Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme Streptococcus iniae Enfeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, konakçı bağışıklık tepkisinin canlı non-invaziv görüntülenmesi için zebra balığı larvalarına bakteriyel bir patojen olan streptococcus IEA ile mikro enjekte etmektir. Bu, önce mikroenjeksiyon iğnesinin bir bakteri süspansiyonu ile yüklenmesi ve anestezi uygulanmış zebra balığı larvalarının agaroz enjeksiyon kalıbı üzerine dizilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, bakteri süspansiyonu larvaların otik vezikülüne mikro enjekte edilir.

Daha sonra enjekte edilen larva düşük eriyik agaroza monte edilir. Gus nihayet konakçı bağışıklık hücreleri, kolay izleme için fotoğrafla etiketlenir ve enfeksiyon, konfokal bir mikroskop kullanılarak görüntülenir. Sonuç olarak, streptokok IEA'nın otik veziküle mikro enjeksiyonu ve ardından foto etiketleme ve konfokal mikroskopi, zebra balığı larvalarının konakçı bağışıklık tepkisini incelemek için kullanılır.

Bu tekniğin kordeon ven enjeksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, otik vezikül enjeksiyonunun, şeffaf zebra balığı larvasındaki konakçı patojen etkileşimlerinin invaziv olmayan görüntülenmesine izin vermek için lokalize bir bakteriyel enfeksiyon oluşturmasıdır. Başlamak için, çözelti berraklaşana kadar E üç orta ve mikrodalgada %1,5 ila 2 oranında yüksek eriyik aro çözeltisi hazırlayın. Soğuduktan sonra, aroların bir kısmını bir Petri kabına dökün, tabağın altını kaplayacak ve girdap oluşturacak kadar ekleyin.

Aros katılaştıktan sonra, üzerine durulanmış ve kurutulmuş bir jel tarak yerleştirin, böylece katı uç Petri kabının üstünde durur ve çentikli uç arolara temas eder. Tarağın mümkün olduğunca yatay olduğundan ve alt aros katmanına göre 30 derecelik bir açı oluşturduğundan emin olun. Tarak ve alt aros tabakası arasındaki arayüze az miktarda aros dökün, böylece taze aros tabakası tarağın kuyularını kaplar.

Tarağı çıkarmadan önce tamamen soğumasını bekleyin. Daha sonra bir pipet ucu kullanarak, sarkan aros parçalarını kuyucuklardan çıkarın. Enjeksiyon kalıbının üzerine E üç orta dökün ve dört santigrat derecede saklayın.

SNEA aşısını ve zebra balığı larvalarını metin protokolüne göre enjeksiyonlar için hazırladıktan sonra, mikro enjektörü açın ve zaman aralığını milisaniye olarak ayarlayın. Gazın hatta girmesine izin vermek için karbondioksit tankındaki vanayı açın. Mikro enjektörün basıncı, fenol kırmızısı ve PBS'de hazırlanan SNEA kültürünü yaklaşık 20 PSI vorteks okumalı ve kültürün iki ila üç mikrolitresini çekilmiş bir kılcal enjeksiyon iğnesine yüklemek için bir mikro yükleyici ucu kullanmalı, yüklenen iğneyi manyetik bir standa bağlı bir mikro manipülatöre monte etmeli ve iğne yaklaşık 45 ila 65 derecelik bir açıda olacak şekilde stereo mikroskop altında konumlandırmalıdır mikroskobun tabanına göre.

Önce bir çift ince cımbız kullanarak iğnenin ucunu kırın, iğnenin ucuna bir damla aşı damlatmak için mikro enjektörün ayak pedalına basın. Damlanın çapını ölçmek için mikroskobun oküler merceğindeki ölçek çubuğunu kullanın. Damlanın çapı yaklaşık 0.10 milimetre olmalıdır, bu da hacim olarak yaklaşık bir nanolitredir.

Damla boyutunu ayarlamak için mikro enjektördeki süre ayarını yapın veya iğne ucunun daha fazlasını kesmek için ince cımbız kullanın. Çok fazla doku hasarını önlemek için enjeksiyon süresi 20 ila 35 milisaniye arasında olmalıdır. Daha sonra, plastik bir transfer pipeti kullanarak, enjeksiyon kalıbının 12 kuyucuğunun her birine oyuk başına bir balık aktarın.

Daha sonra bir cam çubuk, saç halkası veya plastik uç ile larvaları, başları mikroskobun arkasına bakacak ve yumurta sarısı çuvalları kuyunun sol tarafına dayanacak şekilde nazikçe konumlandırın. Larvaların sol kulağını tavana doğru doğrultun. Larvalar enjeksiyona hazır olduğunda, her ikisi de aynı görüş alanında olacak şekilde yüklü iğneyi otik vezikül ile hizalamak için mikro manipülatör üzerindeki düğmeleri kullanın.

İğne ucu ile otik vezikülün dış epitel tabakasını, uç vezikülün hemen içinde olacak şekilde delin. Şimdi boşluğu yırtmamak için yeterince düşük bir basınç kullanarak, istenen SNEA dozunun bir nanolitresini enjekte etmek için ayak pedalına basın. Enjeksiyon başarılı olursa, otik vezikül, ancak çevresindeki doku bir fenol kırmızı inokulum ile doldurulmamalıdır.

İğneyi larvalardan dikkatlice geri çekin ve beş x büyütme altında, larvalar görünecek şekilde enjeksiyon plakasını elle hareket ettirin. Floresan işaretli bakterileri floresan mikroskobu altında enjekte ediyorsanız, enjekte edilen larvaları görsel olarak tarayın ve enjeksiyon hacminin deney boyunca aynı kalmasını sağlamak için sadece bakteri birikiminin sadece otik vezikül içinde meydana geldiği yerleri saklayın. Her 48. embriyoyu enjekte ettikten sonra, 100 mikrolitre steril PBS içeren 1.7 mililitrelik bir santrifüj tüpüne bir damla bakteri süspansiyonu enjekte edin.

Daha sonra 100 mikrolitreyi THY plus P burgu plakalarına koyun ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Enjeksiyon hacmindeki CFU'yu belirlemek için, enjeksiyon rampasındaki 12 larvadan oluşan bir grubun tamamı enjekte edildiğinde, larvaları kuyucuklardan çıkarmak ve yeni bir Petri kabına yerleştirmek için dikkatlice plastik bir transfer pipeti kullanın. Trica solüsyonunu çıkarın ve larvaların iyileşmesini sağlamak için yaklaşık iki mililitre taze E üç besiyeri ile değiştirin.

Embriyoları metin protokolüne göre inkübe edin. Trica ile aros hazırladıktan sonra, stereo mikroskop sahnesindeki metin protokolüne göre, dört ila beş anestezi uygulanmış larvayı cam tabanlı bir tabağa yerleştirmek için bir transfer pipeti kullanın. Trica ve aro solüsyonunu 55 santigrat derece su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika soğumaya bırakın.

Bu arada, anestezi uygulanmış larvalardan mümkün olduğunca fazla sıvı alın. Daha sonra, soğutulmuş agrosları, yüzeyin yaklaşık yarısı kaplanana kadar tabağa dökün. Sonra aroları yaymak için tabağı döndürün.

Tabağın kenarlarına doğru yüzen larvaları toplayın ve tekrar merkeze pipetleyin. Daha sonra stereo mikroskop altında, larvaları görüntüleme için istenildiği gibi nazikçe konumlandırmak için uzun bir pipet ucu kullanın. Otik vezikül larvaları, sağ otik vezikül yukarı bakacak ve sol otik vezikül tabağın dibine doğru düz olacak şekilde konumlandırır.

Çanağı hareket ettirmeden önce aroları yaklaşık 10 dakika soğumaya bırakın. Ardından, nemli tutmak için aros tabakasının üzerine hafifçe biraz trica ve E three solüsyonu pipetleyin. Örnekleri görselleştirmek için bir Zack taraması 488 nanometre ve 543 nanometre lazerlerle.

Lazer gücünü ve dedektör kazancını ayarlamak için sürekli çizgi taramayı kullanın. Görüntü alma kontrol penceresinde yanlışlıkla fotoğrafa dönüştürülmüş kırmızı floresan olmadığını doğrulayın. Uyaran ayarı altında, tarayıcı aracını kullan öğesini seçin ve ana'yı seçin, 405 nanometre lazeri seçin ve %70 güce ayarlayın.

Ardından, daire seçeneğini kullanarak, uyaran başlatma ayarı altında odik veziküldeki ilgi bölgesini tanımlayın, bir karenin ön aktivasyonu ve edinme ayar penceresinde 60.000 milisaniyelik bir aktivasyon süresi ile seri olarak aktivasyonu seçin. Zaman taraması başlığı altında, biri fotoğraf öncesi ve diğeri fotoğraf sonrası dönüştürme için olmak üzere, her biri bir dakikalık iki aralık seçin. Tanımlanan ilgi alanının fotoğraf dönüşümünü başlatmak için hızlandırılmış seriyi başlatın.

Son olarak, bir Zack ve 488 ve 543 nanometre lazerler kullanarak numuneyi tarayın. Fotoğrafı görselleştirmek için, dönüştürülen kırmızı floresan ve fenol kırmızısı SNEA'nın otik veziküle kalan yeşil floresan mikroenjeksiyonu, doğru şekilde enjekte edildiğinde sadece otik vezikülde görülmesi gereken, başlangıçta lokalize bir konak yanıtı ile sonuçlanır ve çevredeki dokuda veya kanda değil. Alternatif olarak, etiketli bakteriler enjekte edilirse, enjeksiyondan hemen sonra enfekte olmuş larvaların hızlı bir şekilde taranması, bakterilerin çevreleyen dokuda değil, yalnızca otik sklede olduğunu doğrulayabilir.

Başlangıçta lokalize enfeksiyonun mikroenjeksiyon bölgeleri, burada gösterildiği gibi lökosit kemotaksisini incelemek için yararlıdır. Lökosit alımı, Sudan, nötrofil granüllerinin siyah boyanması veya yeşil floresan proteini ifade eden transgenik zebra balığı çizgileri kullanılarak floresan transgenik hatların formaldehit fiksasyonu ile ölçülebilir. Dendra iki, özellikle makrofajlarda veya nötrofillerde, NEA'nın otik vezikül içine enjeksiyonunun, enfeksiyondan sonraki 60 dakika içinde nötrofillerin ve makrofajların alımını ve bakteri fagositozunu tetiklediğini ortaya koydu.

Bu şekilde, enfeksiyondan beş saat sonra otik veziküle alınan DRA iki etiketli makrofajlar foto dönüştürüldü ve daha sonra takip eden 24 saat boyunca izlendi. Bazı foto dönüştürülmüş hücreler otik vezikül veya baş bölgesinde kalsa da, bazıları burada görüldüğü gibi larvaların vücuduna yayılmış olarak da bulunmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, döllenmeden üç günlük zebra balığının otik vezikülüne EEA streptokok mikroenjekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu, anestezi uygulanmış larvaların enjeksiyon kalıbı üzerine sıralanmasını ve iğnenin bakteri aşısı ile yüklenmesini içerir. Otik vezikül içine iki mikro enjekte eden bakteri. Üç, enfekte larvaları düşük eriyik aeroslara monte etmek ve dördüncüsü, konakçı lökositleri fotoğraflamak ve lökosit patojen etkileşimlerini in vivo olarak görüntülemek için konfokal bir mikroskop kullanarak.