Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, B hücreleri tarafından üretilen antikorları klonlamak ve eksprese etmektir. Bu işlem, öncelikle kan veya timus gibi ilgili bir kaynak dokudan B hücrelerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise FACS uygulamak ve IgG üretimi açısından pozitif olan B hücresi popülasyonunu seçmektir.

Ardından, hücreler Epstein-Barr virüsü enfeksiyonu ve C-P-G-O-D-N 2006 ile toll-benzeri reseptör dokuz aktivasyonu ile ölümsüzleştirilip kültürde tutulur. Son aşamalar, Eliza ile IgG üretimi açısından pozitif test edilen klonlardan RNA izole etmek ve hem hafif hem de ağır IgG zincirlerinden kopya DNA oluşturmaktır. Nihayetinde, yüksek miktarlarda monoklonal insan IgG üretmek için IgG dizileri memeli ekspresyon vektörlerine klonlanabilir.

Bu tekniğin fago ekleme teknolojisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, orijinal IgG ağır ve hafif zincir eşleşmesinin kaybolmamasıdır. Bu yöntem, patojenik otoantikorların keşfi ve fonksiyonel karakterizasyonu gibi otoimmünite alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Hasta materyalleri ve EBV virüsü ile çalışmanın riskli olabileceğini unutmayın.

EB virüsü bir insan patojenidir; bu nedenle bu adımlar uygulanırken her zaman BSL 2 prosedürleri gibi önlemler alınmalı ve yeterli koruyucu ekipman kullanılmalıdır. PBMC'leri boyamadan önce, altı mililitre tam RPMI 1640 besiyeri içeren 25 santimetrelik bir flaska ekleyin ve gece boyunca toparlanmalarına izin verin. Hücreleri bloklayıp yıkadıktan sonra, PBMC'leri yarım mililitre besiyeri içeren bir tüpe toplayın ve santrifüjleyin. Ardından hücreleri etiketleme tamponu içinde yeniden süspande edin ve sayımını yapın.

Ardından, bu tüplere 200 µL tampon içerisinde 5 milyon hücre içeren iki fax tüpü hazırlayın. 10 µL anti CD 22 P-E-R-C-P veya 40 µL anti IgG pe ekleyin ve buz üzerinde, karanlıkta 30 dakika inkübe edin; ardından hücreleri yıkayın, filtreleyin ve sort edin. Amaç, çift pozitif hücreleri saymaktır.

Sıralanmış P BMC'lerini, C PG 2006 ve EBV eklenmiş tamamlayıcı ortam içeren RPMI 1640 içerisinde mikrolitre başına bir hücre olacak şekilde seyrelterek başlayın. Ardından, steril kabin içerisinde, önceden ışınlanmış WI 38 hücreleri ekilmiş 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın iki kuyucuğuna, EBV ve CPG 2006 içeren hücre seyreltisinden 110 mikrolitre ekleyin. Kuyucuk başına 50 hücrenin enfekte edilmesi optimize edilmiştir ve monoklonal bir antikor elde etme olasılığını artırır.

Buna karşın, bunu bir PCR ile doğrulamanızı öneririz. Bir haftalık inkübasyonun ardından, hücreleri B hücresi büyümesi açısından mikroskop altında inceleyin. İki hafta sonra medyayı değiştirin; her kuyucuktan 90 µL medyum yavaşça aspire edin ve yeni bir plakaya aktarın.

Eliza ile IgG üretimini test etmek için. Ardından her bir kuyuya, IL two içeren 100 µL taze destekli besiyeri ekleyin. Klon büyümesini üçüncü ve dördüncü büyüme haftaları boyunca izlemeye devam edin.

Besiyeri değişimi her hafta tekrarlanır. Klonal genişletme yöntemleri için metin protokolüne bakınız. Besiyeri değişimlerinden elde edilen süpernatantın IgG üretimi açısından bir enzim bağlı immünosorbent assay veya ELISA kullanılarak kontrolü yapılır.

Öncelikle, her bir kuyucuğuna kodlama tamponunda 1/200 oranında seyreltilmiş 50 µL keçi anti-insan FC antikorları dağıtarak ELISA plakalarını hazırlayın. Plakayı inkübe edip yıkadıktan sonra, kuyucukları kuyucuk başına 100 µL bloklama tamponu ile bloke edin ve plakayı tekrar inkübe edin. Bloklama inkübasyonunun ardından, plaka içindeki sıvıyı bir kağıt havlu üzerine boşaltarak uzaklaştırın.

Plaka hazırlandıktan sonra, süpernatantları dört hacim RPMI ile seyreltin. Ardından standart kontroller için, RPMI içinde insan IgG çözeltisini 1000 nanograms per milliliter'den 15.6 nanograms per milliliter'ye kadar seri seyreltin.

Ayrıca bir boş kontrol ekleyin. Süpernatantın veya standardın 50 µL'sini her kuyucuğa uygulayın ve ELISA plağını aynı şekilde 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin; antikor afinitesini test etmek için süpernatantların daha fazla dilüsyonlarını analiz etmek amacıyla ek ELISA'lar kurulabilir. İnkübasyonun ardından plağı yıkayın.

Ardından, her kuyucuğa peroksidaz konjuge fab iki içeren 50 µL inkübasyon tamponu uygulayın. Bir saatlik daha inkübasyon ve bir yıkama işleminin ardından, her birine TMB içeren 100 µL substrat çözeltisi ekleyin. Daha sonra, ortaya çıkan mavi renk stabilize olana kadar plakayı 10 dakikaya kadar inkübe edin.

Ardından reaksiyonu durdurun ve absorbansı ölçün. Ölçülen absorbansı kör değerin üç standart sapma üzerinde olan tüm klon süpernatantları pozitiftir.

İnsan IgG antikorları için antijenik özgüllük, ek analizlerle tespit edilebilir. Başlamak için, pozitif klonlardan kopya DNA sentezlemek üzere metin protokolünü takip edin. Ardından, IgG ağır kappa ve lambda zincirleri için PCR'ları kurun.

Sonuçlarda, 400 ila 550 baz çiftinde ağır zinciri bulun. 300 ila 400 baz çiftinde hafif zinciri bulun. Eğer bunlar orada değilse, ürünlerden bir mikrolitreyi başka bir PCR için kalıp olarak kullanın.

Yeni ürünler uygun aralıkta olmalıdır. Ardından, en iyi ürünlerin klonlama işlemine geçilmelidir. İlk olarak, bunlar dizilenmelidir. Elektroferogramları temiz olmalı ve tek bir immünoglobulin dizisine karşılık gelmelidir.

Metin protokolünü takip edin. Saflaştırılmış PCR ürününü bir mikrogram plazmit DNA'ya klonlayın. Ligasyon işleminin 16 °C'de gece boyunca gerçekleştirildiğinden emin olun.

T4 DNA Ligaz kullanarak, takviye edilmiş DMEM içerisinde HX hücrelerini hazırlayın ve 75 santimetrekarelik kültür flasklarında %75 konfluense ulaşana kadar büyütün. Her ağır-hafif zincir transfeksiyonu için; 1,75 Mililitre serumsuz DMEM, 4,5 mikrogram ağır zincir vektörü, üç mikrogram hafif zincir vektörü ve 50 mikrolitre polietilen çözeltisi içeren bir karışım hazırlayın. Bu karışımı nazikçe bir HX hücresi plağına ekleyin ve çözeltiyi plak üzerinde dairesel hareketlerle yayın.

Plakayı gece boyunca inkübe edin ve ardından her gün kültür medyumunu toplamaya başlayın. Toplanan medyumun yerine serumsuz medyum ekleyin. Medyum antikorları içerir ve CD 22 ve IgG pozitif pBMC'lerin FACS ile ayrıştırılmasından sonra dört gün boyunca günlük olarak toplanabilir.

Çift pozitif hücrelerin, yani IgG antikorları üreten B hücrelerinin bulunduğu alan genişletilmek üzere ayrı olarak toplandı. PBMC'lerin yaklaşık %1'i bu çift pozitif popülasyonda yer almaktaydı. Beş haftalık EBV ölümsüzleştirme ve CPG 2006 stimülasyonunun ardından, ölümsüzleştirilmiş klonlar izole edildi.

WI 30 besleyici hücreler daha uzamış bir fibroblast şekline sahiptir ve B hücresi klonları, yuvarlak tabanlı çok kuyucuklu plakanın ortasında kümelenmiş halde büyüyen çok küçük yuvarlak hücreler olarak görülür. Büyüyen klonların süpernatantı, IgG'ye yönelik bir ELISA ile test edilmiştir. Pozitif bir klon, boş değerin üç standart sapma üzerinde bir ELISA değerine sahip olan klon olarak değerlendirilmiştir.

Pozitif bir klondan elde edilen en az üç süpernatan, ELISA'da pozitif sonuç vermiştir. Pozitif bir klondan elde edilen antikorlar, immünoglobulin ağır ve lambda zincirlerinin değişken ve sabit bölgeleri klonlandıktan sonra dizilenmiş ve böylece ağır ve hafif zincirler karakterize edilebilmiştir. Bu prosedür izlenmiştir.

Antikor, gen kullanımı, genetik çeşitlilik vb. gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu gelişimin ardından söz konusu teknik, otoimmünite alanındaki araştırmacıların myasthenia gravis gibi otoimmün hastalıklar için hastalığı, patolojiyi ve ilgili terapötik stratejileri keşfetmelerine yol açmıştır. Bu tekniğin etkileri, myasthenia gravis gibi hastalıkların teşhis ve tedavisine kadar uzanmaktadır; çünkü patojen antikorların keşfi, inflamatuar aktivitesi olmayan kompetitör antikorlar gibi yeni tedavilerin geliştirilmesine imkan sağlayabilir.