Name: Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Öğrenin toksik kimyasalların endotel hücre göçü üzerindeki etkilerini değerlendirmek için yara iyileşmesi ve Boyden kamberi analizlerini kullanın. Bu yöntemler hücre dinamikleri ve mitokondriyal membran potansiyeli hakkında bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Alman Savunma Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir (Hibe No. M-SAB1-6-A009).

Aşağıdaki protokol, erken endotelyal hücre göçü araştırılması için teknikleri açıklar. vasküler endotelyal hücrelerin uygun bir kültür endotelyal fenotipin uygun çoğalması ve bakım sağlamak için jelatin ile hücre kültürü şişelerinde ön-kaplama gerektirir. Hücre kültürü şişeleri 1. Ön kaplama <ol><li> % 0.1 bir son konsantrasyona kadar, 0.1 M PBS içinde jelatin çözülür. </li><li> (Ayrıntılar belli otoklav talimatlara bakın) sıvı otoklav için parametreleri ile çözüm otoklavlayın. </li><li> Steril hücre kültürü şişesine (a T25 hücre kültürü şişesine örneğin, en azından 5 mi) otoklava jelatin solüsyonu yeterli hacim. </li><li> Bir inkübatör içine şişeler aktarın (37 ° C,% 5 CO2 gerekli değildir ancak müdahale etmez), en az 30 dakika karıştırıldı. </li><li> Kalan jelatin çözüm çıkarın. Daha sonra önceden kaplanmış şişeler kullanın (bkz hücre ekimi) ya da skullanılıncaya kadar steril şartlar altında yırtıldı. </li></ol> Erken Endotel hücrelerinin 2. Hücre Yetiştiriciliği Not: daha önce tarif edildiği gibi 10,11 Embriyonik kök hücre kaynaklı erken endotel hücreleri (EEC) PECAM-1 pozitif hücre fraksiyonunun, manyetik aktive edilen hücre sınıflandırma ile farklılaşmış fare embriyoid gövdelerinden elde edilmiştir. <ol><li> DMEM jelatin kaplı hücre kültür çanakları üzerinde Kültür EEC% 15 FCS, 50 U / ml penisilin, 50 u ile takviye / ml streptomisin, 200 uM L-glutamin, 100 uM beta-merkaptoetanol ve% 1 temel olmayan amino asitler yer alır. Steril koşullar altında hücrelerin taşıyınız. 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile hücreleri yetiştirmek ve% 95 nem alt izdiham (maks.% 80) kadar. </li><li> 5 oranında: alt izdiham, 1 hücreleri bölmek. Not: endotelyal hücrelerin Müfreze kritik bir adımdır. <ol><li> RT Accutase ile hücreleri Hasat. Ortamı çıkarın PBS ile yıkayın ve 25 cm başına Accutase 1 ml ekleyin <sup&gt; 2. </li><li> Hücreler müstakil kadar 2-10 dakika boyunca oda sıcaklığında balon inkübe edin. Hücreleri Dağılın ve istenen uygulama aktarabilirsiniz. Not: Accutase kimyasal nötralizasyon serpilmiş hücreleri, 37 ° C&#39;de inkübatör içinde depolanan zaman gerçekleşir olarak gerekli değildir. Ancak, Accutase aktivite de DMEM içeren FCS ekleyerek azaltılabilir. </li></ol></li></ol> 3. Boyden Odası Not: Boyden haznesi Testler 8 um gözenek büyüklüğüne sahip ışık geçirmeyen, polietilen tereftalat ekleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. <ol><li> Ön kaplama, en az 30 dakika boyunca 0.1 M PBS içinde çözülmüş,% 0.1 jelatin, 500 ul ilave edilerek filtre ekler (böylece bir Boyden haznesi oluşturmak hücre kültürü kuyu içinde bu uyum). </li><li> Hücreler toksik kimyasallara maruz kalması ise, hücre hasat öncesi spesifik deneysel tasarım göre maruz kalmaktadır. Not: Hücreler / ml DMEM 12.5 mikrogram chlorambucil maruz bırakıldı24 saat karıştırıldı. Belirli bir deney tasarımı ile ilgili olarak, kullanım talimatları değişebilir. </li><li> Hasat EEC bir sayma hücre odasını kullanarak hücre sayısını belirlemek ve. Not: Otomatik sayım cihazları kullanılabilir, ancak dikkatli kullanılmalıdır: manuel hücre sayımı daha doğru ve şiddetle tavsiye edilir. </li><li> Boyden odasının alt bölmesi bölmesine 500 ul hücre kültür ortamı. </li><li> Üst bölme bölmesindeki filtre elemanının 500 ul hücre kültür ortamı içinde tam olarak 10 4 EEC ekleyin. Kabarcıklar ortadan kaldırın. </li><li> Tam 8 saat boyunca inkübatör filtre ekler inkübe. </li><li> Bir kez PBS ile yıkayın ve hücre tespiti için 25 dakika süre ile, her iki bölme içinde 0.5 ml% 4 paraformaldehit ile orta yerine. Yoğun filtre yıkayın, ancak 0.1 M PBS ile en az 3 kez. </li><li> Bir neşter ile membranlar tüketim. </li><li> Nükleer lekelenme için DAPI içeren montaj ortamı ile iki cam kapak fişleri arasında membran monteörn. Yönlendirmeye dikkat edin. Zarın alt bölme tarafına doğru göç etmiş tek hücreler sayılır emin olun. </li><li> 400X büyütmede bir floresan mikroskop ile zarın alt bölme tarafına doğru göç etmiş hücreleri saymak. Göç hücreleri (Şekil 1A, 1B) ile membran gözenekleri karıştırmayın. Biyolojik çoğaltır makul sayıda (koşul başına en az 3 biyolojik çoğaltır) araştırın. </li></ol> 4. Yara İyileşme Testi <ol><li> DIC mikroskopi kullanılarak, plastik yüzey tabanlı kültür kaplarına veya kuyu plakaları önlemek yerine cam tabanlı cihazlar kullanın: Mevcut donanımına bağlı olarak, dikkatli bir hücre kültürü yemekleri veya plakaları seçin. Not: faz kontrast mikroskopisi kullanılarak durumunda, plastik esaslı yemekler de kullanılabilir. </li><li> Canlı hücre görüntüleme için uygun hücre kültürü cihazında AET Yetiştirmek (örneğin, 4 cm&#39;lik cam alt petri uygun)% 80 izdiham kadar. Önemli: izdiham tamamlamak için hücreleri yetiştirmek yoktur. </li><li> Steril 10 ul pipet uçları ile mono tabakaları Scratch. Çanak yüzeye çok fazla baskı olmadan hafifçe ucu itin ve müstakil hücreleri çıkarmak için 0.1 M PBS ile hücreler iki kez other.Wash bir taraftan sorunsuz bir çizgide hareket ettirin. </li><li> Kültür çanak orta yeterli hacim ekleyin. Varsa, soruşturulması gerektiğini bileşikler ekleyin. Not: ihtiva eden 1.5 ml&#39;lik ortam 15 ng / ml a linolenik asit ilave edildi. </li><li> Canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahip bir mikroskop altında kültür çanak monte edin. CO2% 5, 37 ° C ve nemlendirilmiş bir atmosfer sağlamak. Not: Nemlendirme orta buharlaşmayı önlemek için özellikle önemlidir. </li><li> 10 dakika aralıklarla 24 saat boyunca zaman atlamalı görüntüler elde. Büyük dosya boyutları için planlayın. Not: 512 x 512 piksel çözünürlük genellikle yeterlidir; Ancak, en az 1,024 x 1,0 görüntülerini kullanmanızı öneririz24. </li><li> Açık kaynak yazılım (örn ImageJ) mikroskop birlikte verilen yazılımın uzunluğu aracını kullanarak = 24 saat t = 0 saatte ve t boşluk genişliğini ölçün veya kullanmayın. Not: Genel spesifik görüntü toplama ve analiz yazılımında üreticisi tarafından sağlanır. Bu nedenle, yazılımın kullanımı ile ilgili teknik detaylar için, kılavuza bakınız. </li></ol> 5. Hücre Takibi <ol><li> DIC mikroskopi kullanılarak, plastik yüzey tabanlı kültür kaplarına veya kuyu plakaları önlemek yerine cam tabanlı cihazlar kullanın: Mevcut donanımına bağlı olarak, dikkatli bir hücre kültürü yemekleri veya plakaları seçin. Not: faz kontrast mikroskopisi kullanılarak durumunda, plastik esaslı yemekler de kullanılabilir. </li><li> Uygun bir hücre kültürü cihazında takviye edilmiş DMEM içinde 5 x 10 4 EEC Tohum (örneğin, 24-çok-yuvalı plaka) 37 ° C ve 1-2 gün süreyle% 95 nemde% 5 CO2 ile hücrelerin kültive edilmesi. </li><li> Hücreler 80 büyüdü zaman% Izdiham, ilgili test maddelerinin varlığında medya ve kültür, yeni medya ile hücreleri çıkarmak (örneğin, 12.5 mikrogram klorambusil / ml DMEM). Her zaman (bireysel deney sistemine bağlı olarak 24 saat), belli bir süre için, 37 ° C &#39;de (çözücü, örneğin, etanol ile muamele edilmiş), kontrol hücreleri içerir. </li><li> Canlı hücre görüntüleme (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) edebilen bir mikroskop altında bir kültür çanağı monte edin. Önceden tanımlanmış aralıklarla 24 saat boyunca zaman atlamalı görüntüler elde. 10 dakika aralıklarla görüntüleri edinin. </li><li> ImageJ eklentisi MTrackJ kullanılarak elle AET izleme yapın. Görüş alanından rastgele 10 hücreleri seçin ve MTrackJ komutasını &quot;Add&quot; seçeneğini kullanarak zaman içinde noktası başına bir veri noktası ekleyerek onların hareketlerini izlemek. </li></ol> [. Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;] MTrackJ ücretsiz olarak mevcuttur ve ImageJ availab: Not[Rasband, ImageJ. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;] at le. MTrackJ eklenti hakkında detaylı manuel &quot;http://www.imagescience.org&quot; mevcuttur. 6. Canlı Hücre Görüntüleme / Mitokondriyal Membran Değerlendirilmesi Potansiyeli <ol><li> Uygun bir hücre kültürü cihazında AET Yetiştirmek (örneğin, canlı hücre görüntüleme için uygun 4 cm&#39;lik cam alt petri)% 80 izdiham kadar. Önemli: izdiham tamamlamak için hücreleri yetiştirmek etmeyin. </li><li> Varsa, kimyasallara maruz hücreleri. Not: Hücreler, 24 saat boyunca 12.5 ug / ml klorambusil maruz bırakılmıştır. Belirli bir deney tasarımı ile ilgili olarak, kullanım talimatları değişebilir. </li><li> Tetrametilrodamin DMSO (TMRM) içindeki bir 10 mM stok çözelti hazırlayın. Işıktan koruyunuz. Not: Stok solüsyonu -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> (: 1000 sulandırma 1), 10 uM&#39;lik bir konsantrasyon ile bir çalışma çözeltisine hücre kültür ortamı içinde stok çözeltisi ile seyreltilir. Işıktan koruyunuzve mümkün olduğu kadar kısa zamanda kullanılır. Not: çalışma çözeltisi bir süre (&gt; 1 saat) oda sıcaklığında muhafaza edilebilir, bununla birlikte, yeni bir çalışma çözeltisinin hazırlanması önerilir. </li><li> 1 ml taze hücre kültürü ortamı (yükleme çözeltisi) çalışma çözeltisinin 2 ul ekleyin. </li><li> Yükleme çözümü ile hücre kültür ortamı değiştirerek hücreleri yükleyin. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ve nemlendirilmiş bir atmosfer (kuluçka makinesinde) 15 dakika için kuluçkalayın. Dikkat: Hemen hemen tüm floresan göstergeleri zamanla canlı hücreler tarafından ihraç edilmektedir; Bu nedenle, uzun süreli yükleme veya gecikmeli analizi kaçının. </li><li> Yıkama olmadan canlı hücre görüntüleme için uygun olan bir mikroskop altında çanak yerleştirin. Önemli: floresan göstergeleri, bu nedenle, gereksiz ışık maruziyeti önlemek, ışığa karşı oldukça duyarlıdır. </li><li> Farklı görüntüler arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak iktisap parametrelerini değiştirmeden görüntüleri edinin. </li></ol>

<ol><li>Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%2C+vasculogenesis%2C+and+induction+of+healing+in+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds.</a> Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).</li>
<li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research.+Europaische+Chirurgische+Forschung.+Recherches+Chirurgicales+Europeennes%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).</li>
<li>Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation.+1%3A+Its+role+in+the+healing+of+acute+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds.</a> Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).</li>
<li>Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((endothelial+progenitor+cell+mobilization%2C+and+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).</li>
<li>Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperbaric+oxygen+and+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+in+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.</a> Vascular. 14, 328-337 (2006).</li>
<li>Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+toxicology+of+sulfur+mustard-induced+cutaneous+inflammation+and+blistering%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering.</a> Toxicology. 263, 12-19 (2009).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+mustard+%28Chlorambucil%29+has+a+negative+influence+on+early+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development.</a> Toxicology. 263, 32-40 (2009).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-acetyl+cysteine+and+alpha-linolenic+acid+on+sulfur+mustard+caused+impairment+of+in+vitro+endothelial+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation.</a> Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorambucil+%28nitrogen+mustard%29+induced+impairment+of+early+vascular+endothelial+cell+migration+-+Effects+of+alpha-linolenic+acid+and+N-acetylcysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine.</a> Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+endostatin+on+embryonic+vasculo-+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics+%3A+an+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).</li>
<li>Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cell+separations%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).</li>
<li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+substrates+for+human+umbilical+vein+endothelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry+%3A+Official+Publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture.</a> Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> BioTechniques. 50, 98-115 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Zehirli kimyasallara dermal maruziyet sık sık şiddetli yara iyileşmesi bozukluğu ile sonuçlanır. altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Yara iyileşmesi farklı aşamalardan (hemostaz, inflamasyon, proliferasyon ve yeniden şekillenme) oluşan karmaşık bir süreçtir. Hücre göçü, ancak, bu granülasyon dokusunun oluşması için büyük önem taşımaktadır, her aşamada yer almaktadır. Burada, yeni kan damarlarının anjiyo- veya vaskülojenez yoluyla oluşturulur. Hem süreçler habercisi ve erke...

Hücre göçü deri hasarı sonrasında gelişme, çeşitli hastalıklar ve yara iyileşmesi dahil olmak üzere, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerde önemlidir. Cilt hasarı takiben iltihap hasarlı veya nekrotik doku ve granülasyon sürücüleri ön yara kapanması kaldırır ve vaskülojenez yoluyla yeni kılcal bir ağ oluşumunu (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut veziküllerin filizlenme) 1-3 verir. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin göçünü gerektirir. kan damarlarının artan ağ nihai olarak keratinizasyon tabi keratinositlerin çoğalan oksijen ve besin taşımak için gerekli olan, yeni bir epitel oluşturur ve yara kapanmasını sağlar. Endotel hücrelerinin Engelliler göç bozukluğu 4,5 yara iyileşmesi altta yatan nedenidir. Erken endotelyal hücrelerin Dolayısıyla, yöntem değerlendirmek için geçiş pathophysiol keşfetmek için gerekli olanhücre göçü bozukluklarının ogy ve terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek için. Alkile edici maddeler (örneğin, kükürt ve azot hardalları) dermal maruz bozukluğu 6 yara iyileşme neden olur. Bu tür bileşikler nedeniyle siyasi istikrarsız bölgeler ve nispeten basit sentez mevcut stokları güçlü endişe nedeni, 20. yüzyılda çeşitli çatışmalarda kimyasal savaş maddeleri olarak kullanılan ve devam edildi. Sülfür, hardal, ilk 1822 sentezlendi rağmen, SM maruz moleküler ve klinik patoloji detaylı olarak anlaşılamamıştır SM maruz kalma bir antidot saptanmıştır. Pek çok çalışma, anlamak ve SM maruz kaldıktan sonra bozuk yara iyileşmesi model ve bu etki ayırma yeteneğine potansiyel aday bileşikler test etmek için gerçekleştirilmiştir. Schmidt ve ark. (2009), klorambusil etkisini MM SM benzer özelliklere sahip bir alkilleme bileşiği testse embriyoid vücut modelleri ve damar oluşumunda 7 dramatik, bazen% 99&#39;dan fazla azalma bulundu. Bu olumsuz etki, en, fizyolojik koşullar altında, proliferasyon ve vasküler endotel öncü hücrelerin göç hakim olduğu bir gelişme aşamasında belirgindir. Bu nedenle, bu hücreler, alkile edici maddeler, özellikle duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Steinritz ve ark., (2010), fare embriyoit vücut modellerinde ve özellikle SM toksisitesini azaltmak için yetenekleri açısından özellikle, N-asetilsistein (NAC), ve alfa linolenik asit (ALA), reaktif oksijen türlerinin (ROS), temizleyicileridir test damar oluşumunu 8 geri yükleme. Geçici koruyucu etkilerinin aşırı ROS oluşumu yara iyileşmesi üzerine SM olumsuz etkilerine katkıda muhtemel olduğunu belirten gözlendi. Bu etkiler kalıcı değildir ve iki aday bileşikler, uzun vadede 8 damar oluşumu ve yara iyileşmesini geri yeteneğine sahip olmayabilir. However, bu deneyler, hücre göçü soruşturma izin vermedi karmaşık bir 3D modelinde yürütülmüştür. Böylece, sonradan damar oluşumu 9 sürecinde önemli bir role sahip EEC hücre göçü üzerindeki yararlı etkileri NAC ve ALA test edilmiştir. Ayrıca, hücre kutup hücre göçü için gerekli olduğunu kanıtlar vardır. ROS oluşumuna yol açan Mitokondriyal işlev bozukluğu, hücre polarite bozduğu gösterilmiştir ve bu nedenle olumsuz hücre göçü etkileyebilir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyon açısından canlı hücre görüntüleme uygulandı ve ROS temizleyicilerin etkileri incelenmiştir. Aşağıdaki protokol EEC, Boyden odasının deneyi, hücre izleme analizleri ayrıntılı olarak mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için TMRM kullanımı dahil olmak üzere deney yara iyileşmesi kültivasyonu için genel şartları tarif eder. AET ekimi ve göç için deneysel protokollerin önemli yönleri vurgulanır.

<table><tbody><tr><td>Boyden Odası&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Doku Kültürü (TC) ile muamele edilmiş Uçlar, 24 kuyucuklu - 3 & m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Doku Kültürü (TC) ile tedavi edilmiş Uçlar, 24 kuyu - 8 &mikro; m</td><td>Yaşam Bilimleri</td> <td># 351152</td><td></td></tr> <tr><td>(Falcon Insert ile kullanım için 24 kuyulu Tamamlayıcı Plaka (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Yara ve nbsp; iyileşme tahlili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam alt tabaklar</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Mitokondriyal potansiyelin</td><td></td><td></td><td></td>değerlendirilmesi</tr><tr><td>TMRM (tetrametilrodamin metil ester)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Avusturya</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Linolenik asit</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Almanya</td><td>&nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Almanya</td><td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

toksik kimyasalların maruz sonra endotel hücre göç değerlendirilmesi

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

(Kükürt ve azot hardalları gibi alkilleyici kimyasal savaş ajanları dahil) kimyasal maddelere maruz kalma yara iyileşmesi bozukluğu gibi klinik belirtiler bir bolluk neden olur. Yara iyileşmesinin fizyolojik süreç oldukça karmaşıktır. Ya vaskülojenez yoluyla (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut gemilerin filizlenmesi) - granülasyon dokusu oluşumu bir ön yara kapanması ile sonuçlanan ve yeni kılcal kan damarlarının ağını sağlayan bu süreçte önemli bir adımdır. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin fonksiyonel yönelik geçiş gerektirmektedir. Böylece, erken endotel hücre (AET) göç soruşturma potansiyel terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek bozuklukları şifa kimyasal kaynaklı yara patofizyolojisi anlamak ve önemlidir. Biz ajan poz alkilleyici sonra bozulmuş yara iyileşmesi değerlendirildi ve tr için potansiyel aday bileşikler testeatment. Bu protokolde belirtilen tekniklerin bir dizi kullanılabilir. Modifiye Boyden odası kantitatif AET&#39;nin kemokinezinin açıklanmıştır araştırmak. Ayrıca, niteliksel göç değerlendirmek için iz analizi ile birlikte tahlil yara iyileşmesi kullanımı gösterilmiştir. Son olarak, biz rahatsız hücre göçünün altında yatan mekanizmaları belirlemek için mitokondriyal membran potansiyelinin araştırılması için floresan boya TMRM kullanımını göstermek. Aşağıdaki protokol AET soruşturma için adapte edilmiş temel teknikleri anlatılmaktadır.

Alkilleyici ajanlara dermal maruziyet eritem, blister oluşumu ve yara iyileştirici bozukluğu ile ilişkili dermal ülserasyon kışkırtır. Yara iyileşmesi endotel hücrelerinin göçü dayalı anjio ve vaskülogenezis gerektirir. Kantitatif geçiş Boyden odasının deneyinin kullanımı ile değerlendirilebilir. Alkilleyici ajan klorambüsil için AET Şekil 1C maruz gösterildiği gibi hücre migrasyonu 9 önemli bir azalmaya neden olmuştur. Doğrudan 24 saat chlorambucil maruz kaldıktan sonra ROS-çöpçü alfa linole...

Erken endotel hücre (EEC) göçünün araştırılması, bazı hastalıkların patofizyolojisini anlamak ve terapötik müdahale için potansiyel olarak yeni stratejiler belirlemek için önemlidir. Aşağıdaki protokol, EEC'nin araştırılması için uyarlanmış hücre göçünü değerlendirmek için teknikleri açıklamaktadır.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı migrasyon analizleri kullanarak toksik kimyasalların endotel hücre migrasyonu üzerindeki etkisini incelemektir. İlk olarak, bir sonraki deneyde, maruz kalan endotel hücrelerin kemokineziyi incelemek için modifiye edilmiş bir kaçınma odası (avoidant chamber) analizinin kullanımı gösterilmektedir. Hücre migrasyonu dinamikleri hakkında ek derinlemesine bilgi sağlamak amacıyla, bir yara iyileşmesi (wound healing) analizi hücre takibi ile birleştirilmiştir.Son analizde, bozulmuş endotel hücre göçünün altında yatan mekanizmaları belirlemek amacıyla mitokondriyal membran potansiyelinin incelenmesi gösterilmektedir. Nihayetinde, bu göç analizleri, yüksek derecede toksik alkilleyici ajanların mitokondriyal membran potansiyeli ve endotel hücre göçü üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yöntemler, yüksek derecede toksik kimyasalların neden olduğu yara iyileşmesi bozuklukları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; prosedürler laboratuvarımdaki teknisyenler Ramat, Voer ve Stefan Miller tarafından gösterilecektir. Hücre kültürü flasklarını hazırlamak için, steril bir hücre kültürü flaskının tabanını yeni kaplayacak miktarda taze hazırlanmış jelatin ekleyerek başlayın.Balonu en az 30 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ardından kalan jelatin çözeltisini uzaklaştırın ve hücreler sub-konfluense ulaştığında, embriyonik kök hücre türevli erken endotel hücrelerini veya EEC'leri, hücreleri %80 konfluense kadar kültüre etmek için yeterli miktarda besiyeri ile aktarın. Besiyerini uzaklaştırın, hücreleri PBS ile durulayın ve 25 cm² başına bir mililitre Accutane içerisinde iki ila 10 dakika boyunca inkübe edin.Hücreler ayrıldığında, Boyden odacığı deneyi ile endotel hücre migrasyon analizi yapmak için onları taze besiyerinde bir beşe oranında bölün. Filtre insertlerini, taze hazırlanmış 0,1% jelatinin 500 microliters hacmi ile ön kaplamaya tabi tutun. EEC'ler az önce gösterildiği gibi toplandıktan sonra, hücreleri sayın ve Boyden odacığının alt bölmelerine 500 microliters hücre kültür besiyeri ekleyin.Ardından, her bir filtreye 500 µL besiyeri içerisinde tam olarak 1 × 10⁴ EEC ekleyin. Daha sonra, varsa hava kabarcıklarını giderip Boyden odasını tam sekiz saat boyunca inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, filtreleri bir kez PBS ile durulayın.Ardından, 20 dakika sonra her iki bölmeye 0.5 milliliters %4 paraformaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin. Filtreleri 0.1 molar PBS ile en az üç kez yıkayın ve membranları skalpel ile kesin. Her bir membranı iki lamel arasına yerleştirmek için DPI ile desteklenmiş montaj medyumu kullanın.Filtrelerin yönüne dikkat ederek not alın. Ardından, yalnızca alt bölmeye göç etmiş hücreleri saymak için 400 x büyütmede bir floresan mikroskop kullanın. Gözeneklerin göç eden hücrelerle karıştırılmamasına özen gösterin.Yara iyileşmesi deneyini başlatmak için, steril bir 10 µL pipet ucunu kültür yüzeyinde kabın bir tarafından diğerine doğru pürüzsüz ve düz bir hat boyunca nazikçe iterek, %80 konfluense ulaşmış EEC kültür kabındaki hücreleri manuel olarak kaldırın. Ayrılan hücreleri uzaklaştırmak için plakayı 0.1 M PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, kültür kabına ilgilenilen bileşik ile desteklenmiş besiyeri ekleyin.Ardından, kültür kabını hücre kültürü koşulları altında canlı hücre görüntüleme yapabilen bir mikroskoba yerleştirin ve görüntüleme oturumunun sonunda en az 1024 x 1024 çözünürlük kullanarak, 24 saat boyunca 10 dakikalık aralıklarla time-lapse görüntüler elde edin. Hücre takip analizi gerçekleştirmek için, başlangıçta (sıfırıncı saat) ve 24. saatteki boşluk genişliğini ölçmek amacıyla uygun yazılım aracını kullanın. Görüntü dizisini ImageJ'e aktarın ve MT track J ImageJ eklentisini etkinleştirin.Ardından "add" komutunu kullanarak, 24 saatlik görüntüleme süresi boyunca hücrelerin hareketlerini manuel olarak takip etmek için görüş alanından rastgele 10 hücre seçin. Sonuçları görüntülemek için "measure" komutunu kullanın. Daha sonra, ilgili deneysel bileşik ile yapılan işlem sonrası hücrelerin mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmek amacıyla izleri dışa aktarmak için "movie" komutunu kullanın; hücre kültür ortamını, bir mililitre taze hücre kültüründe hazırlanmış iki mikrolitre taze TMRM ile değiştirin.Besiyeri, ardından yıkama yapmadan hemen tabağı mikroskop altına yerleştirin ve farklı gruplar arasındaki karşılaştırılabilirliği sağlamak için görüntüleme parametrelerini değiştirmeden kontrol ve deneysel olarak işlem görmüş hücrelerin görüntülerini elde edin; grafikte gösterildiği üzere, yara iyileşmesi endotel hücrelerinin göçüne bağlı olan anjiyogenez gerektirir. EEC'lerin alkilleştirici ajana maruz kalması sonucunda, Boyden odacığı testi ile ölçüldüğü üzere, Chlorambacil hücre göçünde belirgin bir azalmaya yol açar. 24 saatlik Chlorambacil maruziyetinin hemen ardından reaktif oksijen türleri veya ROS süpürücü alfa-linolenik asit eklenmesi, fenotipi neredeyse kontrol seviyelerine kadar önemli ölçüde kurtarır.Ancak, Boyden odacığı deneyi, bu temsili yara ve iyileşme deneyindeki hücrelerin göç davranışı hakkında bilgi sağlamamaktadır. Maruz bırakılmamış EEC'ler boşluğu 24 saat içinde kapatabilirken, klorambasil ile işlem görmüş EEC'ler kapatamamıştır. Dahası, münferit EEC'lerin hücre takibi, klorambasile maruz kalan hücrelerin çok az hareket sergilediğini ve bu durumun ROS süpürücü ile yapılan tedavi sonrası düzeldiğini ortaya koymuştur.Aslında, klorambasil maruziyeti sonrası EEC'ler, TMRM ekspresyonu eksikliğiyle örneklendiği üzere mitokondriyal membran potansiyellerinde bir bozulma sergilemektedir. Ancak, EEC'lerin ROS süpürücü ile tedavisi bu mitokondriyal hasarı önleyerek mitokondriyal membran potansiyellerini korumuştur. Bu videoyu izledikten sonra, çizik yaralama deneyi yöntemiyle modifiye edilmiş bir nokta odacık deneyi kullanarak kimyasal olarak bozulmuş endotel hücrelerin migrasyonunun nasıl analiz edileceği ve mitokondriyal membran potansiyellerinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, periventriküler endotel hücrelerinden (PVEC'ler) gelen kemoçekici ipuçlarına yanıt olarak nöronlar arası göçü test etmek için bir yöntem gösterilmektedir. İnternöronlar, her iki tarafta PVEC'ler ve kontrol hücreleri ile merkezi bir bölmeye yerleştirilir. PVEC'lere yönelik artan göç, kemoçekici sinyallerine olumlu bir yanıt olduğunu gösterir.

Periventriküler Endotel Hücrelerinden Kemoçekici İpuçlarına İnternöron Yanıtının Değerlendirilmesi

Biz üropatojenik Escherichia coli ile mesane enfeksiyonu sırasında akut inflamatuar yanıtın önemli bir bileşeni taklit eden bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici maddelere cevap olarak, geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiştir, mesane epiteli üzerinde insan nötrofil göçü kantitatif bir değerlendirmesini sağlar.

Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Bir endotel hücre tek tabakası içindeki gerçek yapışkan hücre sayısının kantitasyonuna izin veren bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Bu protokolde lenfositler, alt odadan gözenekli bir zarla ayrılan bir transmigration sisteminin üst odasına yerleştirilir. Keokin alt hazneye eklenir, bu da bir kemokin gradyan boyunca aktif göçe neden olur. 48 saat sonra, lenfositler transmigration quantitate için her iki odada sayılır.

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Biz üç basit in vitro tahliller-uzun mesafe göç tahlil, co-kültür göç tahlil ve kemo-attraction tahlil-topluca insan kök hücre perisiyitli endotel hücreleri ve bunların işlevlerini değerlendirmek GABAerjik internöronlar ile etkileşim.

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Ekipman yoğun yöntemler kullanılmadan hücre göçünün belirlenmesinde yeni bir yaklaşım sağlayan sıfırdan geçiş testini uygun maliyetli bir yöntem savuruyoruz. Bu protokolde fibroblastlar kullanılırken, ek hücre tipleri ve hücre göçü üzerindeki etkileri incelemek için uyarlanabilir ve kullanılabilir.

Maliyet Etkin ve Uyarlanabilir Çizilme Göçü Tsası

Öğrenin toksik kimyasalların endotel hücre göçü üzerindeki etkilerini değerlendirmek için yara iyileşmesi ve Boyden kamberi analizlerini kullanın. Bu yöntemler hücre dinamikleri ve mitokondriyal membran potansiyeli hakkında bilgi sağlar.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet