Name: Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Öğrenin B hücrelerinden rekombinant insan IgG monoklonal antikor üretimini. Epstein-Barr virüsü ile ölümsüzleştirme ve akış sitometrisi kullanarak yüksek verimli antikor sentezi yapın. Bu yöntem otoimmünite araştırmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma sözleşmesi Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) (GN-G.). Bilimsel Araştırmalar &quot;Translational Neuroscience Programı Enstitüsü&quot; Hollanda Teşkilatı (022005019) (CH) den Kardeşliği. Prinses Beatrix Fonds (Proje WAR08-12) ve Ortaklık Française contre les Miyopatiler için hibeler (PM-M.); yanı sıra Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü bir Veni Bursu (916.10.148) Hollanda Beyin Vakfı burs ile (FS2008 (1) -28) ve ML Prinses Beatrix Fonds (Proje WAR08-12) ( ). Biz flow sitometri göre sıralama B-hücresi ona yardım için Jozien Jaspers teşekkür ederiz.

<ol><li>Vrolix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+of+thymic+B+cells+from+early-onset+myasthenia+gravis+patients+with+antibodies+against+the+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor.</a> J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).</li>
<li>Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+generation+of+human+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the generation of human monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).</li>
<li>Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+identification+of+autoantibodies+specific+to+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases+in+high+throughput+operation%3A+Proposal+of+reliable+and+feasible+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies.</a> Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).</li>
<li>Losen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+myasthenia+gravis+by+preventing+acetylcholine+receptor+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+making+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">A novel method for making human monoclonal antibodies.</a> J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+induced+clonal+expansion+in+immortalized+B+cells+from+the+peripheral+blood+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients.</a> J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+individual+immune+responses+elicited+by+in+vitro+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Different individual immune responses elicited by in vitro immunization.</a> Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+immortalization+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cell immortalization for monoclonal antibody production.</a> Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monoclonal+antibodies+by+immortalization+of+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+B+cells%3A+analysis+of+B+cell+repertoire+and+production+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies.</a> Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth.+Curr+Protoc+Immunol+%2F+edited+by%5BTitle%5D)+AND+%22John+E.+Coligan+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by.</a> John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Ibrahim, S. F., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and cell sorting.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).</li>
<li>Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+feeder+cells+on+the+X-ray+sensitivity+of+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells.</a> Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).</li>
<li>Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+virus+growth-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> J Vis Exp. (57), 3321(2011).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Bu yazıda, insanlara özgü PBMCs&#39;den elde IgG antikorlarının üretilmesi için tüm adımları ayrıntılı bir şekilde sunulmaktadır. Bu protokol daha önce yayınlanmış tekniklere göre bazı avantajlara sahiptir. Avantajlarından biri üretilen antikor B hücresi klonu orijinal çiftine karşılık gelen ağır ve hafif zincirleri tutmasıdır. IgG antikorlarının tanımlanması insan vericinin her türlü yapılabilir, ve aşı 5 nedeniyle bağışıklık tepkisi alevlenme için bir ihtiyaç vardır. bir besleme hücresi olarak fıbroblast hü...

Bu maddenin amacı, detaylı bir şekilde oluşturabilir ve insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC), elde edilen insan IgG monoklonal antikorları karakterize etmek için bir yöntem tanımlamaktır. insan antikorları incelemek için faiz araştırma birçok farklı alanda büyüdü. Özellikle, birçok araştırma grupları oto-antikorların 1-3 kaynaklanan patoloji ilgilendi. Biz klonlanmış ve patojenik oto-antikorlar 1 nitelendirmiştir. oto-antikorların çalışma rakip antikorlar 4 kullanan, örneğin, kendi hedefleri tespit etmek ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Ayrıca, insan antikorlarının çalışma aynı zamanda, aşı 5 sonrası bağışıklık tepkisini değerlendirmek için maruz kalan ve belirli bir patojen 6 ya da çalışma için dirençli haline geldi kişilerin antikor profilini karakterize etmek için, örneğin, araştırmanın diğer alanlarda, ilgi hangi Antikorlar olanDoğal repertuar 7,12. Çeşitli teknikler, rekombinant insan monoklonal antikorlarını üretmek için 8-12 geliştirilmiştir; Bunların çoğu, faj görüntüleme ve B hücre immortalizasyonunu kullanımı. Faj gösteriminin kullanımı, geniş ölçüde, yeni antikorlar 13 keşfedilmesi için uygulanmıştır. Ancak haline insan immünoglobulin ağır ve hafif zincir çiftinin işleminde ayrışmış, yani bu, önemli bir dezavantajı vardır. Insan B hücreleri ya da EBV dönüşümü ile hibridomlar üretimi bu dezavantajı ortadan kaldırır. Biz Toll-like reseptör 9 (TLR-9) 6,12&#39;dir yoluyla poliklonal B hücre stimülasyonu ile birlikte EBV ile timik B hücrelerinin enfeksiyonu kullanın. Bu yazıda ayrıntılı olarak in vitro antikor nesil PBMC izolasyondan tüm adımların eksiksiz bir bakış ile, IgG insan antikorlarının gelişmesi için kullanmak teknolojiyi tanımlamak. BuProtokol insan IgG profilin her tür analizi için kullanılabilir. Laboratuvarımızda, IgG antikorları üreten B hücreleri başarıyla sıralama sonra PBMC&#39;lerin geri kalanından ayrılmış oylandı. Elli kriteri B hücreleri 8 daha sonra, çok oyuklu plakalara plakalanır ve bir B hücrelerinin klonal genişleme için, EBV ve TLR 9 aktivasyonu ile immortalize olabilir. Besleyici hücreler olarak, insan embriyonik akciğer dokusundan fibroblastlar, ölümsüzleştirilmiş B hücreleri görüntülenmesini kolaylaştırır hücre çizgisi WI38 kullanılmıştır. Bu B hücreleri, immünoglobulin ağır ve hafif zincirlerinin sekansları, PCR ile elde edilebilir, ve antikor genleri immünoglobülin G sentezleme vektörlerine klonlanmış ve in vitro koşullarda üretilen. Bu tekniği kullanarak, donör bulundu aynı antikor dizisi ile tek antikorlar ele alınabilir.

<table><tbody><tr><td>Histopak-1077&nbsp;</td><td>Polisükroz ve sodyum diatrizoat içeren</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td> çözeltisi</tr><tr><td>FACSAria II hücre sıralayıcı&nbsp;</td><td>BD Biyobilimler & nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 U-tabanlı mikro kuyu plakası&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>B95-8 hücre hattının %30 v/v EBV içeren süpernatanı&nbsp; &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3,4 x 108 kopya/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38 hücreleri&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>İnterlökin-2</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>10799068001</tr><tr><td>ELISA plakaları</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td> AffiniPure, <td></td></tr><tr><td>F (ab ') 2, Parça Keçi, Anti-İnsan IgG, Fc & gama; Fragment Specific (konjugee olmayan)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>%4 yağsız kuru süt (Blotting Grade Blocker)&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IgG&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>İNSAN IgG saflaştırılmış İmmünoglobulin, 5.6 mg / ml</td></tr><tr><td>Keçi F (ab) 2 antihuman IgG Fc & gama; (peroksidaz (PO) ile konjuge edilmiş)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>ELISA okuyucu (Perkin Elmer 2030)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz konjuge AffiniPure Tavşan Anti-İnsan IgM, Fc5 & mikro; &nbsp; </td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Hücreleri Doğrudan cDNA Sentez Sistemi&nbsp;</td><td>Canlandırıcı&nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Uygulamalı Biyosistemler (ABI) GeneAm PCR Sistemi 2700</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Saf RNA İzolasyon Kiti&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Ters transkripsiyon sistemi kiti&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Taq DNA Polimeraz</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>Primerleri (2 & mu; l)</td> <td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Saf Agaroz&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp merdiven</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Miktar Bir 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td> <td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 döngü sıralama kiti ve nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>0.1 ml reaksiyon plakası (MicroAMP Optik 96 kuyulu)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Genetik analizör ABI300&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>DH5 ve alfa; yetkin hücreler (E. coli)</td><td>İnvitrojen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr><tr><td>SOC ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>LB bazlı agar besiyeriZeocin (Fast-Media Zeo Agar) ile desteklenmiş</td> <td>Invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>Müthiş Et Suyu (TB) bazlı sıvı besiyeri, Zeocin (Fast-Media Zeo TB) ile desteklenmişInvivogen</td><td></td> <td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA Miniprep kiti&nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (ND1000 Spektrofotometre)</td><td>Blasticidin</td> (Fast-Media Blast Agar) ile desteklenmiş Nanodrop <td></td><td></td></tr><tr><td>LB bazlı agar besiyeriInvivogen</td><td></td> <td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Müthiş Et Suyu (TB) bazlı sıvı besiyeriBlasticidin (Fast-Media Blast TB) ile desteklenmiş</td> <td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20.000 U/ml, 10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10.000 U/ml, 10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log DNA merdiveninde</td><td>New England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0.1-10.0 kb, 1.000 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10.000 U/ml, 10x CutSmart Tamponunda&nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10.000 U/ml, 10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5.000 U/ml, 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP Isıya Duyarlı Alkalin Fosfataz</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/&mikro; l, 10x FastAP Tamponu</td></tr><tr><td>DH5 ve alfa; yetkili hücreler ve nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare Anti-İnsan IgG</td><td>BD Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Klon: HIB22</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti ve nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

Ölümsüzleştirilmiştir sıralama b hücrelerinden rekombinant İnsan igg monoklonal antikorlarının Üretimi

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

İnsan monoklonal antikorlarının üretilmesi için yeni yöntemler bulmak, immünoterapötiklerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere hem temel hem de uygulamalı bilimler için önemli olan aktif bir araştırma alanıdır. Bununla birlikte, bu tür antikorları tanımlama ve üretme teknikleri zorlu olma eğilimindedir ve bazen antikorların ağır ve hafif zincir çifti ayrışır. Burada, Epstein-Barr Virüsü (EBV) ve Toll benzeri reseptör 9 aktivasyonu ile ölümsüzleştirme kullanarak insan periferik kan mononükleer hücrelerinden insan rekombinant monoklonal antikorları üretmek için nispeten basit ve anlaşılır bir protokol açıklıyoruz. Yeterli bir boyama ile, antikor üreten B hücreleri, daha sonra ölümsüzleştirme ve klonal genişleme için izole edilebilir. Ölümsüzleştirilmiş B hücresi klonları tarafından üretilen antikor transkriptleri, PCR ile amplifiye edilebilir, karşılık gelen ağır ve hafif zincir çiftleri olarak dizilenebilir ve immünoglobulin ekspresyon vektörlerine klonlanabilir. Bu teknikle elde edilen antikorlar, otoimmünite de dahil olmak üzere ilgili insan bağışıklık tepkilerini incelemek ve yeni terapötikler için temel oluşturmak için güçlü araçlar olabilir.

CD22 ve IgG pozitif hücrelerin boyanması sonrası ayırma yolluk, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir, bu görüntü, çift pozitif hücrelerin alanı -. IgG antikorları üreten B hücrelerinin - Ayrı bir tüp içinde bu hücreler sıralamak için seçilir. Analizde, toplam PBMC&#39;lerin yaklaşık% 1&#39;i bu çifte pozitif nüfusa karşılık gelmektedir. Elde edilen kriteri hücrelerin sayısı Bölüm 1 &#39;de elde edilen hücrelerin sayısına bağlıdır. EBV ölümsüzleşme ve CpG (ODN2006) uyaranların 5 ha...

İnsan monoklonal antikorlarının sentezi, oto-antikor aracılı immün yanıtların patofizyolojik mekanizmalarını çözmeyi amaçlayan çalışmaların ilk basamağıdır. B hücresi izolasyonu, antikor klonlaması ve in vitro sentez dahil olmak üzere kanla sınıflandırılmış B hücrelerinden rekombinant insan immünoglobulin G (IgG) monoklonal antikorları üretmek için bir protokol geliştirdik.

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Bu prosedürün genel amacı, B hücreleri tarafından üretilen antikorları klonlamak ve eksprese etmektir. Bu işlem, öncelikle kan veya timus gibi ilgili bir kaynak dokudan B hücrelerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise FACS uygulamak ve IgG üretimi açısından pozitif olan B hücresi popülasyonunu seçmektir.Ardından, hücreler Epstein-Barr virüsü enfeksiyonu ve C-P-G-O-D-N 2006 ile toll-benzeri reseptör dokuz aktivasyonu ile ölümsüzleştirilip kültürde tutulur. Son aşamalar, Eliza ile IgG üretimi açısından pozitif test edilen klonlardan RNA izole etmek ve hem hafif hem de ağır IgG zincirlerinden kopya DNA oluşturmaktır. Nihayetinde, yüksek miktarlarda monoklonal insan IgG üretmek için IgG dizileri memeli ekspresyon vektörlerine klonlanabilir.Bu tekniğin fago ekleme teknolojisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, orijinal IgG ağır ve hafif zincir eşleşmesinin kaybolmamasıdır. Bu yöntem, patojenik otoantikorların keşfi ve fonksiyonel karakterizasyonu gibi otoimmünite alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Hasta materyalleri ve EBV virüsü ile çalışmanın riskli olabileceğini unutmayın.EB virüsü bir insan patojenidir; bu nedenle bu adımlar uygulanırken her zaman BSL 2 prosedürleri gibi önlemler alınmalı ve yeterli koruyucu ekipman kullanılmalıdır. PBMC'leri boyamadan önce, altı mililitre tam RPMI 1640 besiyeri içeren 25 santimetrelik bir flaska ekleyin ve gece boyunca toparlanmalarına izin verin. Hücreleri bloklayıp yıkadıktan sonra, PBMC'leri yarım mililitre besiyeri içeren bir tüpe toplayın ve santrifüjleyin. Ardından hücreleri etiketleme tamponu içinde yeniden süspande edin ve sayımını yapın.Ardından, bu tüplere 200 µL tampon içerisinde 5 milyon hücre içeren iki fax tüpü hazırlayın. 10 µL anti CD 22 P-E-R-C-P veya 40 µL anti IgG pe ekleyin ve buz üzerinde, karanlıkta 30 dakika inkübe edin; ardından hücreleri yıkayın, filtreleyin ve sort edin. Amaç, çift pozitif hücreleri saymaktır.Sıralanmış P BMC'lerini, C PG 2006 ve EBV eklenmiş tamamlayıcı ortam içeren RPMI 1640 içerisinde mikrolitre başına bir hücre olacak şekilde seyrelterek başlayın. Ardından, steril kabin içerisinde, önceden ışınlanmış WI 38 hücreleri ekilmiş 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın iki kuyucuğuna, EBV ve CPG 2006 içeren hücre seyreltisinden 110 mikrolitre ekleyin. Kuyucuk başına 50 hücrenin enfekte edilmesi optimize edilmiştir ve monoklonal bir antikor elde etme olasılığını artırır.Buna karşın, bunu bir PCR ile doğrulamanızı öneririz. Bir haftalık inkübasyonun ardından, hücreleri B hücresi büyümesi açısından mikroskop altında inceleyin. İki hafta sonra medyayı değiştirin; her kuyucuktan 90 µL medyum yavaşça aspire edin ve yeni bir plakaya aktarın.Eliza ile IgG üretimini test etmek için. Ardından her bir kuyuya, IL two içeren 100 µL taze destekli besiyeri ekleyin. Klon büyümesini üçüncü ve dördüncü büyüme haftaları boyunca izlemeye devam edin.Besiyeri değişimi her hafta tekrarlanır. Klonal genişletme yöntemleri için metin protokolüne bakınız. Besiyeri değişimlerinden elde edilen süpernatantın IgG üretimi açısından bir enzim bağlı immünosorbent assay veya ELISA kullanılarak kontrolü yapılır.Öncelikle, her bir kuyucuğuna kodlama tamponunda 1/200 oranında seyreltilmiş 50 µL keçi anti-insan FC antikorları dağıtarak ELISA plakalarını hazırlayın. Plakayı inkübe edip yıkadıktan sonra, kuyucukları kuyucuk başına 100 µL bloklama tamponu ile bloke edin ve plakayı tekrar inkübe edin. Bloklama inkübasyonunun ardından, plaka içindeki sıvıyı bir kağıt havlu üzerine boşaltarak uzaklaştırın.Plaka hazırlandıktan sonra, süpernatantları dört hacim RPMI ile seyreltin. Ardından standart kontroller için, RPMI içinde insan IgG çözeltisini 1000 nanograms per milliliter'den 15.6 nanograms per milliliter'ye kadar seri seyreltin.Ayrıca bir boş kontrol ekleyin. Süpernatantın veya standardın 50 µL'sini her kuyucuğa uygulayın ve ELISA plağını aynı şekilde 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin; antikor afinitesini test etmek için süpernatantların daha fazla dilüsyonlarını analiz etmek amacıyla ek ELISA'lar kurulabilir. İnkübasyonun ardından plağı yıkayın.Ardından, her kuyucuğa peroksidaz konjuge fab iki içeren 50 µL inkübasyon tamponu uygulayın. Bir saatlik daha inkübasyon ve bir yıkama işleminin ardından, her birine TMB içeren 100 µL substrat çözeltisi ekleyin. Daha sonra, ortaya çıkan mavi renk stabilize olana kadar plakayı 10 dakikaya kadar inkübe edin.Ardından reaksiyonu durdurun ve absorbansı ölçün. Ölçülen absorbansı kör değerin üç standart sapma üzerinde olan tüm klon süpernatantları pozitiftir.İnsan IgG antikorları için antijenik özgüllük, ek analizlerle tespit edilebilir. Başlamak için, pozitif klonlardan kopya DNA sentezlemek üzere metin protokolünü takip edin. Ardından, IgG ağır kappa ve lambda zincirleri için PCR'ları kurun.Sonuçlarda, 400 ila 550 baz çiftinde ağır zinciri bulun. 300 ila 400 baz çiftinde hafif zinciri bulun. Eğer bunlar orada değilse, ürünlerden bir mikrolitreyi başka bir PCR için kalıp olarak kullanın.Yeni ürünler uygun aralıkta olmalıdır. Ardından, en iyi ürünlerin klonlama işlemine geçilmelidir. İlk olarak, bunlar dizilenmelidir. Elektroferogramları temiz olmalı ve tek bir immünoglobulin dizisine karşılık gelmelidir.Metin protokolünü takip edin. Saflaştırılmış PCR ürününü bir mikrogram plazmit DNA'ya klonlayın. Ligasyon işleminin 16 °C'de gece boyunca gerçekleştirildiğinden emin olun.T4 DNA Ligaz kullanarak, takviye edilmiş DMEM içerisinde HX hücrelerini hazırlayın ve 75 santimetrekarelik kültür flasklarında %75 konfluense ulaşana kadar büyütün. Her ağır-hafif zincir transfeksiyonu için; 1,75 Mililitre serumsuz DMEM, 4,5 mikrogram ağır zincir vektörü, üç mikrogram hafif zincir vektörü ve 50 mikrolitre polietilen çözeltisi içeren bir karışım hazırlayın. Bu karışımı nazikçe bir HX hücresi plağına ekleyin ve çözeltiyi plak üzerinde dairesel hareketlerle yayın.Plakayı gece boyunca inkübe edin ve ardından her gün kültür medyumunu toplamaya başlayın. Toplanan medyumun yerine serumsuz medyum ekleyin. Medyum antikorları içerir ve CD 22 ve IgG pozitif pBMC'lerin FACS ile ayrıştırılmasından sonra dört gün boyunca günlük olarak toplanabilir.Çift pozitif hücrelerin, yani IgG antikorları üreten B hücrelerinin bulunduğu alan genişletilmek üzere ayrı olarak toplandı. PBMC'lerin yaklaşık %1'i bu çift pozitif popülasyonda yer almaktaydı. Beş haftalık EBV ölümsüzleştirme ve CPG 2006 stimülasyonunun ardından, ölümsüzleştirilmiş klonlar izole edildi.WI 30 besleyici hücreler daha uzamış bir fibroblast şekline sahiptir ve B hücresi klonları, yuvarlak tabanlı çok kuyucuklu plakanın ortasında kümelenmiş halde büyüyen çok küçük yuvarlak hücreler olarak görülür. Büyüyen klonların süpernatantı, IgG'ye yönelik bir ELISA ile test edilmiştir. Pozitif bir klon, boş değerin üç standart sapma üzerinde bir ELISA değerine sahip olan klon olarak değerlendirilmiştir.Pozitif bir klondan elde edilen en az üç süpernatan, ELISA'da pozitif sonuç vermiştir. Pozitif bir klondan elde edilen antikorlar, immünoglobulin ağır ve lambda zincirlerinin değişken ve sabit bölgeleri klonlandıktan sonra dizilenmiş ve böylece ağır ve hafif zincirler karakterize edilebilmiştir. Bu prosedür izlenmiştir.Antikor, gen kullanımı, genetik çeşitlilik vb. gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu gelişimin ardından söz konusu teknik, otoimmünite alanındaki araştırmacıların myasthenia gravis gibi otoimmün hastalıklar için hastalığı, patolojiyi ve ilgili terapötik stratejileri keşfetmelerine yol açmıştır. Bu tekniğin etkileri, myasthenia gravis gibi hastalıkların teşhis ve tedavisine kadar uzanmaktadır; çünkü patojen antikorların keşfi, inflamatuar aktivitesi olmayan kompetitör antikorlar gibi yeni tedavilerin geliştirilmesine imkan sağlayabilir.

generation-recombinant-human-igg-monoclonal-antibodies-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protein terapötikler üretmek için hücre hattı geliştirme, üretim, yüksek verimlilik, otomatik bir platform açıklanmıştır. Uygulama, BD FACS Aria Hücre Sıralayıcısı CloneSelect Imager ve Tecan Özgürlük EVO sıvı taşıma sistemi, gelişmiş hücre hattı kalite ve yüksek tekrarlanabilirlik hücre hattı geliştirme işleme kapasitesi önemli ölçüde artış göstermiştir.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

Bu video, ağır ve hafif zincir genlerine sahip plazmit vektörlerini tanıtarak memeli hücrelerinden antikor üretme yöntemini göstermektedir. Bu vektörler polietilenimin ile etkileşime girer ve polipleksler oluşturarak hücrelere girer; Daha sonra, tek tek proteinlere çevrilirler ve hücre dışı ortama salgılanan tam antikorlara birleştirilirler.

Memeli Hücre Kültürlerinden Rekombinant Monoklonal Antikorların Üretilmesi

Video, antijene özgü B hücrelerinden monoklonal antikorlar üretmek için bir tekniği göstermektedir. İzole edilmiş antijene özgü B hücrelerinden klonlanan antikorların ağır ve hafif zincirlerini kodlayan ökaryotik ekspresyon vektörleri, polipleksler kullanılarak memeli hücrelerine sokulur. Hücrelerin içine girdikten sonra, bu vektörler translasyona uğrar ve elde edilen ağır ve hafif zincirli peptitler, daha sonra hücreler tarafından salgılanan antikorlara dönüşür.

Antijene Özgü B Hücrelerinden Monoklonal Antikorlar Üretmek İçin Bir Teknik

Hidoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların üretilmesi için optimize edilmiş bir protokol sunulmuştur. Fareler bir immünokonjugat ile aşılandı. Dalak hücreleri, PEG ve ölümsüz miyelom hücreleri ile bir elektrik darbesi ile kaynaştırıldı. Antikor üreten hibridoma hücreleri HAT ve antijene özgü ELISA taraması ile seçildi.

Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Bir gen yapısı ve fonksiyonu analizi verimli bir...

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

C57BL / 6 farelerinde Hc patogenezinde çalışma ve en iyi model sağlamak için kullanılmaktadır. Biz bu mantara karşı sıvısal bağışıklığın potansiyel yararları keşfetmek ve histon H2B ve ısı şoku proteini 60kDa] üretilen çeşitli mAbs intraperitoneal uygulamadan sonra koruyucu etkinlik için test ettiğim.

Karşı Monoklonal Antikorlar Pasif Yönetim H. capsulatum Ve Diğerleri Fungal Patojenler

Öğrenin B hücrelerinden rekombinant insan IgG monoklonal antikor üretimini. Epstein-Barr virüsü ile ölümsüzleştirme ve akış sitometrisi kullanarak yüksek verimli antikor sentezi yapın. Bu yöntem otoimmünite araştırmaları için değerlidir.

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Daha fazla video keşfet