Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücrelerdeki de ubikitinated enzimlerin aktivitesini görselleştirmektir. Bu, hücrelerin yüksek eş akıcılığa kadar kültürlenmesi ve ikinci adım olarak konsantre bir lizat üretimini kolaylaştırmak için hasat edilmesiyle elde edilir. Nazik mekanik lizis, hücrenin sitoplazmasının metabolik bir resmini koruyan bir lizat üretmek için kullanılır.

Daha sonra, enzimler, aktif bölge sistein kalıntısı ile reaksiyona girerek de ubikitin enzimlerini etiketlemek için hemaglutinin türevi problarla inkübe edilir, sonuçlar, Western blotlama ve müteakip kemilüminesan tespitine dayalı olarak birçok de ubikuitin enziminin aktivite profillerini gösterir. Bu tekniğin normal western blotlama gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, kullanıcının birden fazla enzimin aktivitelerini görselleştirmesine izin vermesidir. Bir deneyde, Ali'nin hücre kültürü ortamını hazırlayın, 30 mililitre dobe docos, modifiye eagles ortamı veya DMEM artı% 10 fetal sığır serumunu kültüre 50 mililitrelik konik bir tüpe koyun.

Deney için hücreler, donmuş M 17 veya A hücrelerini sıvı nitrojen deposundan ılık su ile küçük bir behere aktarır. Daha sonra hücreleri 30 mililitre ortam içeren 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Daha sonra, hücre şişesine bir miktar ortam ekleyin ve yeniden askıya alınan hücreleri çözüldükten sonraki beş saniye içinde aktarın.

Bir hücre peleti elde etmek için hücre süspansiyonunu 450 Gs'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından bir T 75 şişesine 20 mililitre ortam ekleyin. Emme kullanarak ortamı hücrelerden çıkarın.

Hücre peletine beş mililitre taze ortam ekleyin ve tekrar askıya alın. Beş mililitre hücre süspansiyonunu T 75 şişesindeki 20 mililitre ortama aktarın ve 37 santigrat derece inkübe edin. Hücreleri hasat etmek için ortamı her üç günde bir değiştirmek.

Hücrelere dokunmamaya dikkat ederek ortamı emme yoluyla çıkarın. Hücreleri beş mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın. Emme kullanarak PBS'yi çıkarın.

Daha sonra, T 75 şişesine üç mililitre tripsin EDTA ekleyin ve üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, şişeye altı mililitre taze ortam ekleyin ve yeniden canlandırın. Hücreleri askıya alın.

Süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 290 Gs'de santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve beş mililitre PBS ekleyin. Beş dakika boyunca 290 Gs'de santrifüjlemeden önce peleti parçalamak için tüpün altına hafifçe vurun. PBS yıkamasını üç kez tekrarladıktan sonra, eski PBS'yi çıkarın ve hücreleri bir mililitre taze PBS'de yeniden süspanse edin.

Daha sonra hücreleri bir einor tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 290 GS'de döndürün. Hücre lizizini gerçekleştirmek için, bir pipet kullanarak peletin yaklaşık hacmini ölçün ve cam boncukları ve bire bir kütle / hacim oranını tartın. Peletin hacminin iki katı kadar pelete lizis tamponu ekleyin.

Daha sonra cam boncukları pelete ekleyin ve lizize edin. Einor tüpündeki hücreleri, soğuk bir odada girdap yaparak dört santigrat derecede 30 dakika boyunca maksimum çalkalama ile tamponlayın. 200 GS'de 30 saniye boyunca kısa bir süre santrifüjleyin.

Boncukları yerleştirmek ve süpernatanı toplamak için. Süpernatant girdabına daha önce olduğu gibi aynı hacimde cam boncuk ekleyin, bir kez daha santrifüjden sonra dört santigrat derecede 30 dakika boyunca maksimum çalkalamada, 30 saniye boyunca 200 Gs'de kısa bir süre boyunca. Cam boncukları yerleştirmek için süpernatanı toplayın.

Son olarak 5.030 GS'de beş dakika santrifüjleyin. Çekirdekleri, zarları ve kırılmamış hücreleri çıkarmak için, Cinco nimic acid veya BCA analizi ile gerçekleştirilen doku türevlemesi için hücre lizatı olan süpernatantı toplayın. BCA protein tahlil kiti protokolü tarafından belirtildiği gibi bir chole metrik 96 oyuklu plaka okuyucu kullanarak lizatın protein konsantrasyonunu belirlemek için 96 oyuklu bir plakada.

Protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, deiyonize su kullanarak 20 mikrogram toplam proteine karşılık gelen bir alikotu 50 mikrolitreye getirin. Daha sonra çözeltiye iki mikrolitre 1.35 mikromolar HAUB vinil cep telefonu ekleyin. Sonuç, son reaksiyon karışımında 20 mikrogram lizat ila 50 nano molar probdur.

Bu büyük azı dişi fazlalığındadır. Fonksiyonel de ubiquitin enzimlerinin veya dub'ların etiketlenmesini sağlamak için, çözeltiyi 37 santigrat derecede bir saat inkübe etmeye bırakın. Ardından, çözeltiye laly numune tamponu ekleyin.

52 mikrolitrelik bir reaksiyon hacmi için 26 mikrolitre iki x numune tamponu, 13 mikrolitre dört x numune tamponu veya 8.87 mikrolitre altı x numune tamponu kullanın. Numuneyi 95 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Buz üzerinde serin.

Western blot'u gerçekleştirmek için jeli yüklemeden önce, hazırlanan numunenin 40 mikrolitresi ile 12, kuyu dört ila 20% tris glisin jeli yükleyin. İyon cephesi dibe ulaşana kadar jeli 95 voltta çalıştırın. Ardından, jelin bir poli asma DI florür veya PVDF membranı üzerine bir gece boyunca transferini gerçekleştirin.

Aktar İlk olarak, zarı AMDO siyah lekesinde inkübe edin ve her şeritteki protein miktarını gösteren bir görüntü elde etmek için zarı tarayın. Daha sonra zarı alıkoyun ve bloke etmek için bir saat boyunca PBS'de% 5 sütte inkübe edin. Daha sonra, birincil anti HA antikorundaki zarı, PBS'de% 5 sütte bir ila 10.000 konsantrasyonda, gece boyunca dört santigrat derecede veya oda sıcaklığında dört saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, PBS'de %0,1 ara 20 deterjanla her biri beş dakika boyunca üç yıkama yapın. Daha sonra zarı fare yaban turpu peroksidaz içinde PBS'de% 5 sütte bir ila 10.000 konsantrasyonda en az iki saat inkübe edin. Daha önce olduğu gibi üç yıkama yapın, ardından PBS'de beş dakika boyunca bir yıkama yapın.

Son olarak, zarı bir kemilüminesan tespit reaktifinde 10 dakika inkübe edin ve ışıldayan bir dedektör kullanarak tespit edin. Dedektördeki otomatik pozlama ayarını kullanın. Protein yüklemesi mito siyah boyası kullanılarak kontrol edildi.

Bu kontrol adımı, aktivitedeki farklılıkların, eşit olmayan protein yüklemesinden değil, gerçek hücresel süreçlerden kaynaklanmasını sağlar. Burada gösterilen şeritler, ilk deneyde eşit protein miktarlarının kullanıldığını göstermektedir. İkinci deneyde, farklı hücre hatlarının aktivite profillerinde beklenen farklılıklar nedeniyle eşit olmayan protein miktarları yüklenmiştir.

Bu, M 17 hücresi için bir aktivite profilinin tespit edilmesini sağlamak için yapıldı. Lizatlar, bir sistin inhibitörü olan ve Western blot üzerinde azalmış bir sinyale yol açması gereken etil maide ile inkübe edilir. Membranlar anti HA primer antikor içinde inkübe edildi.

Bir fare atı turp peroksidaz ve daha sonra kemilüminesan görüntüleme kullanılarak tespit edildi. Problar kullanılarak dublajların başarılı bir şekilde etiketlenmesi, zarın her şeridinde bir profil ile sonuçlanır. Farklı moleküler ağırlıklardaki bantların yoğunluğu, dub enziminin aktivite seviyesine karşılık gelir.

Hücre hatları boyunca çeşitli dub'ların aktivite seviyelerindeki farklılıklar, U, CHL, biri gibi benzer proteinler he, a ve M 17 hücrelerinde karşılaştırıldığında belirginleşir. Bu işlemden sonra. Hücre altı fraksiyonlama gibi diğer yöntemler, patolojik süreçlerin zara bağlı organellerdeki ubikitin enzim aktivitesini nasıl etkilediği gibi soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, aktif bölgeye yönlendirilmiş problar kullanarak de ubikitinated enzim aktivitesinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.