Name: Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Öğrenin koaksiyal meme kullanarak pluripotent kök hücreleri aljinat hidrojel kapsüllere kapsüllendirme yöntemini. Bu teknik hücre kümelenmesini ve kayma gerilimini azaltarak kütle üretim ve kök hücre niş araştırmaları için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı'nın (JST) S-Innovation projesi, Tokyo Üniversitesi Yaşam İnovasyonunda Liderler Yüksek Lisans Programı (GPLLI) ve Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nin Genç Bilim İnsanları Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir. Yüksek hızlı kamera kullanarak film çektiği için nac Image Technology Inc.'e teşekkür ederiz.

1. Hazırlanması Malzemeler <ol><li> 10 mM HEPES tamponu hazırlayın. RT&#39;de 7.0 pH ayarlayın ve% 0,9 ile NaCl ekleyin. </li><li> 1,1 hazırlanan HEPES-tamponlu tuzlu su karıştırılarak% 5 aljinat çözeltisi ve 10 mM EDTA solüsyonu hazırlayın. Oda sıcaklığında 7.0 pH ayarlayın. </li><li> 121 ° C&#39;de 20 dakika için reaktifler (1.1, 1.2) Otoklav. </li><li> DMEM,% 10 ES nitelikli FBS ve 90, mitomisin C, 10 ug / ml ihtiva eden içinde kuluçkalama ile besleyici hücreler olarak kabul edilir 2.0 x 10 6 fare embriyonik akciğer fibroblast (MEF) hücreleri, - 1.2 katmanlı jelatin kaplı 60 mm&#39;lik yemekler hazırlamak - 120 dk. </li><li> (ES nitelikli FBS% 20, 2-merkaptoetanol, temel olmayan amino asit ve antibiyotik 50 uM içeren 5 ml DMEM yüksek glikoz mevcudiyetinde besleyici hücreler ile tabağına hücreleri (IPS) fare uyarılmış pluripotent kök bakımı Penisilin G Sodyum, streptomisin sülfat, 100 ug / ml, 100 birim / ml ve amphoteri 250 ng / mlcin B). </li><li> Tohum 4 × 10 5 iPS bir jelatin kaplı 60 mm çanak hücreleri ve CO 2 37 ° C&#39;de inkübe ve% 5. Inkübasyon sırasında kültür ortamı her gün değiştirin. 3 sonra, - kültür 4 gün, 37 ° C&#39;de% 0.05 tripsin,% 0.02 EDTA ihtiva eden 500 ul 1 dakika% 5 CO2 hücreleri trypsinize. Bundan sonra, kültür çanak on kere dokunarak hücreleri ayırmak. </li><li> 3 dakika boyunca 160 x g&#39;de santrifüj hücre süspansiyonu (üç kez 1.000 ul mikropipet ile pipetleme tek hücre içine ayrışma fare iPS hücrelerinin takiben) FBS ve antibiyotik ES-nitelikli% 10 ile DMEM 2.5 ml ekleyin ve süpernatant kaldırmak ve hücre sayımı . Hücre sayımı sonrasında, bir jelatin-kaplı tabak üzerinde toplanan hücreler kalkarlar ve MEF hücrelerinden iPS hücrelerini izole etmek için 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücrelerin sayılmasından sonra (genellikle 1-3 x 10 6 hücre / çanak toplanabilir), 4 x 10 5 iPS hücrelerini reseedçanak. </li></ol> Aljinat Hidrojel Kapsüller içine 2. Hücre Encapsulation <ol><li> 1.5 ve 1.6 de tarif edilen ayni yöntem vasıtasıyla hücreleri toplamak. 3 dakika boyunca 160 x g&#39;de santrifüj sonra, üç kez HEPES tamponlu salin ile iPS hücresi pelet yıkayın. HEPES-tamponlu tuzlu su içinde hücrelerin yeniden süspansiyona sonra, başka şekilde memeyi tıkayabilecek büyük topaklar ortadan kaldırmak üzere bir 40 um&#39;lik bir hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre edin. </li><li> HEPES-tamponlu tuzlu su içinde hücre süspansiyonu 2 ml ve% 5 Alg-Na çözeltisi 3 ml karıştırın. Son olarak% 3 Alg-Na çözeltisi içinde hücre 5 ml süspansiyon elde edilir. Hücre yoğunluğu tercihen en fazla 10 6 hücre / ml &#39;dir. </li><li> 5 ml enjektöre hücre süspansiyonu topladıktan sonra, şırınga üzerindeki bir eş eksenli meme (Şekil 1A, B) yüklemek ve şırınga pompası bunları ayarlayın. Emit N2 gazı akışı (düşük 1L / dakika daha) eş-eksenli, memenin dış iğne yoluyla veİç memeden hücre süspansiyonu sınırdışı. </li><li> % 0.5 CaCI2 çözeltisi 250 ml damlacıklar toplamak ve 10 bekle - 60-90 rpm&#39;de karıştırılırken katılaşma işlemi için 20 dakika. </li></ol> Aljinat Capsule&#39;lerden 3. Tedavi (isteğe bağlı) <ol><li> % 0.05 Alg-Ca-kapsüller inkübe poli-L-lisin (PLL), 37 ° C&#39;de, 5 dakika için çözelti ve% 5 (w / v) CO2. </li><li> HEPES-tamponlu tuzlu su ile yıkama işleminden sonra kapsül, DMEM yüzeyleri üzerindeki elektrik yükü nötralize etmek için% 10 FBS ihtiva eden inkübe. Kaplanmış kapsüller (Şekil 1C) olarak kullanmaktadır. </li><li> 5 dakika boyunca 10 mM EDTA ihtiva eden HEPES-tamponlu tuzlu su içinde kapsül inkübe edin. EDTA ile muamele edilmiş kapsüller boş kapsüller (Şekil 1C) olarak kullanılır. </li></ol> Aljinat Kapsüllerinde 4. Kültür ve toplayın Hücreler <ol><li> 37 ° C ve% 5 CO2 ile çalkalanarak 75 rpm&#39;de kapsüllenmiş hücreleri inkübe10 gün boyunca uygulanır. </li><li> Toplamak ve 10 dakika boyunca CO2, 37 ° C&#39;de, 10 mM EDTA içinde kapsül inkübe ve% 5. 3 dakika boyunca 1000 x g&#39;da santrifüjleme ile PLL muamelesi olmadan aljinat kapsüllerinden hücreleri toplamak. </li><li> 5 dakika boyunca 5,000 × g - aljinat kapsüller PLL ile tedavi ise, yukarı ve aşağı pipetleme on kat yaklaşık 1.000 bir şırınga ve santrifüj bunu bağlı bir iğne ile tarafından Alg-PLL membran bölünürler. İğne çapı kapsül boyutu ve 25 g (260 um) iğnelerin, bu deneyde kullanılan daha düşük olmalıdır (600 um) </li><li> Eğer hücrelerden mRNA örnekleri toplamak istiyorsanız santrifüj sonra, kırık Alg-PLL zarlardan kesinlikle hücre pelet toplamak. Kalan Alg-PLL membranlar muhtemelen mRNA Saflaştırma önler. </li></ol>

<ol><li>Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+production+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large scale production of stem cells and their derivatives.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).</li>
<li>Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+microcarrier+properties+affecting+the+expansion+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+Res%22%5BJournal%5D)">Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).</li>
<li>Schroeder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+lineage+selection+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+stirred+bench+scale+bioreactor+with+automated+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control.</a> Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).</li>
<li>Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agitation+can+induce+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+microcarrier+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%22%5BJournal%5D)">Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures.</a> Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+for+testing+controlled+%C3%9F-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments.</a> Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+morphology%2C+and+pluripotency+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+in+three+different+types+of+alginate+beads+for+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production.</a> Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).</li>
<li>Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vascular+endothelial+growth+factor+functionalized+agarose+to+guide+pluripotent+stem+cell+aggregates+toward+blood+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells.</a> Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Production+of+Embryoid+Bodies+in+Microbeads%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).</li>
<li>Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+Preparation+of+Monodispersed+Calcium+Alginate+Microbeads+in+a+Novel+Microfluidic+System%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Technol%22%5BJournal%5D)">Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System.</a> Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).</li>
<li>Sakai, M. P., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Bioactive+Hydrogel+Capsules+for+The+3D+Expansion+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors.</a> Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+effects+of+secreted+soluble+factor+preserve+better+pluripotent+state+of+embry-+onic+stem+cell+culture+in+a+membrane-based+compartmentalized+micro-bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor.</a> Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+alternative+fate+other+than+default+neuronal+fate+of+embryonic+stem+cells+in+a+membrane-based+two-chambered+micro-+bioreactor+by+cell-secreted+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

<html> Kapsülleme kültürü doğrudan süspansiyon kültürleri ile karşılaştırılabilir. Süspansiyon kültürü kapsülleme yöntemleri daha pluripotent kök hücrelerin büyük miktarlarda elde etmek için basit bir yöntemdir. Bununla birlikte, süspansiyon kültüründe hücrelerin toplanmasını kontrol etmek de zordur. Kapsülleme yönteminde, hücre-çekiş kapsüller sınırlıdır ve bu nedenle de iyi bir şekilde kontrol edilebilir. Önceki bir yayın büyük hücre kümeleri serbest süspansiyon kültüründe 7&#39;de ortaya ise kapsüllenmiş hü...

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPS hücreleri), rejeneratif tıptaki rolleri nedeniyle şu anda yoğun araştırmaların kaynağıdır. Bununla birlikte, doku yenilenmesi için çok miktarda hücre gereklidir. Örneğin, tip 1 diyabetik bir hasta için gereken yaklaşık bir milyar pankreas hücresi1. Bununla birlikte, konvansiyonel çanak kültürü sadece 1 × 105 hücre/cm2 elde edebilir, bu nedenle tip 1 diyabetik bir hastayı tedavi etmek için yeterli kök hücre türevi pankreas hücresi elde etmek için 1m2 kültür alanı gerektirir. Bu nedenle, rejeneratif tıp için mikrotaşıyıcı2 ve süspansiyon kültürü gibi pluripotent kök hücrelerin kitle kültürü için bir sistemin geliştirilmesi gereklidir. Süspansiyon kültürü, umut verici bir kitle kültürü yöntemini temsil eder, ancak insan iPS hücrelerinin doğrudan süspansiyon kültürlerinde hücrelerin agregasyonunu kontrol etmek zordur3. Gerçekten de, asılı hücreler, hücre hasarına3 veya farklılaşmaya4 neden olan kesme stresine maruz kalır.
Hidrojel bazlı kapsülleme araştırması, süspansiyon kültürü ile ilgili sorunları çözmek için yapılmıştır. Hidrojel kapsüllerde, hücreler ortamın akışından korunur. Önceki raporlar, hücresel kapsülleme için agaroz5, PEG6 ve aljinat (Alg) dahil olmak üzere çeşitli hidrojel türlerinin kullanımını belgelemiştir. Alg-Ca hidrojel, hücre kapsüllemesi için en kullanışlı hidrojellerden biridir, çünkü Alg-Ca hidrojel, aljinat çözeltisini birCaCl2 çözeltisine düşürdükten hemen sonra oluşur ve ayrıca enzimler veya şelatlama reaktifleri tarafından kolayca sindirilir. 
Burada, bir koaksiyel nozul kullanarak iPS hücreleri için stabil bir aljinat kapsülleme işlemi oluşturduk. Damlacıklar oluşturmak içinN2 gaz akışını kullanarak, hücreleri yağ gibi diğer reaktiflere ihtiyaç duymadan tek tip kapsüller halinde kapsüllemek mümkündür. Bu yöntemde,N2'nin akış hızı ve hemCaCl2 hem de aljinatın konsantrasyonu, kapsüllerin boyutunu, şeklini ve homojenliğini etkileyen ana çalışma koşullarıdır. Bu rapor, bir yüksek hızlı kamera ve bir mikroskop kullanılarak bu çalışma koşullarının optimizasyonunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Fare embriyosu fibroblast</td><td>Cell Biolabs</td><td>SNL 76/7</td><td></td></tr><tr><td>Fare kaynaklı pluripotent kök hücre</td><td>RIKEN Bio resorce center</td><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM yüksek glikozlu</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>ES nitelikli&nbsp; FBS</td><td>GIBCO 16141079</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibakteriyel Antibiyotikler</td><td>GIBCO</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asit</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>GIBCO</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Lösemi İnhibitör Faktör</td><td>Merck Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>26 G/16 G iğne</td><td>Hoshiseido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml Şırınga</td><td>TERUMO</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum&nbsp; Klorür</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Aljinat</td><td>Wako</td><td>194-09955</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Wako</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin (MW = 15.000 - 30.000)</td> <td>SIGMA</td><td>P7890</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>DOJINDO</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Sylinge pompası</td><td>AS ONE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Hispeed kamera</td><td>nac görüntü teknolojisi</td><td>Memrecam HX-3</td><td></td></tr></tbody></table>

bir koaksiyel memesini kullanma pluripotent kök hücre aljinat encapsulation

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent kök hücreler (PS hücreleri), rejeneratif tıp ve ilaç taramasındaki rolleri nedeniyle yoğun araştırmaların odak noktasıdır. Bununla birlikte, bu uygulamalarda PS hücrelerinin kullanılması için bir kitle kültürü sisteminin geliştirilmesi gerekecektir. Süspansiyon kültürü, PS hücrelerinin seri üretimi için umut verici bir kültür yöntemidir, ancak agregasyonun kontrol edilmesi ve kültür ortamından kaynaklanan kesme geriliminin sınırlandırılması gibi bazı sorunlar hala çözülmemiştir. Bu sorunları çözmek için, bir koaksiyel nozul kullanarak bir kalsiyum aljinat (Alg-Ca) kapsülleme yöntemi geliştirdik. Bu yöntem,N2 gazını birlikte akıtarak kapsüllerin boyutunu kolayca kontrol edebilir. Kontrol edilebilir kapsül çapı 500 μm'den büyük olmalıdır, çünkü çok yüksek bir N2 gazı akış hızı damlacıkların ve dolayısıyla heterojen boyutlu kapsüllerin parçalanmasına neden olur. Ayrıca, düşük bir Alg-Na ve CaCl2 konsantrasyonu, küresel olmayan kapsüllere neden olur. Alg-PLL kaplaması olmayan bir Alg-Ca kapsülü, hücrelerin toplanmasını sağlayarak kolayca çözülse de, Alg-PLL kaplaması olmayan kapsüllerden de potansiyel olarak sızabilirler. Gerçekten de, bir aljinat-PLL kaplaması hücresel sızıntıyı önleyebilir ancak kırılması da zordur. Bu teknoloji, kök hücre nişinin yanı sıra PS hücrelerinin seri üretimini araştırmak için de kullanılabilir, çünkü kapsülleme, hücre dışı matris ve salgılanan faktörlerin konsantrasyonu dahil olmak üzere hücreleri çevreleyen mikro ortamı değiştirebilir.

Protokole 2.5 anda, sınırdışı aljinat çözüm sınırdışı hemen sonra küresel bir şekil (- H Şekil 2A) oluşturur. Süspansiyon 1 L / dak daha düşük bir N2 akış oranı ile dışarı atılır ise, damlacıkların boyutunun düzgün (Şekil 2I) &#39;dir. N2 akışı 1 L / dak daha yüksek olan, ancak, damlacık (Şekil 2G, beyaz ok) ayırır ve damlacıkların boyutu, heterojen (Şekil 2J) olur. Bu göz önüne alındığında, bu yöntem kullanılarak, 500 um&#39;den d...

Pluripotent kök hücreleri (PS hücreleri) bir koaksiyel nozul kullanarak aljinat hidrojel kapsüllerine kapsüllemek için bir yöntem oluşturduk. Bu, hücrelerin aşırı toplanmasını önler ve süspansiyon kültüründeki hücrelerin yaşadığı kesme stresini sınırlar. Teknik, PS hücrelerinin seri üretiminin yanı sıra kök hücre nişi üzerine yapılan araştırmalara da uygulanabilir.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Bu prosedürün genel amacı, kök hücreleri güvenli ve etkili bir şekilde aljinat hidrojel kapsüllere gömmek ve agregasyonu ve mikroçevreyi kontrol etmek için bu kapsüller içinde kültüre etmektir; bu işlem öncelikle filtrelenmiş bir kök hücre süspansiyonu ile bir sodyum aljinat çözeltisinin karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Karışım daha sonra bir şırıngaya aktarılır ve şırınga pompasına yerleştirilmeden önce şırıngaya koaksiyel bir nozül takılır. Ardından, hücre süspansiyonunun eş akışlı azot gazı ile püskürtülmesiyle damlacıklar hazırlanır ve ardından kalsiyum klorür çözeltisi içinde toplanır.Kapsüller, ardından hücresel sızıntıyı önlemek için poli L lizin ile ve enkapsüle edilmiş hücreler döner çalkalama koşullarında kültüre edilmeden önce iç kapsülleri akışkanlaştırmak için EDTA ile işleme tabi tutulur. Son olarak hücreler, EDTA ve membranın fiziksel olarak parçalanması yoluyla kapsüllerden toplanır. Nihayetinde, pluripotent kök hücrelerin aljinat enkapsülasyonu, hücrelerin aşırı derecede kümelenmesini önler ve süspansiyon kültüründeki hücrelerin maruz kaldığı makaslama stresini sınırlar.Bu yöntem, hücrelerin geniş çaplı ekspansiyonu ve transplantasyonu ile kök hücre nişi üzerine araştırmalar gibi biyolojik ve biyomedikal alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hücre enkapsülasyonuna, hücreleri 160 ×g'de üç dakika boyunca santrifüj ettikten sonra metin protokolünde açıklandığı şekilde toplayarak başlayın. İndüklenmiş pluripotent kök hücre veya IPS hücre peletini, HEPES tamponlu salin içinde süspanse ederek ve her resüspansiyondan sonra hücreleri HEPES tamponlu salin ile tekrar süspanse edip üç kez santrifüj ederek yıkayın.Büyük agregatları temizlemek ve böylece nozülün tıkanmasını önlemek için hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Ardından, iki mililitre filtrelenmiş hücre süspansiyonu ile üç mililitre %5 sodyum aljinat çözeltisini karıştırın. %3 sodyum aljinat içinde beş mililitre hücre süspansiyonu elde etmek için hücre yoğunluğu 1 milyon hücre/mililitre'den fazla olmalıdır.Hücre süspansiyonu beş mililitrelik bir şırıngaya toplandıktan sonra, şırıngaya koaksiyel bir nozul takın ve bunları bir şırınga pompasına yerleştirerek koaksiyel nozulun dış iğnesinden azot gazı akışı sağlayın ve hücre süspansiyonunu iç nozuldan dışarı itin. Damlacıkları 250 mililitre %0,5 kalsiyum klorür çözeltisi içinde toplayın ve 60 ila 90 RPM'de karıştırırken dasyon için 10 ila 20 dakika bekleyin. HEPES tamponlu salin ile yıkamanın ardından, toplanan kapsüller çıplak kapsüller olarak kullanılır; kapsülleri işlemek için kalsiyum aljinat kapsülleri ağırlık/hacim oranında %0,05 içinde inkübe edin.Çalkalama ile birlikte 37 °C ve %5 karbondioksit altında beş dakika boyunca poli L lizin çözeltisinde bekletin. Kapsülleri bir tüpe toplayıp HEPES tamponlu salin ile yıkadıktan sonra, %10 FBS içeren DMEM içinde inkübe edin. Yüzeylerindeki elektriksel yükü nötralize etmek için, elde edilen kapsülleri içi boş kapsüller oluşturmak amacıyla kaplı kapsüller olarak kullanın.Kapsülleri 10 millimolar EDTA içeren HEPES tamponlu salyanda beş dakika boyunca inkübe edin. EDTA ile işlem görmüş kapsüller, içi boş kapsüller olarak kullanılır. Enkapsüle edilmiş hücreleri inkübasyonu takiben 10 gün boyunca 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 75 RPM'de çalkalayarak inkübe edin, ardından kapsülleri toplayıp 10 millimolar EDTA içerisinde 37 °C ve %5 karbondioksit altında 10 dakika boyunca inkübe edin.Poly-L-lizin işlemi uygulanmamış alginat kapsüllerinden hücreleri 1000 ×g'de üç dakika boyunca santrifüj ederek toplayın. Alginat kapsüllere poly-L-lizin işlemi uygulandıysa, bir şırıngaya takılı iğne ile yaklaşık 10 kez yukarı-aşağı pipetleme yaparak alginat poly-L-lizin membranını parçalayın. İğne çapı kapsül boyutundan küçük olmalıdır; bu deneyde 25 gauge iğneler kullanılmıştır.1000 ile 5,000 ×g arasında beş dakika boyunca santrifüjlemeden sonra, hücre peletini parçalanmış aljinat poli-L-lizin membranlardan titizlikle toplayın. Hücrelerden mRNA örnekleri toplanıyorsa, yüksek hızlı kamera ile gözlemlendiği üzere, kalan aljinat poli-L-lizin membranların mRNA saflaştırmasını engelleyebileceğini unutmayın. Atılan aljinat çözeltisi, atılma işleminden hemen sonra küresel bir şekil alır. Süspansiyon, dakikada bir litreden daha düşük bir nitrojen akış hızıyla atılırsa, damlacıkların boyutu tekdüze olur.Ancak, azot akışı dakikada bir litreden yüksek olduğunda, damlacık parçalanır ve damlacık boyutları heterojen hale gelir. Bu durum nedeniyle, bu yöntemle 500 mikrondan daha küçük damlacıklar hazırlamak zordur. Jelleşme sürecinde, sodyum aljinat damlacıkları kalsiyum klorür çözeltisi içerisinde küresel şeklinde kalsiyum aljinat kapsülleri oluşturur.Buna karşılık, sodyum aljinat konsantrasyonu yeterince yüksek olduğunda, düşük sodyum aljinat konsantrasyonu, kaplama sürecinde sorun teşkil eden küresel olmayan ve düzensiz şekilli kapsüllerin oluşmasına neden olur. Sodyum aljinat konsantrasyonu yeterli olmasa bile, kalsiyum konsantrasyonu artırılarak küresel kapsüller oluşturulabilir. Ancak, kalsiyum klorür konsantrasyonunun çok yüksek olması hücresel büyümeyi ve canlılığı azalttığı için, enkapsülasyon için yaklaşık 50 millimolar kalsiyum klorür uygundur.Kapsüllenmiş hücreler kapsüller içinde büyüyebilir, ancak alginat poli L lizin kaplaması olmayan kapsüllerde hücresel sızıntı meydana gelebilir. Fare IPS hücreleri durumunda, hücreler her bir kalsiyum alginat kapsülünde disk şeklinde agregatlar oluştururken, içi boş kapsüllerde hücreler birbirine yapışarak her kapsülde tek bir küresel agregat oluşturur. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin boyut kontrollü bir şekilde nasıl kapsülleneceği ve kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Herhangi bir özel ekipman veya organik absorban kullanmadan hidrojen yakalama.

alginate-encapsulation-pluripotent-stem-cells-using-co-axial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz, sentetik hidrojeller içinde hücreler 3 boyutlu (3D) kapsülleme için protokolleri mevcut. Kapsülleme işlemi kapsüllü hücre davranışlarını değerlendirmek için iki yaygın olarak kullanılan çapraz bağlanma yöntemleri (michael-tipi hafif başlatılan ek ve serbest radikal mekanizmaları) yanı sıra bir dizi teknik özetlenmiştir.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

Biz endoderm ve dopaminerjik (DA) nöronlara yayılması ve embriyonik kök hücrelerin farklılaşması için etkili bir 3D platform olarak bir mikroenkapsülasyon tekniği optimize etmiş. Ayrıca nakli sırasında ana hücreleri bağışıklık izolasyonu için bir fırsat sağlar. Bu platform, diğer hücre türleri için adapte edilebilir.

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Hücre ve parçacıkların eylemsizlik sıralamayı kümil potasyum başlatıcısı varlığında damla nesil birleştirerek, biz kHz fiyatlara tek bir damla hücre veya parçacıkların İstediğiniz bir numarayı kapsüllemek için bir yöntem tarif. Biz iki kez tek ve çift-parçacık damla sırasız encapsulation geçecek verimlilik göstermektedir.

Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Burada, karın içi yağ dokusunda ısı üretimi için lipitleri tüketen ve obez farelerde enerji dağılımını artıran katabolik hücrelerin kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Bu protokol, kazınmış topografik kılavuz ipuçlarını hidrojel biyomürekkebi taşıyan bir hücrenin hassas birikimiyle birleştiren otomatik bir robotik biriktirme sistemi kullanan bir biyo-baskı metodolojisini açıklar. Basılı hücreler doğrudan kazınmış özelliklere iletilir ve onlarla birlikte algılayabilir ve yönlendirebilir.

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

Bu video ve el yazması memeli hücrelerini basit bir karıştırma teknesi kullanarak büyük partiler halinde üretilebilen% 0.5 ila% 10 aljinat boncuklar halinde kapsüllemek için emülsiyon temelli bir yöntemi tarif eder. Kapsüllenmiş hücreler, hücresel terapi uygulamaları için in vitro kültürlenebilir veya nakledilebilir.

Alginat Boncuklarda Memeli Hücre Kapsüllenmesinin Basit Bir Karıştırılmış Geminin Kullanımı

Burada sunulan bir basit kullanımlı, çekirdek / kabuk, üç boyutlu biyobaskı kurulum içi boş iskeleler, vasküler ve diğer borulu yapıların doku mühendisliği için uygun tek adımlı imalatı için.

Boru yapıları doku mühendisliği için Çekirdek / kabuk Baskı İskeleler

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Bu makalede, insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) koaksiyel akış odaklama cihazı kullanılarak kapsüllenmesi açıklanmaktadır. Bu mikroakışkan kapsülleme teknolojisinin hPSC sferoidlerinin verimli bir şekilde oluşturulmasını sağladığını gösteriyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Sferoidlerini Taşıyan Core-Shell Mikrokapsüllerinin Mikroakışkan İmalatı

Mevcut protokol, 3D baskılı damga benzeri bir cihaz kullanarak uygun maliyetli bir şekilde büyük ölçekte doku sferoidleri üretmek için bir tekniği açıklamaktadır.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Bu çalışma, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris kompozitleri içindeki nöral kök hücrelerin serbest biçimli gömülü 3D baskısı için bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, birbirine bağlı insan sinir dokusu yapılarının yüksek doğrulukla programlanabilir modellenmesini sağlar.

İnsan Nöral Yapılarının Gömülü 3D Baskısı için Mikrojel-Hücre Dışı Matris Kompozit Desteği

Öğrenin koaksiyal meme kullanarak pluripotent kök hücreleri aljinat hidrojel kapsüllere kapsüllendirme yöntemini. Bu teknik hücre kümelenmesini ve kayma gerilimini azaltarak kütle üretim ve kök hücre niş araştırmaları için uygundur.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Daha fazla video keşfet