Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, konakçı bağışıklık yanıtının canlı ve non-invaziv görüntülemesi için zebrafish larvalarına bakteriyel bir patojen olan streptococcus IEA mikroenjeksiyonu yapmaktır. Bu işlem, öncelikle mikroenjeksiyon iğnesinin bakteriyel süspansiyonla doldurulması ve anestezi uygulanmış zebrafish larvalarının agaroz enjeksiyon kalıbına dizilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, bakteriyel süspansiyon larvaların otik vezikülüne mikroenjekte edilir.

Ardından, enjeksiyon yapılan larvalar düşük erime noktalı agaroz içine yerleştirilir. Son olarak, kolay takip için konakçı bağışıklık hücreleri foton işaretlenir ve enfeksiyon konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenir. Nihayetinde, otik veziküle streptococcus IEA mikroenjeksiyonu ve ardından gelen foton işaretleme ile konfokal mikroskopi, zebrafish larvalarının konakçı bağışıklık yanıtını incelemek için kullanılır.

Bu tekniğin kodal ven enjeksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, otik vezikül enjeksiyonunun, şeffaf zebra balığı larvasındaki konakçı-patojen etkileşimlerinin non-invaziv görüntülenmesine olanak tanıyan lokalize bir bakteriyel enfeksiyon oluşturmasıdır. Başlamak için E3 ortamında %1,5 ila %2'lik yüksek erime noktalı agar çözeltisi hazırlayın ve çözelti berraklaşana kadar mikrodalga fırında ısıtın. Soğuduktan sonra, agar çözeltisinin bir kısmını bir Petri kabına, kabın tabanını kaplayacak kadar ekleyin ve dairesel hareketlerle yayın.

Aros katılaştıktan sonra, katı ucu Petri kabının üst kısmına dayanacak ve çentikli ucu aros'a değecek şekilde durulanmış ve kurulanmış bir jel tarağını üzerine yerleştirin. Tarağın mümkün olduğunca yatay olduğundan ve alt aros tabakasına göre 30 derecelik bir açı oluşturduğundan emin olun. Tarak ile alt aros tabakası arasındaki ara yüze, taze aros tabakasının tarağın kuyucuklarını kaplayacağı şekilde küçük bir miktar daha aros dökün.

Tarağı çıkarmadan önce tamamen soğumasını bekleyin. Ardından, bir pipet ucu kullanarak kuyucuklardaki taşan agar parçalarını temizleyin. Enjeksiyon kalıbının üzerine E three besiyeri dökün ve dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın.

Metin protokolüne uygun olarak SNEA inokülumu ve zebrafish larvaları enjeksiyonlar için hazırlandıktan sonra, mikro enjektörü açın ve zaman aralığını milisaniye cinsinden ayarlayın. Gazın hatta girmesini sağlamak için karbondioksit tankındaki vanayı açın. Mikro enjektörün basıncı yaklaşık 20 PSI olmalıdır; fenol kırmızısı ve PBS içindeki hazırlanmış SNEA kültürünü vorteksleyin ve bir mikro yükleyici uç kullanarak kültürden iki ila üç µL'yi çekilmiş bir kapiler enjeksiyon iğnesine yükleyin. Yüklü iğneyi manyetik bir standa bağlı bir mikro manipülatöre yerleştirin ve iğne, mikroskobun tabanıyla yaklaşık 45 ila 65 derecelik bir açı yapacak şekilde bir stereo mikroskobun altına konumlandırın.

Öncelikle ince uçlu bir cımbız kullanarak iğnenin ucunu kırın, ardından mikro enjektörün ayak pedalına basarak iğnenin ucuna bir damla inokülum bırakın. Damlanın çapını ölçmek için mikroskobun oküler lensindeki ölçek çubuğunu kullanın. Damla çapı yaklaşık 0.10 millimeter olmalıdır, bu da hacim olarak yaklaşık bir nanolitreye tekabül eder.

Damla boyutunu ayarlamak için mikro enjektördeki süre ayarını değiştirin veya iğne ucundan daha fazla kısmı kesmek için ince cımbız kullanın. Aşırı doku hasarını önlemek için enjeksiyon süresi 20 ile 35 milisaniye arasında olmalıdır. Ardından, plastik bir transfer pipeti kullanarak enjeksiyon kalıbının 12 kuyusunun her birine kuyucuk başına bir balık transfer edin.

Ardından bir cam çubuk, saç döngüsü veya plastik uç yardımıyla, larvaların başları mikroskobun arkasına bakacak ve vitellüs keseleri kuyucuğun sol tarafına yaslanacak şekilde nazikçe konumlandırın. Larvaların sol kulağını tavana doğru yöneltin. Larvalar enjeksiyona hazır olduğunda, yüklü iğneyi otik vezikül ile aynı görüş alanına getirmek için mikromanipülatör üzerindeki düğmeleri kullanın.

İğne ucuyla, uç tam olarak vezikülün içinde kalacak şekilde otik vezikülün dış epitel tabakasını delin. Şimdi, boşluğun yırtılmasına neden olmayacak kadar düşük bir basınç kullanarak, istenen dozda 1 nanoliter SNEA enjekte etmek için ayak pedalına basın. Enjeksiyon başarılı olursa, çevre doku değil, sadece otik vezikül fenol kırmızısı inokulumu ile dolmalıdır.

İğneyi larvalardan dikkatlice geri çekin ve beş kat büyütme altında, larva görüş alanına girene kadar enjeksiyon plakasını elinizle hareket ettirin. Floresan mikroskop altında floresan işaretli bakteriler enjekte ediyorsanız, enjekte edilen larvaları görsel olarak tarayın ve deney süresince enjeksiyon hacminin aynı kalmasını sağlamak için sadece bakteri birikiminin otik vezikül içinde gerçekleştiği larvaları ayırın. Her 48 embriyoda bir, 100 µL steril PBS içeren 1,7 mL'lik bir santrifüj tüpüne bir damla bakteri süspansiyonu enjekte edin.

Ardından 100 µL'yi THY artı P auger plaklarına ekleyin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Enjeksiyon hacmindeki CFU'yu belirlemek için, enjeksiyon rampasındaki 12 larvadan oluşan tüm grup enjekte edildiğinde, larvaları kuyucuklardan çıkarmak için dikkatlice plastik bir transfer pipeti kullanın ve onları yeni bir Petri kabına yerleştirin. Larvaların toparlanmasını sağlamak için trica çözeltisini uzaklaştırın ve yerine yaklaşık iki mL taze E3 besiyeri ekleyin.

Embriyoları metin protokolüne göre inkübe edin. Metin protokolüne uygun olarak trica ile aros hazırladıktan sonra, stereo mikroskobun tablasında, anestezi uygulanmış dört ila beş larvayı bir cam tabanlı kaba yerleştirmek için bir transfer pipeti kullanın. Trica ve aro çözeltisini 55 °C'lik su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika soğumaya bırakın.

Bu sırada, anestezi altındaki larvalardan mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın. Ardından, yüzeyin yaklaşık yarısı kaplanana kadar soğutulmuş agarı kaba dökün. Sonra, agarı yaymak için kabı dairesel hareketlerle sallayın.

Kabın kenarlarına yüzen larvaları alın ve pipet yardımıyla tekrar merkeze aktarın. Ardından stereo mikroskop altında, görüntüleme için larvaları istediğiniz konuma nazikçe getirmek için uzun bir pipet ucu kullanın. Otik vezikül için larvaları, sağ otik vezikül yukarı bakacak ve sol otik vezikül kabın tabanına düz bir şekilde yaslanacak şekilde konumlandırın.

Kabı taşımadan önce agarın yaklaşık 10 dakika boyunca soğumasını bekleyin. Ardından, agar tabakasını nemli tutmak için üzerine dikkatlice bir miktar trica ve E three çözeltisi pipetleyin. Örnekleri görüntülemek için 488 nanometre ve 543 nanometre lazerlere sahip bir Zack scan kullanın.

Lazer gücünü ve detektör kazancını ayarlamak için sürekli çizgi tarama yöntemini kullanın. Görüntü alma kontrol penceresinde kazara gerçekleşmiş bir fotokonvertlenmiş kırmızı floresan bulunmadığını doğrulayın. Stimulus (uyaran) ayarları altında, tarayıcı aracını kullan seçeneğini işaretleyip ana (main) seçeneğini belirleyin, 405 nanometre lazeri seçin ve gücünü %70 olarak ayarlayın.

Ardından daire seçeneğini kullanarak, odic vezikül içindeki ilgi bölgesini tanımlayın; stimulus başlangıç ayarı altında, görüntüleme ayarları penceresinde bir karelik ön aktivasyon ve 60,000 milisaniyelik bir aktivasyon süresi ile seriler halinde aktivasyonu seçin. Zaman taraması başlığı altında, biri fotokonversiyon öncesi diğeri ise sonrası için birer dakikalık iki aralık seçin. Tanımlanan ilgi bölgesinin fotokonversiyonunu başlatmak için zaman atlamalı seriyi başlatın.

Son olarak, örneği Zack ve 488 ile 543 nanometre lazerleri kullanarak tarayın. Fotokonvert edilmiş kırmızı floresansı ve kalan herhangi bir yeşil floresansı görselleştirmek için, fenol kırmızısı içindeki SNEA'nın otik veziküle mikroenjeksiyonu, başlangıçta lokalize bir konak yanıtına yol açar; doğru enjekte edildiğinde bu yanıt yalnızca otik vezikülde görülmeli, çevre dokuda veya kanda görülmemelidir. Alternatif olarak, işaretli bakteriler enjekte edilirse, enjeksiyondan hemen sonra enfekte larvaların hızlıca taranması, bakterilerin yalnızca otik vezikülde olduğunu ve çevre dokuda olmadığını doğrulayabilir.

Burada gösterildiği gibi, başlangıçta lokalize edilen enfeksiyonun mikroenjeksiyon bölgeleri, lökosit kemotaksisini incelemek için kullanışlıdır. Lökosit göçü, nötrofil granüllerinin Sudan siyahı ile boyanmasıyla veya yeşil floresan protein ifade eden transgenik zebra balığı hatları kullanılarak floresan transgenik hatların formaldehit ile fikse edilmesiyle nicelendirilebilir. Özellikle makrofajlarda veya nötrofillerde Dendra 2 kullanımı, otik veziküle NEA enjeksiyonunun, enfeksiyon sonrası 60 dakika içinde nötrofillerin ve makrofajların göçünü ve bakterilerin fagositozunu tetiklediğini ortaya koymuştur.

Bu şekilde, enfeksiyondan beş saat sonra otik veziküle göç eden DRA ile işaretlenmiş iki makrofaj fotokonverte edilmiş ve ardından sonraki 24 saat boyunca takip edilmiştir. Bazı fotokonverte hücreler otik vezikülde veya baş bölgesinde kalmış olsa da, burada görüldüğü üzere bazılarının larva vücuduna dağıldığı da saptanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, döllenmeden sonra üç günlük zebra balıklarının otik vezikülüne streptococcus n EEA mikroenjeksiyonunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Bu süreç; birincisi, anestezi uygulanmış larvaların enjeksiyon kalıbına hizalanması ve iğnenin bakteriyel inokülum ile doldurulması; ikincisi, otik veziküle mikroenjeksiyon yoluyla bakteri verilmesi; üçüncüsü, enfekte larvaların düşük erime noktalı agar üzerine yerleştirilmesi ve dördüncüsü, konfokal mikroskop kullanılarak konak lökositlerinin foto-etiketlenmesi ve lökosit-patojen etkileşimlerinin in vivo olarak görüntülenmesini içerir.