Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, farmakolojik ajanlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişimleri ölçmektir. Taze olarak izole edilmiş glomerulusun bir parçası olan podositlerde bazal kalsiyum seviyelerini tahmin edin ve bireysel kanal aktivitesini değerlendirin. Bu işlem, öncelikle abdominal aorta üzerinden yıkama yaparak sıçan böbreklerindeki kanın temizlenmesiyle gerçekleştirilir.

Ardından, böbrekler hasat edilir ve böbrek korteksi izole edilip bir jiletle ince parçalara ayrılır. Üçüncü adımda, kortikal glomerüller diferansiyel santrifüjleme ile izole edilir. Sonrasında, izole edilen dekapsüle glomerüllere ya elektrofizyolojik deneyler uygulanabilir ya da floresan boyalarla yüklenerek konfokal kalsiyum konsantrasyon ölçümleri için alınabilir.

Nihayetinde, bu prosedürler araştırmacıların çeşitli ajanların uygulanmasına yanıt olarak hücre içi kalsiyum yönetimindeki akut değişimleri çözümlemelerini ve tekil iyon kanalları düzeyinde kalsiyum iletkenliğini değerlendirip manipüle etmelerini sağlar. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, podositleri izole edilmiş tüm glomerulusun bir parçası olarak incelememize olanak tanımasıdır. Hazırladığımız düzenek, podositlerin fonksiyonel potansiyelini korur.

Kılcal damarlara tutunmaya devam ederler ve glomerüler filtrasyon aparatının ana kısımlarını koruyabilen ortamdaki homeostaza katılırlar. Bu tekniğin uygulaması, farmakolojik taramalarımızı genişletmektedir. Normal ve patolojik durumlarda, podositlerin kalsiyum yönetme mekanizması; diyabetik nefropati, fokal segmental glomerüloskleroz veya hipertansiyon gibi hastalıklarda renal komplikasyonların gelişimi ve önlenmesinde temel bir düzenleyici rol oynar. Bu hücrelerdeki kalsiyum girişinin ilaçlara karşı verdiği yanıtın gözlemlenmesi ve bunun kolaycale taranabilmesi büyük önem taşımaktadır.

Bu hazırlıkta, VLA Hunka sonraki prosedürler için böbreğin nasıl yıkanacağını gösterecektir. Glomeruli izolasyonunu ve V klempli elektrofizyolojiyi göstereceğim ve Dr. GaN size konfokal kalsiyum görüntüleme konusunda rehberlik edecek. Bu prosedüre başlamak için, anestezi uygulanmış bir sıçanı sıcaklık kontrollü cerrahi masaya yerleştirin. Mikroskop altında, Vena Cava ve aortu açığa çıkarmak için karın bölgesinde orta hat üzerinden bir insizyon yapın.

Ardından, çölyak ve superior mezenterik arterlerin çevresine ve bunların üzerindeki abdominal aortaya ligatür yerleştirin. Renal arterlerin altındaki abdominal aortayı künt diseksiyonla açın. Daha sonra buraya iki ligatür yerleştirin ancak bağlamayın.

Aortu ligatürlerin üzerinden klempleyerek alt ipi bağlayın. Ardından, klembin alt kısmından, PBS ile doldurulmuş bir şırınga pompasına bağlı polietilen bir tüp ile aortu kateterize edin ve kateteri ikinci bir ligatürle sabitleyin. Sonrasında klembi kaldırın ve onları ligatürleyin.

Enterik ve çölyak arterleri belirleyin. Aortayı, dakikada altı mililitre hızla üç dakika boyunca önceden soğutulmuş PBS ile infüze edin. Aynı zamanda, basıncı düşürmek için renal venlerin yakınındaki vena cava'da bir insizyon yapın.

Üç dakika sonra perfüzyonu durdurun, böbrekleri çıkarın ve kapsülleyin. Böbrekleri buz üzerinde PBS solüsyonuna yerleştirin. Şimdi RPMI 1640 ortamında 30 mililitre taze %5BSA hazırlayın.

Bir jilet ve makas kullanarak her iki böbreğin korteksini izole edin, ardından homojen hale gelene kadar MIT uygulayın. Sonra, kıyılmış dokuyu %5 P-S-A-R-P-M-I çözeltisinde önceden bekletilmiş 100 mesh paslanmaz çelik bir süzgeçten geçirin. Akışla gelen kısmı toplayın ve 140 mesh bir süzgeçten geçmesine izin verin.

Ardından, 140 mesh elekten toplanan akışı önceden ıslatılmış 200 mesh bir elek kullanarak süzün. Filtratı atın ve üstteki eleği 10 ila 15 mililitre hazırlanmış B-S-A-R-P-M-I çözeltisi ile yıkayıp glomerülleri eleğin üst kısmından toplayın. Daha sonra, G Glomerülleri içeren B-S-A-R-P-M-I çözeltisini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve glomerüllerin tüpün dibine çökmesi için 20 dakikaya kadar bekletin.

Bu prosedürde, beş tarafından beş milimetrelik lamine cam chipleri 70.000 ile 150.000 moleküler ağırlığındaki polilizin ile kaplayın ve ısıtılmış bir plaka üzerinde kurutun. Ardından, deney çözeltilerini oda sıcaklığına getirin ve patch clamp haznesini ile pipeti doldurun. Glomeruli içeren çözeltiyi nazikçe karıştırın. Daha sonra, bu çözeltiden yaklaşık 50 µL miktarını her bir polilizin kaplı lamine cam chip'e uygulayın.

Ardından, glomerülleri içeren cam çipleri, Beth solüsyonu ile önceden doldurulmuş olan patch clamp haznesine taşıyın. Hücre iliştirilmiş (cell attached) modunda konvansiyonel patch clamp kaydı gerçekleştirmeden önce, yapışmamış glomerülleri uzaklaştırmak için hazneyi bir dakika boyunca dakikada 3 mL hızla perfüze edin.

Şimdi, her bir 0,5 mililitrelik konik tüpe 500 µL glomeruli fraksiyonu yerleştirin ve kalsiyum boyaları olan pure red AM ve fluo-4 AM ekleyin. Ardından, tüpleri oda sıcaklığında bir saate kadar döner çalkalayıcıya yerleştirin. Bu sırada, lam üzerine kapatılacak cam örtüleri polylysine ile hazırlayın ve 70 °C'deki ısıtma plakasında kurumaya bırakın. Kalsiyum boyalarının yüklemesi tamamlandığında, polylysine kaplı örtülerin üzerine glomeruli içeren çözeltiden 100 µL uygulayın ve yüzeye yapışmaları için yaklaşık beş dakika bekleyin.

Ardından, glomerüllerin yapıştığı lamelleri bir görüntüleme haznesine yerleştirin ve yapışmamış glomerülleri ve kalan boyaları uzaklaştırmak için dakikada 3 mL hızla banyo çözeltisi ile perfüzyon uygulayın. Sonrasında, konfokal lazer tarama mikroskobunu 488 nanometre uyarım dalga boyuna ayarlayın. Ardından görüntüleme yazılımını istenen frekans ve çözünürlüğe ayarlayın.

Ardından, glomerülleri parlak alanda bulun. Sonrasında floresan sinyalinin tespitini açın. Bundan sonra, istenen bir odak düzlemi seçin ve flu oh four ve firo red kanallarındaki floresan yoğunluğunu kontrol edin.

Glomerülün brightfield görüntüsünde net bir şekilde görüldüğünden emin olun. Ardından, flu oh four ve furor red sinyalleri için floresan yoğunluğundaki değişiklikleri kaydedin. Görüntü dizisini aktarmak için kanalları ayırın ve hyper stack gri tonlama modunu kullanın.

Image J yazılımında, analiz araçları (analyze tools), ROI Yöneticisi (ROI Manager) yolunu izleyerek bir ROI yöneticisi penceresi açın. Oval seçim aracını ve ROI yöneticisindeki ekle T (add T) işlevini kullanarak bir veya daha fazla ilgi bölgesi seçin. Ardından arka plandaki alanı seçin ve seçilen ROI'leri kaydedin.

Ardından, diyalog penceresindeki dilim başına bir satır kutucuğunu işaretleyin ve menü seçenekleri sonuçlarından tamam'a tıklayın. Ölçümleri ayarlayın. Ortalama gri değeri seçeneğini belirleyin ve her ROI için piksel yoğunluk değerlerini hesaplayın; bu değerler sonuçlar penceresinde ayrı sütunlar halinde görüntülenecektir.

Ardından, her bir ROI için ölçülen ROI yoğunluk değerlerini her kanal için tercih edilen veri analiz yazılımına kopyalayın ve her zaman noktası için her veri noktasından arka plan yoğunluk değerlerini çıkarın. Fluo-4 ile URA red kanallarının yoğunluk oranını hesaplayın ve ardından her bir ROI için kalsiyum transiyentinin zamanla değişimini grafiğe dökün. Bu görüntü, sıçan glomerulü yüzeyindeki oksit gövdeye takılmış patch clamp pipetini göstermektedir.

Elektrofizyolojik kayıt sırasında, görüntünün sağ alt köşesinde kapsüllenmiş glomerulün bir kısmı görülebilir. Burada, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu ölçmek için podosit üzerinde yapılan hücre bağlantılı (cell-attached) patch işleminden elde edilen, TRP benzeri kanal aktivitesine ait temsili bir akım izi yer almaktadır. Hücre içi kalsiyumu işaretlemek için glomeruller Fluo-4 AM ile yüklenmiştir.

Bu video, CIN ve manganez klorürün glomerüllerdeki kalsiyum girişine etkilerini göstermektedir. Bu grafik, CIN ve manganez klorüre yanıt olarak tek bir podositten kaydedilen flu oh four sinyal yoğunluğundaki değişimleri nicelleştirmektedir. Beklendiği üzere, CIN maksimum floresan miktarını üretirken, manganez klorür boyayı söndürerek en düşük floresan yoğunluğuna neden olmaktadır.

Bu ilaçların uygulanması, araştırmacının daha sonra hücre içindeki kesin kalsiyum konsantrasyonunu belirlemesine olanak tanır. Bu video, 10 micromole a TP'nin glomerüllerdeki kalsiyum konsantrasyonu üzerindeki etkisini göstermektedir. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki artışı temsil eden, yeşil flu O four floresansında bir artış ve kırmızı fu red floresansında bir düşüş olduğuna dikkat edin.

Bu teknik, farmakolojik tedaviler veya diğer manipülasyonlar sonrası, tek iyon kanalı ve bireysel hücre düzeyinde kalsiyum girişindeki değişiklikleri izlemek için benzersiz bir fırsat sunar. Bu nedenle, mevcut çok sayıda genetiği değiştirilmiş kemirgen modeli göz önüne alındığında, bu yaklaşım oldukça güçlü bir araçtır. Bu videoyu izledikten sonra, podositlerde kalsiyum ölçümlerinin nasıl yapılacağının yanı sıra, hem tek başına hem de birlikte kullanılan elektrofizyolojik voltaj klemp deneylerinin nasıl yürütüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu teknikler, normal ve patolojik koşullarda podositlerdeki kalsiyum yönetiminin düzenlenmesine ilişkin derinlemesine ve mekanistik bir anlayış sağlar.