Name: Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Öğrenin, RAW264.7 makrofaj hücrelerine lusiferaz haberci genleri transfekte etme yöntemini. Bu teknik, hücreleri aktive etmeden gen ekspresyonu çalışmaları için güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) hibesi ile finanse edilmiştir. STC, CIHR ve Michael Smith Vakfı'ndan doktora araştırma ödülüne sahiptir. EYS, CIHR bursuna sahiptir. CIHR Transplantasyon Eğitim Programı ayrıca STC, EYS ve SS'ye lisansüstü burslar sağlamıştır.

1. Plazmid DNA Saflaştırma <ol><li> Üreticinin protokolüne göre bir maxiprep kiti kullanılarak plazmid DNA ekstrakte edin. TE tamponu, 500 | il yeniden süspanse plazma DNA. </li><li> Kloroform: Bir fenol gerçekleştirin izoamil alkol çıkarma ve izopropanol yağış kalan bakteri kirleri çıkarmak. LPS varlığı transfeksiyon 9 engeller. <ol><li> Plasmid DNA (1, pH 8: 25: 24) ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır izoamil alkol: kloroform: Fenol 500 ul ekle. Fenol Ciddi yanıklara neden olur ve ağır hasar olduğu kadar yanıklar hep hissettim değildir bu yüzden bir anestezik olduğunu. Davlumbaz izoamil çıkarma ve dikkatli kullanın: kloroform: fenol gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı. Oda sıcaklığında, 10 dakika süreyle 13,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde, üst sulu faz 350 ul aktarın. </li><li> Alt organik faz içeren tüp TE tamponu, 350 ul ekle. 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Aynı 1.5 ml toplama tüpüne üst sulu faz 350 ul aktarın. </li><li> 3 M sodyum asetat (pH 5.2), 70 ul ilave edin ve iyice karıştırın. % 100 izopropanol, 700 ul ekle. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. 10 minat 4 ° C için 13.000 xg&#39;de Santrifüj. Süpernatantı. </li><li> Pelet% 75 etanol içinde 500 ul ekle. Vorteks örnekler 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 5,000 x g de karıştırılır ve santrifüjlenir için. Süpernatantı. DNA pelet olduğunu. </li><li> Tüpün kapağını açın ve hava 5 RT&#39;de pelet kurulayın - 10 dk. Pelet saydam hale gelmelidir. DNA pelletini TE tamponu, 500 ul ekle. 50 ısı - 10 dakika süreyle 60 ° C&#39;de DNA pelet çözülmesi için. </li><li> 260 nm (A260) ve bir spektrometre ile 280 nm (A280) absorbans ölçün. 50 ng / ul A260 değeri çarpılarak DNA konsantrasyonu hesaplayın. Calculatin DNA&#39;nın kalitesini değerlendirmekg A260 / A280 oranı. 2.0 - yüksek kalite ile DNA 1.8 bir A260 / A280 oranı vermelidir. </li></ol> 2. Hücre Kültürleme ve Tohum <ol><li> DMEM içinde kültür RAW264.7 hücreleri 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde% 9 fetal dana serumu (DMEM /% 9 FCS) ile takviye edilmiştir. Her geçiş sırasında, bir Pasteur pipeti kullanarak sürekli pipetleme hücreleri plakadan ayırın. Passage hücreleri 2 günde, 1,5 tohum - stok olarak 10 cm doku kültürü tedavi yemeğin 2 milyon hücre. 6 hafta - hücrelerin her 5 yeni stok çözülme. </li><li> Transfeksiyondan bir gün, DMEM /% 9 FCS 500 ul bir hacim içinde, 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 200,000 hücre tohum. 37 ° C kuluçka makinesi içinde 4 saat inkübe hücreleri. </li><li> Transfect hücreleri ya da lipid bazlı tepkime maddesi (aşama 3.1) ya da protein / poliamin-bazlı tepkime maddesi (aşama 3.2). </li></ol> 3. Transfeksiyon <ol><li> Lipid bazlı transfeksiyon: <ol><li> Transfeksiyon REAGEN Isınmat karanlıkta oda sıcaklığına kadar. Serum-barındırmayan ortam, DMEM /% 9 FCS, 37 ° C&#39;ye kadar ısıtın. </li><li> 1.5 ml bir tüp içinde, serum-içermeyen ortam içinde plasmid DNA, 0.5 ug ila 50 ul ekle. Sıvı yüzeyinin altında pipet ile transfeksiyon reaktifi 2 ul ekle. 6 saniye vorteksleyin. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta reaktif / DNA karışımı bırakın. </li><li> 30 dakika inkübasyon sırasında, kuyudan ortamını çıkarın ve her bir oyuğa taze DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin. </li><li> 30 dakika sonra, reaktif / DNA karışımı, DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. </li><li> Her kuyu seyreltilmiş karışımın 300 ul ekleyin. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde 4 saat - 2 inkübe edin. </li><li> Transfeksiyon çözüm çıkarın ve DMEM /% 9 FCS 500 ul ekleyin. Hücre uyarma önce 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe 48 saat - 24 inkübe edin. </li></ol></li><li> Protein / poliamin bazlı transfeksiyon: <ol><li> Isınma serum serbestorta ve 37 ° C&#39;ye kadar, DMEM /% 9 FCS. </li><li> Serum-barındırmayan ortam 18.75 ul transfeksiyon reaktifi 0.75 ul ekleyin. Vortex kısaca karıştırın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Seyreltilmiş transfekte reaktifi içine 1 ug / ul DNA 0.5 ul ekleyin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 10 dakika inkübasyon sırasında, 24 oyuklu plakanın her bir mesafede ortamını çıkarın ve her bir oyuğa 250 ul taze DMEM /% 9 FCS ekleyin. </li><li> 10 dakika sonra, reaktif / DNA karışımı halinde, DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin. </li><li> Oyuğuna seyreltildi karışımın 270 ul ekle. 4 saat - 2 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe edilir. </li><li> Transfeksiyon çözüm çıkarın ve DMEM /% 9 FCS 500 ul ekleyin. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe 48 saat - 24 inkübe edin. </li></ol></li></ol> 4. Hücre Uyarım ve Lusiferaz Deneyi <ol><li> Taze DMEM /% 9 FCS iyi 250 ul medya değiştirin. </li><li> 50 LPS&#39;nin ul veya LPS + IL eklemeKuyusuna istenilen konsantrasyonlarda -10. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 kuluçka plaka dönün. 6 saat - 2 için uyarır. </li><li> , Aspirasyon yoluyla uyarma çözümü çıkarın buz PBS ile yıkayın ve 1x Pasif Lizis Tampon 200 ul ekleyin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında sallayın. Pençe ve 1.5 ml tüpler lizat transferi ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj uygulanarak hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır. </li><li> Aktarım, üreticinin protokolüne uygun olarak lusiferaz sinyallerin saptanması için beyaz, şeffaf dipli, 96 oyuklu plakaya temizlenir lizat (süpernatant) 40 ul. </li><li> Tüm görünür ışık spektrumu boyunca bir lüminometre ile lusiferaz sinyalini okuyun. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Her kuyudan Renilla lusiferaz değerlere göre ateşböceği lusiferaz bireysel değerleri bölerek Renilla oranı: firefly hesaplayın. </li><li> Tarafından iyi muamele ve Renilla oranı: firefly bölerek katlık değişime hesaplayınmuamele edilmemiş kuyunun bu. </li></ol>

<ol><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).</li>
<li>Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+transient+transfection+of+a+murine+macrophage+cell+line+RAW+264.7%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7.</a> Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).</li>
<li>Kim, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+ingest+and+are+activated+by+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA.</a> Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).</li>
<li>Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+activation+of+the+RAW264.7+macrophage+cell+line+by+transfected+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA.</a> Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).</li>
<li>Jiang, W., Pisetsky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+HMGB1+release+from+RAW+264.7+cells+by+transfected+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA.</a> Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).</li>
<li>Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+inducible+gene+expression+by+signal-dependent+transcriptional+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation.</a> Cell. 138 (1), 129-147 (2009).</li>
<li>Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+inhibits+lipopolysaccharide+induced+miR-155+precursor+stability+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation.</a> PLoS One. 8 (8), e71336(2013).</li>
<li>Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+technical+reports.+Effects+of+lipopolysaccharide+on+transfection+efficiency+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells.</a> Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).</li>
<li>Berghaus, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+primary+murine+macrophage-lineage+cells+and+RAW+264.7+cells+to+ligands+of+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).</li>
<li>Fiszer-Kierzkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+DNA+carriers+may+induce+cellular+stress+response+and+change+gene+expression+pattern+in+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

protokol sadece transfeksiyon verimliliği odaklanmak değil Burada anlatılan, ancak hücrelerin fizyolojik devletlerin verimlilik ve korunması arasında bir denge amaçlamaktadır. Özellikle, bizim prosedür transfeksiyon reaktif toksisitesini en aza indirmek ve lusiferaz sinyali maksimize başarır. Protokolünde bir kritik adım hücrelerinin sağlıktır. Büyümüş kültürler fizyolojik değişiklikleri ve aynı zamanda hücrelerin, 10 fenotip ve işlevini değiştirmek uzun bir süre için RAW264.7 hüc...

Hücrelerdeki nükleik asitlerin transfeksiyonu, bilimsel araştırma, çeşitli uygulama vardır. Örnekler (1) raportör genler, gen ekspresyonunda farklı gen elemanları rolünü incelemek için (2) protein ekspresyon plazmidleri ilgili proteini aşın ifade etmek üzere, (3) küçük bir müdahaleci RNA gen ifadesinin aşağı da içermektedir. Belirli genlerin ekspresyon seviyesi manipüle ve bu manipülasyonlar ayırıcı etkisini ölçerek, araştırmacılar, seçilen biyolojik sistemlerde gen işlevlerini ortaya çıkarabilir. Tüm transfeksiyon yöntemleri, aynı transfeksiyon verimliliği sağlar ve hatta aynı transfeksiyon yöntemi, aynı 1 tüm hücre tiplerinin transfeksiyonu etmez. Bu nedenle, farklı transfeksiyon yöntemleri, kalsiyum fosfat yöntemi, DEAE dekstran, katyonik lipit transfeksiyon, katyonik olmayan lipit polimer, transfeksiyon, elektroporasyon ve nucleofection 2,3 gibi geliştirilmiştir. Makrofajlar içine Transfeksiyon bilhassa olduğunulikle zor dolayı makrofajlar (metıle) DNA 4 türetilen bakteriler de dahil olmak üzere yabancı maddelere karşı çok duyarlıdır profesyonel fagositler olmasından. Yabancı DNA&#39;nın sokulması, sitokinler ve nitrik oksit 5,6 üretimine yol açan Toll-benzeri reseptör 9 (TLR9) yolunun aktive eder. Bu aktive makrofajlar daha sonra araştırmacılar incelemek niyetinde tedaviye daha az duyarlı olabilir. Bizim laboratuvar rutin lusiferaz raportör genleri ile RAW264.7 makrofaj hücre hattı transfects ve biz arka planda önemli ölçüde daha yüksek lusiferaz sinyal yeterince sağlam bir protokol geliştirdi, ancak makrofajlar istirahat durumuna kalması için yeterli de nazik var. Transfekte edilmiş hücrelerin davranışları IκBζ (pGL3- IκBζ) promoter bölgesini barındıran bir ateş böceği lusiferaz raportör geni ile değerlendirildi. IκBζ ekspresyonu, bakteriyel hücre duvarı bileşeni, dudak ile üst-düzenlenmektediropolyssacharide (LPS) 7,8, ve anti-iltihabik sitokin ile baskılanmış, İnterlökin-10 (IL-10) 8. Kuyular arasındaki transfeksiyon varyasyon hesaba katmak için, normalleştirme amacıyla Renilla lusiferaz gen (örn phRL-TK) ihtiva eden bir kontrol plasmidi-transfekte co. Açıklanan protokol DNA plazmid çeşitli transfeksiyon zamanlaması, transfeksiyon reaktifleri tipi, transfeksiyon reaktifleri ve plasmid DNA miktar dahil olmak üzere parametreler, hem de transfeksiyon reaktifi oranı test edildikten sonra optimize edilir. Bu protokolde yer alan iki transfeksiyon reaktifleri (1), bir lipid-bazlı transfeksiyon reaktifi ve (2) bir protein / poliamin bazlı transfeksiyon reaktifi bulunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>PureLink HiPure Plazmid Maxiprep Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>K210007</td><td>Herhangi bir maxiprep kiti çalışacaktır</td></tr><tr><td>Fenol: kloroform: izoamil alkol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15593-049</td><td>Moleküler Biyoloji Sınıfı. Fenol toksiktir, bu nedenle mümkünse çeker ocakta çalışın. Kapta iki kat sıvı oluşuyorsa, alttaki şeffaf organik katmanı kullanın.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30243.01</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu.</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td>56 ° C'de inaktive edildi; Kullanmadan önce 45 dakika su banyosu yapın.</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31985-070</td><td>Kullanmadan önce en az oda sıcaklığına ısıtın.</td></tr><tr><td>XtremeGene HP DBA transfeksiyon reaktifi</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın.</td></tr><tr><td>GeneJuice</td><td>EMD Millipore</td><td>70967</td><td>Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın.</td></tr><tr><td>5x Pasif Lizis Tamponu</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>30 ml, Çift Luciferaz Raportör Test Sistemine dahildir</td></tr><tr><td>Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr></tbody></table>

lusiferaz haberci geni ile raw264.7 hücreleri transfekte

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

İstenilen genetik materyallerin hücrelere transfeksiyonu, biyomedikal araştırma çalışmalarında kaçınılmaz bir prosedürdür. Çok sayıda yöntem tanımlanmış olsa da, bazı hücre türleri bu yöntemlerin çoğuna dirençlidir ve düşük transfeksiyon verimliliği1 verir, bu da bu hücre tiplerinde araştırmayı potansiyel olarak engeller. Bu protokolde, lusiferaz raportör genlerini RAW264.7 makrofaj hücre hattına bir plazmit DNA olarak tanıtmak için optimize edilmiş bir transfeksiyon prosedürü sunuyoruz. İki farklı transfeksiyon reaktifi türü (lipid bazlı ve poliamin bazlı) tanımlanmıştır ve RAW264.7 hücrelerinin transfeksiyon prosedürü ile minimum düzeyde değiştirildiğinden ve elde edilen herhangi bir deneysel verinin deneysel tedavinin doğrudan sonuçları olduğundan emin olmak için protokol boyunca önemli notlar verilmiştir. Transfeksiyon verimliliği diğer transfeksiyon yöntemlerine kıyasla daha yüksek olmasa da, açıklanan prosedür, hücrelerin uyaranlara fizyolojik tepkisini değiştirmeden RAW264.7'deki lusiferaz sinyalini tespit etmek için yeterince sağlamdır.

Şekil 1, RAW264.7 iki transfeksiyon reaktifleri transfeksiyon verimini karşılaştırır. protein / poliamin bazlı transfeksiyon yaklaşık% 5 verim (Şekil 1A) ile sonuçlanırken, lipit bazlı reaktif tipik olarak yaklaşık% 25 transfeksiyon oranı vermiştir. Transfeksiyon etkinliğindeki farklılık pGL3-IκBζ promotör muhabir (Şekil 1B) ile transfekte RAW264.7 hücrelerde lusiferaz sinyaller gözlenmiştir. Bu transfekte edilmiş hücrelere LPS ilave ateşböceği lusiferaz sinyali IκBζ pr...

Makrofaj hücre hattına, RAW264.7'ye transfeksiyon, hücrenin yabancı maddelere karşı doğal tepkisi nedeniyle zordur. Burada, lusiferaz raportör genlerini RAW264.7 hücrelerine transfekte etmek için nazik ama sağlam bir prosedür tanımladık.

Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Bu prosedürün genel amacı, hücreleri aktive etmeden raw 2 6 4 0.7 hücrelerine Lusiferaz rapor konstrüktlerini transfekte etmektir. Bu işlem, öncelikle raw 2 6 4 0.7 hücrelerinin stok plakadan nazik pipetleme ile toplanması ve hücrelerin 24 kuyucuklu doku kültürü işlemine tabi tutulmuş bir plakaya ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, Firefly lusiferaz rapor plazmidi ile kontrol Ren lusiferaz plazmidinin hücrelere birlikte transfekte edilmesidir.Bu plazmidlerin endotoksin içermemesi gerekir. Ardından, hücreler istenen işlemlerle stimüle edilir ve bunu takiben hücre lizizi gerçekleştirilerek şeffaf tabanlı beyaz bir 96 kuyucuklu plakaya aktarılır. Son adım, ateş böceği lusiferaz aktivitesini ölçmek ve ardından ateş böceği/renluc oranını hesaplamak için lusiferaz aktivitesini analiz etmektir.Nihayetinde, uyarılmamış kontrol ile karşılaştırıldığında elde edilen kat değişimi (fold change), uyaranların Lucifer reporter üzerindeki etkisini göstermek için kullanılır ve bu durum, ilgilenilen genin ekspresyon düzeyi ile koreledir. Bu tekniğin geleneksel gece boyu süren transfeksiyona benzer mevcut yöntemlere göre temel avantajı, transfekte edilen hücrelerin hücrelere minimum zarar veril

transfecting-raw2647-cells-with-a-luciferase-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, Promega Çift GloTM Lusiferaz Testi Sistemi kullanılarak bir lusiferaz tabanlı muhabiri gen yaklaşımı ile fagositoz indüklenen gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler...

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

Bu yöntem, Gaussia lusiferaz (GLuc) geni içeren lineerize edilmiş bir plazmidden hem kaplı hem de kaplanmamış mRNA'nın yüksek verimli in vitro sentezini tanımlamaktadır. RNA saflaştırılır ve kaplanmamış RNA'nın bir kısmı Vaccinia virüsü kaplama enzimi kullanılarak enzimatik olarak kaplanır. Son adımda, mRNA HeLa hücrelerine transfekte edilir ve hücre kültürü süpernatantları lusiferaz aktivitesi için analiz edilir.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Bu video, poxvirus ile enfekte olmuş hücrelerde translasyon regülasyonunu incelemek için bir testi göstermektedir. Enfekte olmamış ve virüsle enfekte olmuş hücreler, ateşböceği lusiferaz (Fluc) ve Renilla lusiferaz (Rluc) kodlayan mRNA'larla birlikte transfekte edildi ve Fluc mRNA, 5' Poli(A) lider dizisi içeriyordu. Parçalanmış hücrelere biyolüminesan substratlar ekledikten sonra, lider dizi tarafından verilen virüs ile enfekte olmuş hücrelerde Fluc mRNA'nın translasyonel avantajını belirlemek...

Poxvirus ile Enfekte Hücrelerde Translasyon Regülasyonunu İncelemek İçin Bir Luciferase Reporter Testi

Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

GL261 glioma hücreleri, glioblastomun yararlı bir immünokompetan hayvan modelini sağlar. Bu protokolün amaçları, in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanarak intrakraniyal tümör büyümesini izlemek için uygun teknikleri göstermek ve glioblastom tedavisi için tümör immünolojisi ve immünoterapötik yaklaşımları incelemek için lusiferaz ile modifiye edilmiş GL261 hücrelerinin faydasını doğrulamaktır.

Glioblastoma&#39;nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme

Biz poxvirus enfekte hücreler içinde vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir assay kullanarak mRNA çeviri Yönetmeliği çalışmak için bir protokol sunuyoruz. Tahlil, 5 '-untranslated bölgesi (UTR) ve 3 '-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri Yönetmeliği eğitim için kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak farklı çeviri başlatma modları da incelenebilir.

In vitro transkripsiyonu RNA tabanlı luciferase Reporter assay Poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri Yönetmeliği çalışma

Transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için, çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi kullanarak dizili lentiviral veya retroviral RNAi kitaplıklarını taramak için bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, tek bir deneyde yüzlerce adayı taramak için hızlı ve nispeten ucuz bir yol sunar.

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Burada, sabit memeli hücrelerinde hücre tabanlı görselleştirme, hücre altı lokalizasyonu ve poli(ADP-riboz) (PAR) zenginleştirilmiş odakların nicel analizini tanımlıyoruz. Bu test, genotoksine maruz kalan hücrelerin çekirdeklerinde, baz eksizyon onarımı veya tek zincirli kırılma onarımı ile ilişkili DNA hasarı kaynaklı PARP aktivasyonunun noktalarının nicelendirilmesini sağlar.

Floresan Füzyon Protein Tabanlı Raporlayıcı Kullanılarak Genotoksin Kaynaklı PARP1/PARP2 Aktivasyonunun Hücrelerde Görselleştirmesi ve Nicel Analizi

Öğrenin, RAW264.7 makrofaj hücrelerine lusiferaz haberci genleri transfekte etme yöntemini. Bu teknik, hücreleri aktive etmeden gen ekspresyonu çalışmaları için güvenilir sonuçlar sağlar.

Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

Daha fazla video keşfet