilir bir analiz sunar.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Daha fazla video keşfet