Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Bu prosedürün genel amacı, kök hücreleri güvenli ve etkili bir şekilde aljinat, hidrojel kapsüllere gömmek ve bunları kontrol etmek için kapsüller içinde kültürlemektir. Agregasyon ve mikroçevre için bu, önce filtrelenmiş bir kök hücre süspansiyonu ve bir sodyum aljinat çözeltisinin karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Karışım daha sonra bir şırıngaya aktarılır ve bir şırınga pompasına yerleştirilmeden önce şırınga üzerine bir koaksiyel nozul takılır. Daha sonra, damlacıklar, hücre süspansiyonunun birlikte akan nitrojen gazı ile dışarı atılması, ardından toplama ve kalsiyum klorür çözeltisi ile hazırlanır.

Kapsüller daha sonra hücresel sızıntıyı önlemek için poli L lizin ve kapsüllenmiş hücreleri döner çalkalama koşulunda kültürlemeden önce iç kapsülleri akışkanlaştırmak için EDTA ile muamele edilir. Son olarak, hücreler EDTA ve zarın fiziksel olarak yok edilmesi ile kapsüllerden toplanır. Sonuç olarak, pluripotent kök hücrelerin aljinat kapsüllenmesi, hücrelerin aşırı derecede toplanmasını önler ve süspansiyon kültüründeki hücrelerin yaşadığı saf stresi sınırlar.

Bu yöntem, hücre naklinin büyük ölçüde genişletilmesi ve kök hücre nişi üzerine araştırmalar gibi biyolojik ve biyomedikal alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Üç dakika boyunca 160 kez G'de santrifüjlemeyi takiben metin protokolünde açıklandığı gibi hücreleri toplayarak hücre kapsüllemeye başlayın. İndüklenmiş pluripotent kök veya IPS hücre peletini Resus ile yıkayın, resustan sonra üç kez tamponlu salin ve santrifüjleme yığınlarında süspanse edin, hücreleri ve tamponlu salin yığınlarını süspanse edin.

Aksi takdirde nozulu tıkayabilecek büyük agregaları çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Daha sonra, iki mililitre filtrelenmiş hücre süspansiyonu ve üç mililitre% 5 sodyum aljinat çözeltisini karıştırın. % 3'te beş mililitrelik bir hücre süspansiyonu elde etmek için, sodyum aljinat hücre yoğunluğu mililitre başına 1 milyondan fazla hücredir.

Hücre süspansiyonunu beş mililitrelik bir şırıngaya topladıktan sonra, şırıngaya bir koaksiyel nozul takın ve bunları bir şırınga pompasına yerleştirin, koaksiyel nozulun dış iğnesinden nitrojen gazı akışı yayar ve hücre süspansiyonunu iç nozuldan dışarı atar. Damlacıkları 250 mililitre% 0.5 kalsiyum klorür çözeltisine toplayın ve 60 ila 90 RPM'de karıştırırken 10 ila 20 dakika bekleyin. Yığın tamponlu tuzlu su ile yıkandıktan sonra, toplanan kapsüller, kapsülleri hacim başına% 0.05 ağırlıkta% 0.05 oranında kalsiyum aljinat kapsüllerini inkübe etmek için çıplak kapsüller olarak kullanılır.

37 santigrat derecede beş dakika boyunca poli L lizin çözeltisi ve% 5 karbondioksit çalkalanarak. Kapsülleri bir tüpe topladıktan ve yığın tamponlu salinle yıkadıktan sonra,% 10 FBS içeren DMEM'de inkübe edin. Yüzeylerindeki elektrik yükünü nötralize etmek için, elde edilen kapsülleri içi boş kapsüller oluşturmak için kaplanmış kapsüller olarak kullanın.

Kapsülleri, 10 milimolar EDTA içeren tamponlu tuzlu su birikintilerinde beş dakika boyunca inkübe edin. EDTA ile muamele edilmiş kapsüller içi boş kapsüller olarak kullanılır. Kapsüllenmiş hücreleri 75 RPM'de 37 santigrat derecede çalkalama ve% 5 karbondioksit inkübasyonunu takiben 10 gün boyunca inkübe edin, kapsülleri toplayın ve 37 santigrat derecede 10 milimolar EDTA ve% 5 karbondioksitte 10 dakika inkübe edin.

Hücreleri, üç dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleme ile poli l lizin muamelesi olmadan aljinat kapsüllerinden toplayın. Aljinat kapsülleri poli L lizin ile muamele edilirse, bir şırıngaya bağlı bir iğne ile yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek aljinat poli L lizin zarını kırın. İğne çapı kapsül boyutundan daha düşük olmalıdır ve bu deneyde 25 gauge iğne kullanılmıştır.

Beş dakika boyunca 1000 ila 5.000 kez G'de santrifüjlemeden sonra, hücre peletini kesinlikle kırık aljinat poli L lizin zarlarından toplayın mRNA örnekleri hücrelerden toplanırsa, kalan aljinat poli L lisin zarlarının, yüksek hızlı bir kamera tarafından görselleştirildiği gibi mRNA saflaştırmasını önleyebileceğini unutmayın. Dışarı atılan aljinat çözeltisi, atıldıktan hemen sonra küresel bir şekil oluşturur. Süspansiyon dakikada bir litreden daha düşük bir nitrojen akış hızı ile dışarı atılırsa, damlacıkların boyutu eşittir.

Bununla birlikte, nitrojen akışı dakikada bir litreden yüksekse, damlacık parçalanır ve damlacıkların boyutu heterojen hale gelir. Bu göz önüne alındığında, bu yöntemi kullanarak 500 mikrondan daha küçük damlacıklar hazırlamak zordur. Jelleşme işleminde, sodyum aljinat damlacıkları, kalsiyum klorür çözeltisi içinde küresel şekilli kalsiyum aljinat kapsülleri oluşturur.

Bununla birlikte, sodyum aljinat konsantrasyonu yeterince yüksekse, düşük sodyum aljinat konsantrasyonu, kodlama sürecinde bir sorun olan kapsüllerin nons, küresel ve nonoo şekline neden olur. Sodyum aljinat konsantrasyonu yeterli olmasa bile, kalsiyum konsantrasyonu artırılarak küresel kapsüller oluşturulabilir. Bununla birlikte, kapsülleme için yaklaşık 50 milimolar kalsiyum klorür uygundur, çünkü çok yüksek, bir kalsiyum klorür konsantrasyonu hücresel büyümeyi ve canlılığı azaltır.

Kapsüllenmiş hücreler kapsüllerde büyüyebilir, ancak aljinat poli L lizin kaplaması olmayan kapsüllerde hücresel sızıntı meydana gelebilir. Fare IPS hücreleri söz konusu olduğunda, hücreler her bir kalsiyum aljinat kapsülünde disk şeklinde agregalar oluştururken, hücreler bir araya toplanır ve her içi boş kapsülde tek küresel agregalar oluşturur. Bu videoyu izledikten sonra, hücreleri boyut kontrolüne nasıl kapsülleyeceğinizi ve kültürleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Hidrojen, herhangi bir özel ekipman olmadan, organik emici olmadan yakalar.