Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim ₂ His ₂ Çinko-parmak Alanlar

Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur.

Bu prosedürün genel amacı, yeşil floresan proteini gibi fonksiyonel proteinlerin memeli hücrelerine verilmesi için çinko parmak alanlarının nasıl kullanılacağını göstermektir. Bu, önce çinko parmak alanlarına translasyonel olarak kaynaşmış zümrüt yeşili floresan proteini MGFP'yi içeren bir ekspresyon plazmidi üreterek gerçekleştirilir. İkinci adım, bakterilerdeki floresan füzyon proteinini ifade etmektir.

Daha sonra bakteri hücreleri parçalanır ve floresan füzyon proteini saflaştırılır. Son adım, alıma izin vermek için memeli hücrelerini saflaştırılmış floresan füzyon proteini ile inkübe etmektir. Sonuç olarak, tedavi edilen hücrelerin floresansı, hücrelere füzyon proteini iletiminin verimliliğini belirlemek için akış sitometrisi ile ölçülebilir.

Hırsız veya HIV türevi sıkı peptit veya poli arginin gibi diğer protein iletim alanının ana avantajı, alan enzimatik kargosunun aktivitesinden ödün vermeden yüksek düzeyde sitozolik iletimi kolaylaştırabilmesidir. PCR'ye başlamak için, zümrüt GFP veya MGFP dizisini bir plazmitten amplifiye edin Metin protokolüne göre, PCR ürününü bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın ve ardından bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Daha sonra, alanin dizisini içeren bir PET 28 ekspresyon vektörü elde edin.

İki parmak, çinko parmak veya iki FZ alanı, sindirim vektörü ve MG F-P-P-C-R ürünü, DNA'nın mikrogramı başına 10 birim enzim kullanarak XMA ve SAC bir kısıtlama enzimi ile ikame edildi ve sindirimi 37 santigrat derecede üç saat boyunca inkübe edin. DNA parçalarını jel ekstraksiyonu ile saflaştırın ve vektörün ve MG F-P-P-C-R ürününün konsantrasyonlarını ölçün. Bir spektrofotometre kullanarak, MG F-P-P-C-R ürününü ve vektörün 50 ila 100 nanogramını tek bir tüpte altıya bir insert / vektör molar oranında birleştirin.

Daha sonra bir birim T dört DNA ligaz ekleyin ve bakterileri bağlanmış plazmit ile dönüştürmek için reaksiyonu oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Çözmek. Buz üzerinde kimyasal olarak yetkin e coli hücrelerinin 50 mikrolitrelik bir alikutu. Daha sonra hücreleri 100 ila 20 nanogram bağlanmış DNA ile nazikçe karıştırın ve hücreleri DNA ile 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücreleri 90 saniye boyunca 42 santigrat derecede ısı şoku verin. Tüpe iki mililitre SOC ortamı ekleyin ve transformatörleri seçmek için çalkalayarak hücrelerin 37 santigrat derecede bir saat boyunca iyileşmesine izin verin. Mililitre başına 50 mikrogram kutu misin içeren LB agar plakalarına 100 mikrolitre kültür yayın ve plakaları ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Mililitre başına 50 mikrogram kutu misin içeren altı mililitrelik bir LB kültürünü, gece boyunca plakadan izole edilmiş bir koloni ile aşılayın. Kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Ertesi gün, plazmidi izole etmek için hücreleri toplayın ve mini hazırlayın ve ardından primer ile dizileme yaparak plazmidi onaylayın.

T yedi promotörü için, plazmit, iki FZ alanının MGFP'ye bir N terminal translasyonel füzyonunu içermelidir. Protein saflaştırmasına başlamak için. İlk olarak, BL 21'i dönüştürün, hücreleri 100 nanogram saflaştırılmış plazmit ile eşitler.

Ertesi gün can misin içeren LB agar üzerindeki dönüştürücüleri seçin, gece boyunca plakadan tek bir koloni ile kutu misin içeren 10 mililitrelik bir LB ortamı kültürünü aşılayın ve kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalama ile inkübe edin, tüm gece koloniyi bir litre LB ortamına seyreltin, kutu misin% 0.2 glikoz ve 100 mikromolar çinko klorür ile desteklenir. Kültürü 37 santigrat derecede 600 nanometre 0.8'lik bir optik yoğunluğa ulaşana kadar çalkalayarak inkübe edin ve ardından ekspresyonu indüklemek için iki milimolar nihai konsantrasyona IPTG ekleyin. Altı saatlik indüksiyondan sonra, hücreleri hasat etmek için kültürü dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 5.000 kez G'de santrifüjleyin.

Hücre peletini beş mililitre lizis tamponunda yeniden askıya alın ve daha sonra% 50 güç çıkışı ve dört dakika boyunca on saniyelik kapalı döngüde beş saniye kullanarak güneşlenme ile buz üzerinde hücreleri parçalayın. Daha sonra, hücre lizatını dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 25.000 kez G'de santrifüjleyin ve ardından süpernatanı buz üzerinde yeni bir toplama tüpüne aktarın. Proteini saflaştırmak için, süpernatanı bir mililitre nikel nitrik asetik asit bulamacı ile önceden paketlenmiş bir sütuna yükleyin.

Süpernatanı kolondan geçirdikten sonra, reçineyi 20 mililitre yıkama tamponu ile yıkayın. Proteini kolondan beş mililitre elüsyon tamponu ile elute edin ve daha sonra çözeltiyi diyaliz tüpüne aktarın, diyalize girdikten sonra gece boyunca proteini ve depolama tamponunu diyaliz edin. Bir saat boyunca 3000 kez G santrifüjleyerek proteini en az 40 mikromolar kadar konsantre etmek için bir spin yoğunlaştırıcı kullanın.

Depolama için metin protokolünde belirtildiği gibi protein konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin. 1.5 mililitrelik füge tüplerinde 200 mikrolitre protein akulayın ve MGFP füzyon proteinlerini foto-ağartmadan korumak için tüpü folyo ile kaplayın. Daha sonra flaşlayın, proteini sıvı nitrojen içinde dondurun ve protein transdüksiyonuna hazırlanmak için negatif 80 santigrat derecede saklayın, önce mililitre başına 50 mikrogramlık bir çözelti ile 500 mikrolitrelik bir plakanın kuyularını hazırlayın.

25 santigrat derecede 30 ila 60 dakika polilizin. Hücre kültürünü tohumlamadan önce çözeltiyi kuyulardan aspire edin. % 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede % 10 FBS ve% 1 antibiyotik anti mikotik içeren DMM'deki bir hücreyi iyileştirin.

Hücreleri hasat edin ve kuyu başına 200.000 hücre yoğunluğunda 24 oyuklu plakaya tohumlayın. Daha sonra, hücreler% 80 ila 90 birleştiğinde yaklaşık 24 saatlik inkübasyondan sonra inkübatöre 24 oyuklu bir plaka yerleştirin. Ortamı her bir oyuktan aspire edin ve hücreleri 500 mikrolitre ön ısıtma serumu içermeyen ortam veya SFM ile yıkayın.

Her bir oyuğa iki mikromolar Z-M-G-F-P proteini ve 100 mikromolar çinko klorür içeren 250 mikrolitre SFM ekleyin ve ardından hücreleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, ortamı kuyulardan aspire edin ve hücreleri, mililitre başına 0.5 miligram heparin ile desteklenmiş DPBS olarak bilinen 500 mikrolitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen docos fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkayın. Daha sonra, kuyucuklara 200 mikrolitre% 0.05 tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri plakadan ayırmak için iki dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ayrılan hücreleri yeni bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, hücreleri% 1 FBS ile desteklenmiş 500 mililitre DPBS'de yeniden süspanse edin, daha önce tarif edildiği gibi fite kanalını kullanarak numunenin ortalama floresan yoğunluğunu akış sitometrisi ile ölçün. İlgilenilen popülasyonu ölçeğe yerleştirmek için ileri ve yan saçılmayı ayarlayın.

Ardından, kontrolü ve test örneklerini analiz etmek için tanımlanmış geçitleme kullanın. Numune başına 10.000 canlı havalandırma toplayın ve verileri işlemek için akış sitometrisi analiz yazılımını kullanın. Protein ile muamele edilen hücrelerin floresan yoğunluğunu kontrol serumu ile muamele edilen hücrelere normalleştirin.

Zif MGFP füzyon proteinleri e coli'de üretildi, saflaştırıldı ve SDS sayfası ile analiz edildi. Bu sonuçlar, iki parmak ZIF MG FP füzyon proteininin %95'ten fazla homojenliğe kadar saflaştırıldığını göstermektedir. Helo hücreleri, ZIFF MG FP füzyon proteininin artan konsantrasyonları ile tedavi edildiğinde.

Akış sitometrisi ile ölçüldüğü gibi ortalama floresan yoğunluğunda doza bağlı bir artış gösterdiler, iki mikromolar konsantrasyonda Z MG FP füzyon proteini ile ardışık tedaviler, MGFP floresanlı hücrelerin yaklaşık% 100'ü ile sonuçlandı. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerime fonksiyonel proteinler iletmek için hırsız protein işlem alanlarını nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.