Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, farmakolojik ajanlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişikliklerini ölçmektir. Bazal kalsiyum seviyelerini tahmin edin ve taze izole edilmiş glomerulusun bir parçası olarak podositlerdeki bireysel kanal aktivitesini değerlendirin. Bu, ilk olarak abdominal aort yoluyla yıkanarak sıçan böbreklerinden kanın temizlenmesiyle gerçekleştirilir.

Daha sonra böbrekler alınır ve böbrek korteksi izole edilir ve bir jiletle kıyılır. Üçüncü adımda, kortikal glomerüller diferansiyel cing ile izole edilir. Daha sonra, izole edilmiş dekapitasyonlu glomerüller ya elektrofizyolojik deneylere tabi tutulabilir ya da floresan boyalarla yüklenebilir ve konfokal kalsiyum konsantrasyonu ölçümleri için alınabilir.

Sonuç olarak, bu prosedürler, araştırmacıların çeşitli ajanların uygulamalarına yanıt olarak hücre içi kalsiyum işlemesindeki akut değişiklikleri çözmelerini ve tek iyon kanalları düzeyinde kalsiyum iletkenliğini değerlendirmelerini ve manipüle etmelerini sağlar. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, podositleri tüm izole glomerulusun bir parçası olarak incelememize izin vermesidir. Hazırlığımız podositlerin fonksiyonel potansiyelini korur.

Kılcal damarlara bağlı kalırlar ve glomerül filtrasyon aparatının ana kısımlarını gerçekten koruyabilen ortamda homeostaza katılırlar. Bu tekniğin anlamı farmakolojik taramamızı genişletir: Normal ve patolojik durumlarda, podositler tarafından kalsiyum işleme mekanizması, diyabetik nefropati, fokal segment omeroskleroz veya hipertansiyon gibi hastalıklarda böbrek komplikasyonlarının gelişiminde ve önlenmesinde önemli bir düzenleyici rol oynar. Bu hücrelerdeki kalsiyum akımının ilaçlara ne kadar duyarlı olduğunu gözlemlemek büyük önem taşır ve bu ilaçlar kolayca taranabilir.

Bu hazırlıkta, VLA Hunka aşağıdaki prosedürler için böbreğin nasıl yıkanacağını gösterecektir. Glomerül izolasyonu ve V kelepçe elektrofizyolojisini göstereceğim ve Dr.GaN size konfokal kalsiyum görüntülemede rehberlik edecek. Bu işleme başlamak için, sıcaklık kontrollü ameliyat masasına anestezi uygulanmış bir sıçan yerleştirin Mikroskop altında, damar CVA'sını ve aortu ortaya çıkarmak için karın üzerinde orta hat kesisi yapın.

Daha sonra, ligatürü çölyak ve superior mezenterik arterlerin etrafına ve bunların üzerine abdominal aortu yerleştirin. Künt, abdominal aortu renal arterlerin altında inceleyin. Sonra etrafına iki bitişik harf yerleştirin, ancak bağ kurmayın.

Aortu ligatürlerin üzerine sıkıştırın ve alt ipliği bağlayın. Bundan sonra, aortu kelepçenin altında PBS ile doldurulmuş bir şırınga pompasına bağlı bir polietilen boru ile kateterize edin ve kateteri ikinci bir bağ ile sabitleyin. Ardından kelepçeyi çıkarın ve bağlayın.

Ben enterik ve çölyak arterler. Aortu önceden soğutulmuş PBS ile dakikada altı mililitre hızında üç dakika boyunca infüze edin. Aynı zamanda, basıncı azaltmak için böbrek damarlarının yakınındaki kava damarında bir kesi yapın.

Üç dakika sonra perfüzyonu durdurun, böbrekleri eksize edin ve kapsülleyin. Onları buz üzerinde PBS çözeltisine yerleştirin. Şimdi RPMI 1640 ortamında 30 mililitre taze %5 BSA hazırlayın.

Bir tıraş bıçağı ve makas kullanarak, her iki böbreğin korteksini izole edin, ardından homojen olana kadar MIT yapın. Daha sonra, kıyılmış dokuyu %5 P-S-A-R-P-M-I çözeltisine önceden batırılmış 100 gözenekli paslanmaz çelik elekten geçirin. Akışı toplayın ve 140 gözenekli bir sistemden geçmesine izin verin.

Daha sonra, önceden ıslatılmış 200 gözenekli bir siv kullanarak 140 gözenekli elekten toplanan akışı filtreleyin. Süzüntüyü atın ve üst eleği hazırlanan B-S-A-R-P-M-I çözeltisinden 10 ila 15 mililitre ile yıkayın ve elek üstünden glomerülleri toplayın. Daha sonra G Glomeruli içeren B-S-A-R-P-M-I çözeltisini 15 mililitrelik, iki bonlu buza yerleştirin ve glomerül tortusunu tüpün dibinde 20 dakikaya kadar bırakın.

Bu prosedürde, moleküler ağırlıklı, 70.000 ila 150.000 polilizin ile beş ila beş milimetre kapak cam yongalarını kaplayın ve ısıtılmış bir plaka üzerinde kurutun. Daha sonra, deneysel çözeltileri oda sıcaklığına ısıtın ve yama kelepçesi haznesini doldurun ve pipeti Glomerül içeren çözeltiyi yavaşça karıştırın. Daha sonra her bir polilisin kaplı kapak camına yaklaşık 50 mikrolitre uygulayın.

Bundan sonra, glomerüllü cam yongalarını yama kelepçesi odasına taşıyın. Beth çözeltisi ile önceden doldurulmuş. Hücreye bağlı modda geleneksel yama kelepçesi kaydını gerçekleştirmeden önce, bağlanmamış glomerülleri çıkarmak için odayı bir dakika boyunca dakikada üç mililitre hızında perfüze edin.

Şimdi her 0,5 mililitrelik konik tüpe 500 mikrolitre glomerül fraksiyonu yerleştirin ve kalsiyum boyaları, saf kırmızı ve grip oh 4:00'yi ekleyin. Ardından, tüpleri oda sıcaklığında bir saate kadar dönen bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Daha sonra polilisin ile cam kapak fişlerini hazırlayın ve ısıtılmış plaka üzerinde 70 santigrat derecede kurumaya bırakın. Kalsiyum kalıplarının yüklenmesi tamamlandıktan sonra, polilisin kaplı örtü fişlerine 100 mikrolitre glomerül içeren solüsyon uygulayın ve yaklaşık beş dakika yüzeye yapışmalarına izin verin.

Daha sonra glomerüllere bağlı kapak fişlerini bir görüntüleme odasına monte edin ve bağlanmamış glomerülleri ve kalan boyaları çıkarmak için dakikada üç mililitre hızında banyo solüsyonu ile perfüze edin. Daha sonra, konfokal lazer tarama mikroskobunu 488 nanometre uyarma dalga boyuna ayarlayın. Ardından görüntüleme yazılımını istediğiniz frekansa ve çözünürlüğe ayarlayın.

Ardından, brightfield'daki glomerülleri bulun. Ardından, floresan sinyalinin algılanmasını açın. Bundan sonra, istediğiniz bir odak düzlemini seçin ve grip oh dört ve firo kırmızı kanallarındaki floresan yoğunluğunu kontrol edin.

Glomerulusun parlak alanda açıkça görüldüğünden emin olun. Ardından grip, oh four ve furor kırmızı sinyalleri için floresan yoğunluğundaki değişiklikleri kaydedin. Görüntü sırasını içe aktarmak için kanalları bölün ve hiper yığın gri tonlama modunu kullanın.

Image J yazılımında, analiz araçları, ROI Yöneticisi yolunu izleyerek bir ROI yöneticisi penceresi açın. Oval bir seçim aracını ve ROI yöneticisindeki T ekle işlevini kullanarak bir veya daha fazla ilgi alanı seçin. Ardından arka plandaki alanı seçin ve seçilen ROI'leri kaydedin.

Ardından, iletişim kutusundaki dilim kutusu başına bir satırı işaretleyin ve menü seçenekleri sonuçlarında Tamam'ı tıklayın. Ölçümleri ayarlayın. Ortalama gri değeri seçin ve sonuçlar penceresinde ayrı sütunlarda görüntülenecek olan her bir ROI için piksel yoğunluğu değerlerini hesaplayın.

Her ROI için, daha sonra her kanal için ölçülen ROI yoğunluk değerlerini tercih edilen veri analizi yazılımına kopyalayın ve her zaman noktası için her veri noktasından arka plan yoğunluk değerlerini çıkarın. Bu grafikten sonra grip oh dört yoğunluğunun URA kırmızı kanallarına oranını hesaplayın, her bir ROI için kalsiyumun geçici nokta zaman değişiklikleri. Bu görüntü, sıçan glomerulusunun yüzeyindeki oksit gövdesine bağlı yama kelepçesi pipetini göstermektedir.

Elektrofizyolojik bir kayıt sırasında, görüntünün sağ alt köşesinde kapsüllenmiş glomerulusun bir kısmı görülebilir. Burada, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu ölçmek için podosit üzerinde yapılan hücreye bağlı bir yamadan tripy benzeri kanal aktivitesinin temsili bir akım izi bulunmaktadır. Glomerüller, hücre içi kalsiyumu etiketlemek için sabah 4:00'te grip ile yüklenir.

Bu video, CIN ve manganez klorürün glomerüllerdeki kalsiyum akışı üzerindeki etkilerini göstermektedir. Bu grafik, CIN ve manganez klorüre yanıt olarak tek bir podositten kaydedilen grip oh dört sinyal yoğunluğundaki değişiklikleri ölçer. Beklendiği gibi, CIN maksimum floresan üretir ve manganez klorür boyayı söndürür ve en düşük floresan yoğunluğu ile sonuçlanır.

Bu ilaçların uygulanması, araştırmacının daha sonra hücre içindeki tam kalsiyum konsantrasyonunu tanımlamasına izin verir. Bu video, 10 mikromol a TP'nin glomerüllerdeki kalsiyum konsantrasyonu üzerindeki etkisini göstermektedir. Yeşil grip O dört floresansında bir artış ve kırmızı fu kırmızı floresansında bir düşüş olduğunu ve bu da hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun artmasına neden olduğunu unutmayın.

Bu teknik, farmakolojik tedaviler veya diğer manipülasyonlardan sonra tek iyon kanalında ve tek tek hücreler düzeyinde kalsiyum akışındaki değişiklikleri izlemek için eşsiz bir fırsat sunar. Bu nedenle, bu yaklaşım, mevcut birden fazla genetik olarak değiştirilmiş kemirgen modelini göz önünde bulundurarak çok güçlü bir araçtır. Bu videoyu izledikten sonra, podositlerde kalsiyumasyon ölçümlerinin nasıl yapılacağı ve aynı zamanda kendi başına kullanılan elektrofizyolojik klempler deneyleri hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu teknikler, normal ve patolojik koşullarda podositlerle kalsiyum işlemenin düzenlenmesine derinlemesine ve mekanik bir bakış açısı sağlar.