Name: Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim 2 His 2 Çinko-parmak Alanlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Öğrenin, çinko-parmak alanları kullanarak memeli hücrelerine fonksiyonel protein teslimatı için bu protokolü. Plazmid oluşturma, bakterilerde ifade, saflaştırma ve hücre alımı adımlarını keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma ve ShanghaiTech Üniversitesi, Shanghai, Çin (DP1CA174426 Carlos F. Barbas için) (JL) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Moleküler grafik Pymol kullanılarak elde edilmiştir.

1. Klonlama <ol><li> PET-28 ifade vektörü sistemi içine alt-klonlandığında, istek (pET-2F-ZiF) üzerine mevcuttur edilmiştir alanin ile ikame edilmiş, iki parmak ZiF etki elde edilir. 34 </li><li> PCR primerleri ile plazmid zümrüt-pBAD gelen EmGFP amplifiye 5 &#39;Xmal-EmGFP (5&#39;-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3&#39;; kalın olarak Xma I bölgesi) ve 3 &#39;Sacl-EmGFP (5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3&#39; ; kalın Sac sitesi). <ol><li> Şablon DNA 5 ng, 10x polimeraz tamponu 10 ul damıtılmış / iyonu giderilmiş su oluşur 1 Taq DNA polimeraz, 0.2 mM her bir dNTP Birimi (U) ve geri kalan hacim 100 ul çözelti içinde, her bir primerden 0.2 uM kullanın . Siklusları: 5 dakika boyunca 95 ° C; 30 saniye için 95 ° C 30 döngü, 30 saniye için 55 ° C sıcaklıkta ve 1 dk için 72 ° C; 10 dakika boyunca 72 ° C. Jel extracti PCR ürünü saflaştırmakve Abs 260 x 50 ug / ml ölçen bir spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonunu belirlemek. </li></ol></li><li> Özet pET-2F-ZiF ve sınırlama EmGFP kodlayan uç DNA 1 ug başına enzimin 10 u kullanarak 37 ° C &#39;de 3 saat boyunca tavsiye edilen tamponda Xma I ve Sac I enzimleri. Gibi etidyum bromür gibi floresan interkalasyon boya kullanılarak agaroz jel elektroforezi ile DNA görselleştirmek. </li><li> Jel ekstraksiyon kiti ile sindirilmiş DNA arındırın ve ABS 260 x 50 ug / ml ölçen bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu belirlenir. </li><li> Oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca T4 DNA ligazı 1 ünite kullanılarak pET-2F-ZiF 50-100 ng saflaştırılmış EmGFP kodlayan DNA Arter. 1 insert-vektör molar oranı: En iyi sonuç için, 6 kullanarak ligasyon reaksiyonu gerçekleştirmek. </li><li> Buz üzerinde herhangi bir kimyasal uyumlu XL-1 Mavi E. coli hücreleri 50 ul çözülme ve 10-20 ng lige pET-2F-ZiF-EmGFP bölgesinin ile yavaşça karıştırın. </li><li> 3 için buz tutun0 dak. Isı şoku 90 sn için 42 ° C sıcaklıkta karışım ve çalkalanarak 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca katabolik baskı (SOC) ile süper optimal suyu 2 ml hücreler geri kazınılmıştır. </li><li> 50 ug / ml kanamisin içeren bir lizojeni suyu (LB) agar plakası üzerine geri kültür, 100 ul yayıldı ve 37 ° C &#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Bir sonraki gün, Süper Broth (SB), ya da 50 ug / ml kanamisin, 37 ° C&#39;de LB agar plakası ve kültür göre O / N itibaren bir koloni içeren LB kültür 6 ml inoküle. Not: Koloni PCR primerlerini 5 &#39;Xmal-EmGFP ve 3&#39; Sacl-EmGFP kullanılarak miniprep önce pozitif klonları tanımlamak için kullanılabilir. </li><li> Miniprep ile pET-2F-ZiF-EmGFP arındırmak ve T7 promotörü kullanılarak DNA dizilemesi ile teyit plazmid (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;). </li></ol> 2. İfade ve saflaştırma <ol><li> Kimyasal yetkili BL21 E. 50 ul çözülme Buz üzerinde coli hücreleri ve PL pET-2F-ZiF-EmGFP 100 ng ile yavaşça karıştırınasmid. Adımlarda 1.7-1.8 açıklandığı gibi Transform. </li><li> Ertesi gün, tek bir koloni ile 50 ug / ml kanamisin içeren LB ortamında 10 ml aşılamak ve çalkalanarak 37 ° C&#39;de O / N büyür. </li><li> Bir sonraki gün, 50 ug / ml kanamisin,% 0.2 glikoz ve 100 uM ZnCI2 ile takviye edilmiş LB ortamı 1 L O / N kültür 10 ml seyreltik. 0.8, 600 nm (OD 600) de optik bir yoğunluğa kadar çalkalanarak 37 ° C&#39;de kültür büyütün ve 2 mM izopropil-β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ve protein ifadesini teşvik eder. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ile 37 ° C&#39;de büyüme 6 saat, hasat sonrasında, hücreler. Not: İndüksiyon koşulları oldukça değişkendir ve ifade edilen proteinlerin istikrar bağlıdır. 0.8 600 ulaşıldığında bir OD kadar OD 600 her 30 dk izleyin. </li><li> Liziz tamponu, 5 ml (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl içinde hücre pelletini, 100 uM ZnCl2, 1 mM ditiyotreitol (DTT), 1mM MgCl2, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 10 mM imidazol, pH 8.0). Aşağıdaki ayarı ile sonikasyon ile buz üzerinde lizleyin hücreleri: 50% güç çıkışı, / 10 saniye kapalı aralıklarla üzerinde 5 saniye ile 4 dakika işlem süresi. Çözüm aşırı ısınma kaçının. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 25,000 x g&#39;de hücre lizat santrifüj ve yeni bir toplama tüpüne süpernatant aktarın. En iyi sonuçlar için, 4 ° C&#39;de aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Bir sütun dengelenmiş Ni-NTA bulamacın 1 ml kullanıma hazır süpernatanın çalıştırın. Yıkama tamponu, 20 ml (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 100 uM ZnCI2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 30 mM imidazol, pH 8.0) ile reçinenin yıkayın. </li><li> 5 yıkama tampon maddesinin ml&#39;si (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCI, 100 uM ZnCI2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 300 mM imidazol, pH 8.0) ile proteininin elüt edilmesi. </li><li> Tampon saklama tamponu ile elüt protein (50 mM alışverişiTris-HCI, 500 mM NaCI, 100 uM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 ve% 10 gliserol, pH 8.0) kullanılarak ve imalatçının talimatlarına uygun olarak santrifüj ile bir spin konsantratör kullanılarak en az 40 uM proteinin konsantre edilir. </li><li> BCA veya Bradford deneyi ile protein konsantrasyonu belirleyin. 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 2 ul 2 x SDS-PAGE yükleme boyası, kaynatma ile saflaştırılmış proteinlerin 2 ul karıştırın ve daha sonra% 4 protein saflık (Şekil 2) üzere% 20 Tris-Glisin, SDS-PAGE gidermek. </li></ol> 3. Protein Depolama <ol><li> -80 ° C&#39;de, sıvı azotun ve depoda konsantre protein, flaş dondurma alikosu. EmGFP füzyon proteinleri için, ışıktan proteini korumak için alüminyum folyo ile tüp kapsamaktadır. </li><li> Tekrarlanan donma ve protein çözeltisi çözülme kaçının. Not: ZiF-kaynaşık proteinler en az 1 ay boyunca bu koşullar altında stabildir. Uygunsuz veya&gt; 4 ay depolama yol açabilirProtein yağış veya EmGFP ve photobleaching. </li></ol> 4. Protein İletimi <ol><li> % 10 ihtiva eden Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde HeLa hücrelerini muhafaza (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik-antimikotik% 5 CO2 ile bir tam nemli bir atmosferde 37 ° C &#39;de. Not: Hücreler fazla 30 kat protein iletimi için tavsiye edilmez pasajlandı. </li><li> Ön kaplama, 25 ° C&#39;de 30 dakika ila 60 poli-lisin, 50 mg / ml 500 ul, 24 oyuklu bir plaka. Oyuk başına 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 24 kuyulu bir levha üzerine tohum hücreleri. Hücreler% 80 arasında -90% konfluent sonra tohumlama 24 saat sonra ya da her bir gözden ortamını çıkarın ve önceden ısıtılmış serum içermeyen DMEM içinde 500 ul (SFM) ile yıkayın. </li><li> Her bir oyuğa, SFM, 250 ul ZiF-EmGFP proteininin 2 uM ve 100 uM ZnCl2 ihtiva eden ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. Not: ZiF etki hücrelerine girmek primarily bir enerji-bağımlı bir mekanizma makropinositozlar, 34 ile. Bu nedenle, hücreleri verimli bir protein içselleştirme 37 ° C&#39;de inkübe edilmesi gerekir. </li><li> Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 500 ul ile üç kez hücrelerden Ortamı çıkarın ve yıkama Dulbecco fosfat-tamponlu tuzlu su, heparin, 0.5 mg / ml ile takviye edilmiş (DPBS). Not: Heparin, mansap analizler zorlaştırıyor olabilir yüzey bağlı protein kaldırmak için gereklidir. </li><li> Gelişmiş teslimat için üç kata kadar (İsteğe bağlı) Tekrar tedavileri. </li><li> Hemen 2 dakika süreyle 37 ° C&#39;de% 0.05 tripsin-EDTA ile sindirme ile yıkama heparin sonra muamele edilmiş hücreler izole edin. % 1 FBS ile takviye edilmiş DPBS 0.5 ml müstakil hücreleri yeniden askıya. </li><li> Fluoresein izotiyosiyanat (FITC) kanal (Şekil 3) kullanılarak 35 akış sitometrisi ile her bir numunenin floresan yoğunluğu ölçülür. Nüfusu yerleştirmek için ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) ayarlayınFarklı özelliklere sahip popülasyonlar birbirinden çözümlenir sağlamak ölçekte faiz. </li><li> Her numune için 10,000 canlı etkinliklerle toplayın ve sadece SOY ile tedavi edilen hücrelere ZiF-EmGFP ile tedavi HeLa hücrelerinde veri analiz yazılımı. 36 Normale floresan flow sitometri kullanarak verileri analiz. </li></ol>

<ol><li>Berg, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+domain+delivery+of+therapeutic+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).</li>
<li>Lindsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+cell+delivery%3A+application+in+protein+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).</li>
<li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA delivery systems.</a> Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).</li>
<li>Guo, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+nonviral+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in nonviral vectors for gene delivery.</a> Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).</li>
<li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55, 1189-1193 (1988).</li>
<li>Elliott, G., O'Hare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+trafficking+and+protein+delivery+by+a+herpesvirus+structural+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein.</a> Cell. 88, 223-233 (1997).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).</li>
<li>Smith, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+cationic+cell-permeable+miniature+proteins+via+alpha-helical+arginine+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).</li>
<li>Daniels, D. S., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+cell-permeable+miniature+proteins+based+on+a+minimal+cationic+PPII+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).</li>
<li>Karagiannis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+biomimetic+cell+penetrating+peptide+library%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nan%22%5BJournal%5D)">Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library.</a> ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).</li>
<li>Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+cell+penetrating+peptide+identified+using+a+plasmid+display-based+functional+selection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform.</a> ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+grafting+to+endow+cell+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Arginine grafting to endow cell permeability.</a> ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+delivery+of+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo+using+a+supercharged+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein.</a> ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).</li>
<li>Panyam, J., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+for+drug+and+gene+delivery+to+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).</li>
<li>Zelphati, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+proteins+with+a+new+lipid-mediated+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system.</a> J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).</li>
<li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).</li>
<li>Voelkel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+from+retroviral+Gag+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein transduction from retroviral Gag precursors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).</li>
<li>Sinha, V. R., Trehan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+microspheres+for+protein+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biodegradable microspheres for protein delivery.</a> J. Control Release. 90, 261-280 (2003).</li>
<li>Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+TALEN+proteins+via+bioconjugation+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering.</a> PLoS One. 9, e85755(2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyarginine+as+a+multifunctional+fusion+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Polyarginine as a multifunctional fusion tag.</a> Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).</li>
<li>Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+protein+transduction+is+cell+type-dependent+and+is+enhanced+by+dextran+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate.</a> J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).</li>
<li>Al-Taei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+traffic+and+fate+of+protein+transduction+domains+HIV-1+TAT+peptide+and+octaarginine.+Implications+for+their+utilization+as+drug+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors.</a> Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).</li>
<li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cell-penetrating+peptide-mediated+peptide+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery.</a> Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188, 773-782 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+by+direct+delivery+of+zinc-finger+nuclease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins.</a> Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).</li>
<li>Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+zinc+finger+proteins%3A+the+advent+of+targeted+gene+regulation+and+genome+modification+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies.</a> Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in targeted genome editing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+human+proteins+that+deliver+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo.</a> Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).</li>
<li>Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+Cys2-His2+zinc-finger+domains%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains.</a> ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).</li>
<li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basics of flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).</li>
<li>Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+human+gene+expression+by+ligand-inducible+TALE+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors.</a> ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).</li>
<li>Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Aart%2C+a+designed+six-finger+zinc+finger+peptide%2C+bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA.</a> J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada, hücre-geçirgen çinko-parmağı (ZiF) sahaları kullanılarak protein temini için adım adım bir protokol verilmektedir. ZiF etki kaynaşık enzimatik yük 34 etkinliğini azaltmaz; üretim ve değişikliğe uğratılmamış proteinle birlikte gözlenenler ile hemen hemen aynı mayalarda proteinlerin saflaştırılması için izin verir; ve geleneksel hücre nüfuz peptid ya da protein transdüksiyon alan sistemleri aşan randımanı olan hücre tiplerinin geniş bir aralığı içine proteinler ve enzimler taşıyabilir. Bununla birlikte,...

Yüksek verimli ve çok yönlü bir protein teslim stratejileri birçok temel araştırma ve terapötik uygulamalar için kritik öneme sahiptir. hücrelere saflaştırılmış proteinler direkt verilmesi, bunun başarılması için güvenli ve kolay yöntemlerden biri. 1,2 nükleik asitlerin gen ifadesi üzerindeki kullanan stratejiler farklı temsil eder 3-5 proteini dağıtım girmeyle mutagenez riski teşkil bağımsızdır Hücresel transkripsiyon / çeviri makine ve derhal yürürlüğe sağlar. Ancak, proteinlerin üzerine hücre delici aktivitesini endowing basit ve genellenebilir yöntemlerin eksikliği rutin hücre içine doğrudan giriş boşa. Hücre içi protein sağlanmasını kolaylaştırmak için geçerli yöntem, doğal olarak, 6-8 ya da tasarlanan hücre-delici peptidler, 9-12 kompresörlü transdüksiyon etki, 13,14 nano-tanecikleri 15 ve lipozomlar, 16 virüs benzeri partiküller 17,18 meydana kullanımına dayanmaktadır </sup&gt; ve polimerik malzemeler Mikroküre. 19 Ne yazık ki, bu yaklaşımların çoğu düşük hücresel alım oranları, 20,21 yoksul kararlılık, 22 yanlışlıkla hücre tipi özgüllük, 23 düşük endozomal kaçış özellikleri 24 ve ek toksisite. 25 tarafından engellenmektedir, birçok protein iletim teknolojileri teslim proteinlerin biyoaktivitesini azaltır. 14 Biz daha önce laboratuarımızda çinko-parmak nükleazı göstermiştir (ZFN) protein - kimerik kısıtlama programlanabilir Cys 2 -His 2 çinko parmak, DNA bağlama proteini ve Fokl sınırlama endonükleazı 26-28 bölünme alanından oluşan endonükleazlar - doğal olarak hücreye olan geçirgen. 29 Bu şaşırtıcı hücre delici etkinlik özel tasarlanmış çinko-parmak etki, hedeflenen genom tr için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır bir DNA-bağlanma platformun bir içsel özelliği olduğu gösterilmiştirMühendisliði, 30-32 ve kabul protein yüzey altı pozitif yüklü kalıntıların takımyıldızı sonucu olduğu. Gerçekten de, c-Jun N-DEK dahil olmak üzere birçok DNA-bağlama proteinleri,., Hücre zarlarını geçme yeteneği doğuştan gelen bir kapasiteye sahip olduğu gösterilmiştir 33 Daha yakın zamanda, laboratuar Bu sonuçlar genişletilmiş göstermiştir ki, çinko-hücre-delici aktivitesi parmak (ZiF) etki hücre içi protein teslimat için kaldıraçlı olabilir. Bir çok geleneksel hücre nüfuz peptit uygulama sistemlerinin aşıldı verimliliği artışa neden oldu spesifik protein yük için bir ya da iki parmak ZiF etki ya da genetik füzyonu. 34 En önemlisi, ZiF aracılı teslim kaynaşık enzimatik kargo aktiviteyi tehlikeye ve kolaylaştırdı Sitozolik teslimat yüksek düzeyde. Topluca, bu bulgular proteinlerin verimli ve kolay teslim kolaylaştırmak için ZiF etki potansiyelini göstermek ve makro potansiyel olarak daha farklı tiplerihücrelere molekülleri. Burada, memeli hücrelerinde protein temini için ZiF teknolojisi nasıl uygulanacağına ilişkin ayrıntılı adım adım bir protokol verilmektedir. Daha önce bir paketi inşa bir, iki, üç, dört, beş ve altı parmak bağlı α-sarmal DNA bağlayıcı artıkların herbirinin, bir ikame, DNA bağlama yeteneğinden yoksun ZiF etki, ancak hücreler 34 (Şekil 1) içine proteinleri üretmektedirler. İki parmak ZiF etki alanı kullanılarak HeLa hücrelerine Emerald GFP (EmGFP) üretimi ve transdüksiyon tarif edilmektedir. Bu protokol, Escherichia coli içinde çözünür ifade ve hemen hemen her memeli hücre tipinde edebilen hemen hemen herhangi bir protein verecek şekilde uzatılabilir. Beklenen sonuçlar sağlanır ve bu sistemin performansını maksimize etmek için stratejiler de tartışılmıştır.

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kaliteli PCR sistemini genişletin</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>%4-%20 Tris-Glisin Mini protein jelleri, 1,5 mm, 10 kuyu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Numune Tamponu</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Yetkili E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Çinko Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin Sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DTT Fisher Scientific</td><td>PR-V3151 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroz Reçine</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Düz Tabanlı Plaka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Poli-Lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Kalsiyum Yok, Magnezyum Yok</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Heparan Sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25300054 HeLa hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Damla ND-1000 spektrofotometre&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Arıtma Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre geçirgen cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; his<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak alanlar

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Modülerlikleri ve çok çeşitli DNA dizilerini tanımak için yeniden programlanabilme yetenekleri nedeniyle, Cys2-His 2 çinko parmak DNA bağlama alanları, hedeflenen genom mühendisliği için yararlı araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Diğer birçok DNA bağlayıcı protein gibi, çinko parmaklar da hücre zarlarını geçmek için doğuştan gelen bir yeteneğe sahiptir. Son zamanlarda, bu içsel hücre geçirgenliğinin, hücre içi protein iletimi için kullanılabileceğini gösterdik. Çinko-parmak motiflerinin genetik füzyonu, protein ve enzim yükünün çok çeşitli memeli hücre tiplerine verimli bir şekilde taşınmasına yol açar. Diğer protein transdüksiyon teknolojilerinden farklı olarak, çinko-parmak alanları yoluyla iletim enzim aktivitesini inhibe etmez ve yüksek seviyelerde sitozolik iletimlere yol açar. Burada, memeli hücrelerine protein verilmesi için çinko-parmak teknolojisinin uygulanması için ayrıntılı bir adım adım protokol sunulmaktadır. Yüksek düzeyde hücre içi çinko-parmak aracılı iletim elde etmek için temel adımlar vurgulanmakta ve bu sistemin performansını en üst düzeye çıkarmak için stratejiler tartışılmaktadır.

İki parmak ZiF-EmGFP füzyon proteinleri E. ifade edilebilir E. coli,&gt;% 95 homojenlik ve yüksek verimle (&gt; 25 mg / ml) (Şekil 2). Genel bir ve iki parmak ZiF füzyon proteinleri, vahşi tip uğratılmamış proteinin kişilerce hemen hemen aynı miktarlarda üretilebilir. Bununla birlikte, bazı bağlamlarda, beş ve altı parmak ZiF füzyon proteinleri alt baş uygulamalar için yeterince yüksek verimlerle üretilmesi mümkün değildir. 37 ° C&#39;de 90 dakika boyunca, ...

Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel proteinleri (yeşil floresan protein gibi) memeli hücrelerine aktarmak için çinko parmak domenlerinin nasıl kullanılacağını göstermektir. Bu işlem, öncelikle zinko parmak domenlerine translasyonel olarak füzyonlanmış zümrüt yeşili floresan protein MGFP içeren bir ekspresyon plazmidi oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım ise, floresan füzyon proteininin bakterilerde eksprese edilmesidir.Ardından, bakteri hücreleri lizis edilir ve floresan füzyon proteini saflaştırılır. Son adım, hücre içine alınımı sağlamak için memeli hücrelerin saflaştırılmış floresan füzyon proteini ile inkübe edilmesidir. Nihayetinde, füzyon proteininin hücrelere iletilme verimliliğini belirlemek için işlem görmüş hücrelerin floresansı akış sitometrisi ile nicelendirilebilir.Thief veya HIV kaynaklı sıkı peptit veya poli-arjinin gibi diğer protein iletim alanlarının temel avantajı, enzim kargosunun aktivitesini bozmadan yüksek düzeyde sitozolik iletimi kolaylaştırabilmeleridir. PCR'a başlamak için, bir plazmitten emerald GFP veya MGFP dizisini çoğaltın. Metin protokolüne göre, PCR ürününü bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın ve ardından DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak belirleyin. Sonra, alanin dizisini içeren bir PET 28 ekspresyon vektörü edinin.İki parmaklı çinko parmak veya iki FZ domainli sindirim vektörü ile MG F-P-P-C-R ürününü, mikrogram başına 10 ünite enzim kullanarak XMA ve SAC restriksiyon enzimleri ile sindirin ve sindirimleri 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. DNA fragmanlarını jel ekstraksiyonu ile saflaştırın ve vektör ile MG F-P-P-C-R ürününün konsantrasyonlarını ölçün. Bir spektrofotometre kullanarak, MG F-P-P-C-R ürünü ile 50 ila 100 ng vektörü, altı bir insert-vektör molar oranında tek bir tüpte birleştirin.Ardından, ligasyonla birleştirilmiş plazmidi bakterilere aktarmak için reaksiyona bir ünite T4 DNA ligaz ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Kimyasal olarak kompetan E. coli hücrelerinden 50 µL'lik bir alikotu buz üzerinde çözdürün. Sonra, hücreleri 10 ile 20 ng arasındaki ligasyon yapılmış DNA ile nazikçe karıştırın ve hücreleri DNA ile birlikte buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından, hücrelere 42 °C'de 90 saniye boyunca ısı şoku uygulayın. Transformantları seçmek için tüpe iki mL SOC besiyeri ekleyin ve hücrelerin 37 °C'de çalkalamalı olarak bir saat boyunca toparlanmasını sağlayın. Kültürden 100 µL'yi, mililitre başına 50 µg kanamisin içeren LB agar plaklarına yayın ve plakları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.mL başına 50 µg kanamisin içeren 6 mL'lik bir LB kültürüne, gece boyunca inkübe edilmiş plakadan izole bir koloni ekleyin. Kültürü, çalkalamalı inkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plazmidi izole etmek için hücreleri toplayıp mini prep işlemini gerçekleştirin ve ardından primer ile sekanslama yaparak plazmidi doğrulayın.T seven promotörü için plazmid, iki FZ domaininin MGFP ile N terminal translasyonel füzyonunu içermelidir. Protein saflaştırmasına başlamak için, öncelikle BL 21 equalize hücrelerini 100 nanogram saflaştırılmış plazmid ile transforme edin.Ertesi gün, kanmisin içeren LB agar üzerinde transformant seçimi yapın; gece boyu bekletilen plakadan tek bir koloniyi, kanmisin içeren 10 mL'lik LB besiyeri kültürüne inoküle edin ve kültürü 37 °C'de çalkalamalı inkübatörde gece boyu inkübe edin. Gece boyu büyütülen koloninin tamamını; kanmisin, %0,2 glukoz ve 100 µM çinko klorür ile desteklenmiş bir litre LB besiyerine seyreltin. Kültürü, 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,8'e ulaşana kadar 37 °C'de çalkalamalı olarak inkübe edin ve ardından ekspresyonu indüklemek için final konsantrasyonu 2 mM olacak şekilde IPTG ekleyin. Altı saatlik indüksiyonun ardından, hücreleri toplamak için kültürü 4 °C'de 10 dakika boyunca 5.000 ×g'de santrifüjleyin.Hücre peletini beş mililitre lizis tamponu içerisinde yeniden süspande edin ve ardından hücreleri, %50 güç çıkışı ile beş saniye açık on saniye kapalı döngü kullanarak dört dakika boyunca buz üzerinde sonikasyonla lizize edin. Ardından, hücre lizatını 4 °C'de 30 dakika boyunca 25.000 ×g'de santrifüjleyin ve süpernatantı buz üzerinde yeni bir toplama tüpüne aktarın. Proteini saflaştırmak için, süpernatantı bir mililitre nikel nitrik asetik asit bulamacı ile önceden doldurulmuş bir kolona yükleyin.Süpernatant kolondan geçirildikten sonra, reçineyi 20 mililitre yıkama tamponu ile yıkayın. Proteini beş mililitre elüsyon tamponu ile kolondan elüe edin ve ardından çözeltiyi diyaliz tüpüne aktarıp proteini diyalize edin; diyaliz sonrası saklama tamponunda gece boyunca bekletin. Proteini, 3000 ×g'de bir saat boyunca santrifüj ederek en az 40 µM konsantrasyona ulaştırmak için bir spin konsantratör kullanın.Saklama için metin protokolünde belirtildiği şekilde protein konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin. MGFP füzyon proteinlerini fotobeyazlamadan korumak için, 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerindeki 200 mikrolitre proteini folyo ile kaplayın. Ardından, proteini sıvı azot içinde şok dondurun ve negatif 80 derece santigrat sıcaklıkta saklayın; protein transdüksiyonuna hazırlık için önce 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarını 50 mikrogram/mililitre konsantrasyondaki 500 mikrolitre çözelti ile önceden kaplayın.25 °C'de 30 ila 60 dakika boyunca polilizin uygulayın. Hücre kültürü ekimi yapmadan önce kuyucuklardaki solüsyonu aspire edin. Hücreleri %10 FBS ve %1 antibiyotik antimikotik içeren DMM içerisinde, %5 karbondioksitli nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.Hücreleri hasat edin ve her kuyucuğa 200, 000 hücre yoğunluğunda olacak şekilde 24 kuyucuklu plakaya ekimleyin. Ardından, hücreler %80 ila %90 konfluense ulaştığında, yaklaşık 24 saatlik inkübasyonun ardından 24 kuyucuklu plağı inkübatöre yerleştirin. Her kuyucuktaki besiyerini aspire edin ve hücreleri 500 µL önceden ısıtılmış serumsuz besiyeri veya SFM ile yıkayın.Her bir kuyucuğa iki µM Z-M-G-F-P proteini ve 100 µM çinko klorür içeren 250 µL SFM ekleyin ve ardından hücreleri 37 °C'de bir saat inkübe edin. Sonrasında, kuyucuklardaki medyumu aspire edin ve hücreleri 0,5 mg/mL heparin ile desteklenmiş, kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS olarak bilinen fosfat tamponlu salin ile üç kez, 500 µL kullanarak yıkayın. Ardından, hücreleri plakadan ayırmak için kuyucuklara 200 µL %0,05 tripsin EDTA ekleyin ve 37 °C'de iki dakika inkübe edin.Ayrılan hücreleri yeni bir tüpe aktarın ve 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından hücreleri %1 FBS ile desteklenmiş 500 mL DPBS içerisinde yeniden süspande edin ve daha önce açıklandığı şekilde fite kanalını kullanarak akış sitometrisi ile örneğin ortalama floresan yoğunluğunu ölçün. İlgilenilen popülasyonu ölçek üzerine yerleştirmek için ileri ve yan saçılmayı ayarlayın.Ardından, kontrol ve test örneklerini analiz etmek için tanımlanmış kapılama (gating) yöntemini kullanın. Örnek başına 10.000 canlı olay toplayın ve verileri işlemek için akış sitometrisi analiz yazılımını kullanın. Protein ile işlem görmüş hücrelerin floresan yoğunluğunu, kontrol serumu ile işlem görmüş hücrelere göre normalize edin.Zif MGFP füzyon proteinleri e coli'de üretilmiş, saflaştırılmış ve SDS page ile analiz edilmiştir. Bu sonuçlar, iki parmaklı ZIF MG FP füzyon proteininin %95'ten daha yüksek bir homojenlikte saflaştırıldığını göstermektedir. HeLa hücreleri, artan konsantrasyonlardaki ZIFF MG FP füzyon proteini ile muamele edildiğinde.Akış sitometrisi ile ölçüldüğünde, ortalama floresans yoğunluğunda doza bağlı bir artış sergilediler; iki mikromolar konsantrasyondaki Z MG FP füzyon proteini ile yapılan ardışık tedaviler, hücrelerin yaklaşık %100'ünde MGFP floresansı ile sonuçlandı. Bu videoyu izledikten sonra, fonksiyonel proteinleri hücrelere iletmek için protein translokasyon domenlerinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

direct-protein-delivery-to-mammalian-cells-using-cell-permeable-cys2

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için sistemin nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı adımlar sağlar.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Burada, yüksek verimde saf, tamamen glikosile edilmiş ve enzimatik olarak aktif proteaz üreten HEK293T hücreleri kullanan uygun maliyetli bir granzim ekspresyon sistemini açıklıyoruz.

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

Endositik organellerin sızmasına neden olan bir reaktifle basit bir birlikte inkübasyon protokolü ile proteinlerin ve hücre geçirimsiz küçük moleküllerin kültürlenmiş memeli hücrelerine nasıl verileceğini açıklıyoruz.

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

Bitkilerin modifikasyonu için mevcut yöntemlerin uygulanabilirliği sınırlıdır. Burada önerilen yeni peptit türevi teknoloji, eksojen protein veya genlerin bozulmamış bitkilerin istenen hücre içi bölmelerine sokulmasında hem basitlik hem de verimlilik vaat ediyor.

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

Bu hücre Penetran dizileri birleştirme biotin avidin açılan yenilik ile tabanlı sisteme intraselüler protein-protein etkileşimleri çalışmaya bir protokoldür. Ana avantajdır hedef sıra canlı hücreler yerine hücre lysates ile inkübe ve bu nedenle etkileşimleri hücresel bağlamı içinde ortaya çıkar.

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Öğrenin, çinko-parmak alanları kullanarak memeli hücrelerine fonksiyonel protein teslimatı için bu protokolü. Plazmid oluşturma, bakterilerde ifade, saflaştırma ve hücre alımı adımlarını keşfedin.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim

Daha fazla video keşfet