Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı migrasyon analizleri kullanarak toksik kimyasalların endotel hücre migrasyonu üzerindeki etkisini incelemektir. İlk olarak, bir sonraki deneyde, maruz kalan endotel hücrelerin kemokineziyi incelemek için modifiye edilmiş bir kaçınma odası (avoidant chamber) analizinin kullanımı gösterilmektedir. Hücre migrasyonu dinamikleri hakkında ek derinlemesine bilgi sağlamak amacıyla, bir yara iyileşmesi (wound healing) analizi hücre takibi ile birleştirilmiştir.

Son analizde, bozulmuş endotel hücre göçünün altında yatan mekanizmaları belirlemek amacıyla mitokondriyal membran potansiyelinin incelenmesi gösterilmektedir. Nihayetinde, bu göç analizleri, yüksek derecede toksik alkilleyici ajanların mitokondriyal membran potansiyeli ve endotel hücre göçü üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yöntemler, yüksek derecede toksik kimyasalların neden olduğu yara iyileşmesi bozuklukları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; prosedürler laboratuvarımdaki teknisyenler Ramat, Voer ve Stefan Miller tarafından gösterilecektir. Hücre kültürü flasklarını hazırlamak için, steril bir hücre kültürü flaskının tabanını yeni kaplayacak miktarda taze hazırlanmış jelatin ekleyerek başlayın.

Balonu en az 30 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ardından kalan jelatin çözeltisini uzaklaştırın ve hücreler sub-konfluense ulaştığında, embriyonik kök hücre türevli erken endotel hücrelerini veya EEC'leri, hücreleri %80 konfluense kadar kültüre etmek için yeterli miktarda besiyeri ile aktarın. Besiyerini uzaklaştırın, hücreleri PBS ile durulayın ve 25 cm² başına bir mililitre Accutane içerisinde iki ila 10 dakika boyunca inkübe edin.

Hücreler ayrıldığında, Boyden odacığı deneyi ile endotel hücre migrasyon analizi yapmak için onları taze besiyerinde bir beşe oranında bölün. Filtre insertlerini, taze hazırlanmış 0,1% jelatinin 500 microliters hacmi ile ön kaplamaya tabi tutun. EEC'ler az önce gösterildiği gibi toplandıktan sonra, hücreleri sayın ve Boyden odacığının alt bölmelerine 500 microliters hücre kültür besiyeri ekleyin.

Ardından, her bir filtreye 500 µL besiyeri içerisinde tam olarak 1 × 10⁴ EEC ekleyin. Daha sonra, varsa hava kabarcıklarını giderip Boyden odasını tam sekiz saat boyunca inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, filtreleri bir kez PBS ile durulayın.

Ardından, 20 dakika sonra her iki bölmeye 0.5 milliliters %4 paraformaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin. Filtreleri 0.1 molar PBS ile en az üç kez yıkayın ve membranları skalpel ile kesin. Her bir membranı iki lamel arasına yerleştirmek için DPI ile desteklenmiş montaj medyumu kullanın.

Filtrelerin yönüne dikkat ederek not alın. Ardından, yalnızca alt bölmeye göç etmiş hücreleri saymak için 400 x büyütmede bir floresan mikroskop kullanın. Gözeneklerin göç eden hücrelerle karıştırılmamasına özen gösterin.

Yara iyileşmesi deneyini başlatmak için, steril bir 10 µL pipet ucunu kültür yüzeyinde kabın bir tarafından diğerine doğru pürüzsüz ve düz bir hat boyunca nazikçe iterek, %80 konfluense ulaşmış EEC kültür kabındaki hücreleri manuel olarak kaldırın. Ayrılan hücreleri uzaklaştırmak için plakayı 0.1 M PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, kültür kabına ilgilenilen bileşik ile desteklenmiş besiyeri ekleyin.

Ardından, kültür kabını hücre kültürü koşulları altında canlı hücre görüntüleme yapabilen bir mikroskoba yerleştirin ve görüntüleme oturumunun sonunda en az 1024 x 1024 çözünürlük kullanarak, 24 saat boyunca 10 dakikalık aralıklarla time-lapse görüntüler elde edin. Hücre takip analizi gerçekleştirmek için, başlangıçta (sıfırıncı saat) ve 24. saatteki boşluk genişliğini ölçmek amacıyla uygun yazılım aracını kullanın. Görüntü dizisini ImageJ'e aktarın ve MT track J ImageJ eklentisini etkinleştirin.

Ardından "add" komutunu kullanarak, 24 saatlik görüntüleme süresi boyunca hücrelerin hareketlerini manuel olarak takip etmek için görüş alanından rastgele 10 hücre seçin. Sonuçları görüntülemek için "measure" komutunu kullanın. Daha sonra, ilgili deneysel bileşik ile yapılan işlem sonrası hücrelerin mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmek amacıyla izleri dışa aktarmak için "movie" komutunu kullanın; hücre kültür ortamını, bir mililitre taze hücre kültüründe hazırlanmış iki mikrolitre taze TMRM ile değiştirin.

Besiyeri, ardından yıkama yapmadan hemen tabağı mikroskop altına yerleştirin ve farklı gruplar arasındaki karşılaştırılabilirliği sağlamak için görüntüleme parametrelerini değiştirmeden kontrol ve deneysel olarak işlem görmüş hücrelerin görüntülerini elde edin; grafikte gösterildiği üzere, yara iyileşmesi endotel hücrelerinin göçüne bağlı olan anjiyogenez gerektirir. EEC'lerin alkilleştirici ajana maruz kalması sonucunda, Boyden odacığı testi ile ölçüldüğü üzere, Chlorambacil hücre göçünde belirgin bir azalmaya yol açar. 24 saatlik Chlorambacil maruziyetinin hemen ardından reaktif oksijen türleri veya ROS süpürücü alfa-linolenik asit eklenmesi, fenotipi neredeyse kontrol seviyelerine kadar önemli ölçüde kurtarır.

Ancak, Boyden odacığı deneyi, bu temsili yara ve iyileşme deneyindeki hücrelerin göç davranışı hakkında bilgi sağlamamaktadır. Maruz bırakılmamış EEC'ler boşluğu 24 saat içinde kapatabilirken, klorambasil ile işlem görmüş EEC'ler kapatamamıştır. Dahası, münferit EEC'lerin hücre takibi, klorambasile maruz kalan hücrelerin çok az hareket sergilediğini ve bu durumun ROS süpürücü ile yapılan tedavi sonrası düzeldiğini ortaya koymuştur.

Aslında, klorambasil maruziyeti sonrası EEC'ler, TMRM ekspresyonu eksikliğiyle örneklendiği üzere mitokondriyal membran potansiyellerinde bir bozulma sergilemektedir. Ancak, EEC'lerin ROS süpürücü ile tedavisi bu mitokondriyal hasarı önleyerek mitokondriyal membran potansiyellerini korumuştur. Bu videoyu izledikten sonra, çizik yaralama deneyi yöntemiyle modifiye edilmiş bir nokta odacık deneyi kullanarak kimyasal olarak bozulmuş endotel hücrelerin migrasyonunun nasıl analiz edileceği ve mitokondriyal membran potansiyellerinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.