Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücrelerdeki deubikitinize enzimlerin aktivitesini görselleştirmektir. Bu işlem, hücrelerin yüksek konfluensle kültüre edilmesi ve ikinci bir adım olarak konsantre bir lizat üretimini kolaylaştırmak için hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. Hücre sitoplazmasının metabolik tablosunu koruyan bir lizat üretmek için nazik mekanik lizis kullanılır.

Ardından, aktif bölge sistein kalıntısı ile reaksiyona girerek deubikvitinasyon enzimlerini etiketlemek amacıyla, enzimler hemaglütinin türevli problarla inkübe edilir; sonuçlar, Western blotting ve ardından gelen kemilüminesans deteksiyonuna dayalı olarak birçok deubikvitinasyon enziminin aktivite profillerini gösterir. Bu tekniğin standart Western blotting gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kullanıcının birden fazla enzimin aktivitelerini görselleştirmesine olanak tanımasıdır. Bir deneyde, kültürlemek için 50 mL'lik konik bir tüpe 30 mL DMEM (modifiye edilmiş Eagle ortamı) artı %10 fetal bovine serum ekleyerek hücre kültürü ortamı hazırlayın.

Deney için kullanılacak hücrelerin transferi için, dondurulmuş M 17 veya he A hücrelerini sıvı azot depolamasından ılık su içeren küçük bir behere aktarın. Ardından hücreleri, 30 mL besiyeri içeren 50 mL'lik konik tüpe transfer edin. Son olarak, hücre flakonuna bir miktar besiyeri ekleyin ve resüspande edilen hücreleri çözme işleminden sonraki beş saniye içinde transfer edin.

Hücre peleti elde etmek için hücre süspansiyonunu 450 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından bir T 75 flask içine 20 mililitre besiyeri ekleyin. Besiyerini hücrelerden vakumla uzaklaştırın.

Hücre peletine beş mililitre taze besiyeri ekleyin ve resüspansiyon yapın. Beş mililitrelik hücre süspansiyonunu T 75 flaskındaki 20 mililitre besiyerine aktarın ve 37 °C'de inkübe edin. Hücreleri hasat edene kadar besiyerini her üç günde bir değiştirin.

Hücrelere dokunmamaya dikkat ederek besiyerini vakumla uzaklaştırın. Hücreleri beş mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın. PBS'yi vakum kullanarak uzaklaştırın.

Ardından, T 75 flask'ına üç mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 37 °C'de üç dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, flask'a altı mililitre taze besiyeri ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin.

Süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 290 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve beş mililitre PBS ekleyin. 290 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjlemeden önce, peleti dağıtmak için tüpün altına hafifçe vurun. PBS yıkamasını üç kez tekrarladıktan sonra, eski PBS'yi uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre taze PBS içinde yeniden süspanse edin.

Ardından hücreleri bir eppendorf tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 290 ×g'de santrifüjleyin. Hücre lizini gerçekleştirmek için, pelletin yaklaşık hacmini bir pipet yardımıyla ölçün ve kütle-hacim oranı bir-bir olacak şekilde cam boncuk tartın. Pellete, pellet hacminin iki katı kadar lizis tamponu ekleyin.

Ardından cam boncukları pelete ekleyin ve lizis tamponu ile hücreleri bir eppendorf tüpü içerisinde, soğuk oda ortamında, maksimum çalkalama hızında 30 dakika boyunca 4 °C'de vorteksleyerek lizleyin. 200 ×g hızında 30 saniye boyunca kısa süreli santrifüjleyin.

Boncukların çökmesini sağlamak ve süpernatantı toplamak için; daha önce kullanılanla aynı hacimde cam boncuğu süpernatanta ekleyin, 200 G'de 30 saniye boyunca kısa süreli santrifüjlemeden sonra dört derece santigrat sıcaklıkta, maksimum karıştırmada bir kez daha 30 dakika boyunca vorteksleyin. Cam boncukların çökmesini sağlamak için süpernatantı toplayın.

Son olarak 5.030 GS'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Çekirdekleri, membranları ve parçalanmamış hücreleri uzaklaştırmak için, sinkonik asit ile gerçekleştirilen doku derivatizasyonu veya BCA analizi için hücre lizatı olan süpernatantı toplayın. BCA protein analiz kiti protokolünde belirtildiği üzere, kolrimetrik 96 kuyucuklu plaka okuyucu kullanarak lizatın protein konsantrasyonunu belirlemek için 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın.

Protein konsantrasyonu belirlendikten sonra, 20 µg toplam proteine karşılık gelen bir alikotu, deiyonize su kullanarak 50 µL'ye tamamlayın. Ardından, çözeltiye 2 µL 1,35 µM HAUB vinyl cell phone ekleyin. Sonuç olarak, nihai reaksiyon karışımında 50 nM proba karşı 20 µg lizat elde edilir.

Bu, büyük bir molar fazlalıktadır. Fonksiyonel deubikitin enzimlerinin veya dub'ların etiketlenmesini sağlamak için çözeltiyi 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, çözeltiye Laemmli örnek tamponu ekleyin.

52 µL reaksiyon hacmi için 26 µL 2x örnek tamponu, 13 µL 4x örnek tamponu veya 8,87 µL 6x örnek tamponu kullanın. Örneği 95 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Buz üzerinde soğutun.

Western blot işlemini gerçekleştirmek için jeli yüklemeden önce, 12 kuyucuklu %4-20 tris-glisin jelini hazırlanan örnekten 40 µL ile yükleyin. İyon önü tabana ulaşana kadar jeli 95 volt değerinde çalıştırın. Ardından, jelin bir polivinilidiflorür veya PVDF membrana gecelik transferini gerçekleştirin.

Öncelikle, membranı AMDO siyah boyasında inkübe edin ve her şeritteki protein miktarını gösteren bir görüntü elde etmek için membranı tarayın. Ardından membranı yıkayın ve bloklama için %5 süt içeren PBS içinde bir saat boyunca inkübe edin. Sonrasında membranı, %5 süt içeren PBS içinde 1:10.000 konsantrasyondaki primer anti-HA antikoru ile ya 4 °C'de gece boyunca ya da oda sıcaklığında dört saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, %0,1 tween 20 deterjan içeren PBS ile beşer dakikalık üç yıkama gerçekleştirin. Ardından membranı, PBS içindeki %5 sütte 1/10.000 konsantrasyonundaki fare yaban turp peroksidazı ile en az iki saat boyunca inkübe edin. Daha önce olduğu gibi üç yıkama yapın ve ardından PBS ile beş dakikalık bir yıkama gerçekleştirin.

Son olarak, membranı 10 dakika boyunca kemilüminesans tespit reaktifi içerisinde inkübe edin ve lüminesans dedektörü kullanarak tespit işlemini gerçekleştirin. Dedektörde otomatik pozlama ayarını kullanın. Protein yüklemesi, AM mito black boyama ile kontrol edilmiştir.

Bu kontrol adımı, aktivitedeki farklılıkların eşit olmayan protein yüklemesinden değil, gerçek hücresel süreçlerden kaynaklandığından emin olmayı sağlar. Burada gösterilen şeritler, ilk deneyde eşit protein miktarlarının kullanıldığını göstermektedir. İkinci deneyde ise, farklı hücre hatlarının aktivite profillerindeki beklenen farklılıklar nedeniyle eşit olmayan protein miktarları yüklenmiştir.

Bu işlem, M 17 hücresi için bir aktivite profilinin tespit edildiğinden emin olmak amacıyla yapılmıştır. Lizatlar, bir sistin inhibitörü olan ve Western blot üzerinde sinyalin azalmasına yol açması gereken etil maide ile inkübe edilmiştir. Membranlar, anti HA primer antikoru ile inkübe edilmiştir.

Fare horseradish peroksidazı ile işaretlenmiş ve ardından kemilüminesans görüntüleme kullanılarak tespit edilmiştir. Problar kullanılarak dub'ların başarılı şekilde etiketlenmesi, membranın her şeridinde bir profil oluşmasıyla sonuçlanır. Farklı moleküler ağırlıklardaki bantların yoğunluğu, dub enziminin aktivite seviyesine karşılık gelir.

Çeşitli dub'lerin hücre hatları arasındaki aktivite seviyelerindeki farklılıklar, HeLa ve M17 hücrelerinde U CHL1 gibi benzer proteinler karşılaştırıldığında belirgin hale gelir. Bu prosedürden sonra, patolojik süreçlerin membranla çevrili organellerdeki ubiquitin enzim aktivitesini nasıl etkilediği gibi soruları yanıtlamak amacıyla subselüler fraksiyonal gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, aktif bölge yönelimli problar kullanarak deubikitine enzim aktivitesinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.