Name: Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Keşfedin yüksek verimli kalsiyum görüntüleme yöntemini, taze izole glomerulusların podositlerinde iyon kanalı aktivitesini gerçek zamanlı izlemek için. Bu teknik böbrek fonksiyonu ve hastalık mekanizmalarını anlamada ileri düzeyde bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar mikroskobu deneyleri ile mükemmel teknik yardım için Glen Slocum (Wisconsin Tıp Koleji) ve Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) teşekkür etmek istiyorum. Gregory Blass yazının kritik redaksiyon için kabul edilmektedir. Bu araştırma (AS) 1-15-BS-172, ve (DVI) Nefroloji American Society Ben J. Lipps Araştırma Bursu hibe Sağlık hibe HL108880 ve American Diabetes Association Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Hayvan kullanımı ve refah Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokoller aşağıdaki Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu&#39;na uygun olmalıdır. 1. Böbrek Gömme <ol><li> (Ancak farklı yaş ve cinsiyet diğer suşları uygun değişikliklerle kullanılabilir, bir Sprague Dawley suşu olan önerilen) 8 ila 12 haftalık erkek sıçan kullanın. </li><li> IACUC protokolü tarafından izin verilen prosedüre göre hayvan anestezisi; anestezi derinliği izlemek ve hayvan kontrol edin. cerrahi ayrıntılı bir açıklama 1.3 gerçekleştirilebilir göre - 1.8 Ilatovskaya ark bulunabilir 7. </li><li> Uygun anestezi sonrasında, sıcaklık kontrollü cerrahi masaya hayvan koyun (yukarı uzunluğu 3 inç) karın orta hat kesi yapmak ve vena kava ve aorta ortaya çıkarmak. </li><li> Çölyak ve superior mezenterik arterler ve abdominal etrafında bitişik harfleri yerleştirinyukarıda aort; Arter yok. </li><li> Renal arterlerin altında abdominal aorta incelemek ve çevresinde iki bitişik harfler koyun, ancak lige yok künt, daha sonra bitişik harfler üzerinde aorta kelepçe ve alt iplik kravat. </li><li> Kelepçe altında (PBS ile dolu bir şırınga pompası takılı) bir polietilen PE50 boru ile aort kateter ve ikinci dikilen ile kateter düzeltmek; , kelepçe kaldırmak pompa açın ve aorta bağlanır ve çölyak arterler ile mezenterik. Hızla baskıyı hafifletmek için renal ven kesi yapmak. </li><li> / Dakika 6 ml &#39;lik bir oranda, 2 veya 3 dakika için önceden soğutulmuş PBS ile aort infüze. </li><li> Perfüzyon, rüsumat durdurun ve 7 böbrekler açarlar ve PBS çözüm buz üzerine koydu. IACUC tarafından onaylanmış protokole göre hayvan Euthanize. </li></ol> Sıçan glomerulusların 2. izolasyonu <ol><li> RPMI 1640 içinde% 5 BSA, taze çözelti 30 ml hazırlayın. </li><li> Bir jilet ve makas kullanarak,Her iki böbreğin korteks izole ve ardından homojen hale gelinceye kadar kıyma. Bu prosedür, önceki 7 tarif edilmiştir. </li><li> 100 gözlü paslanmaz çelik elek içinden geçen aşaması esnasında kıyılmış doku itin bir spatula kullanılarak (BSA / RPMI çözeltisi% 5 önceden ıslatılmış). Akış ve yer çekimi kuvveti ile akış ile 140 ağ elek boyunca geçmesine izin toplayın. </li><li> Bir ön-ıslatılmış 200 gözenekli elek kullanılarak bir elek 140 ağ toplanan akış geçirgen filtre süzüntü atmak ve 10, elek üst yıkama - ilgili tortu glomerül toplamak için hazırlanmış BSA / RPMI çözeltisi 15 ml Elek. </li><li> Kadar 20 dakika boyunca tüpün altındaki glomerüller tortu 15 ml tüp buz üzerinde glomerül BSA / RPMI çözeltisi koyun ve bildirin. Tüpün alt glomerüller konsantre açıkça görülecektir. Tüp içinde yaklaşık olarak 2 ml bırakarak, fazla çözelti çıkarın. </li></ol> 3. Tek kanallı Patch-kelepçe Electrophysiology <ol><li> MW 70.000 ile kaplanarak 5 x 5 mm kapak cam cips hazırlayın - 150.000 poli-ʟ-lizin ve kurumaya bırakın. Kapak cam başına su içinde% 0.01 steril filtre edilmiş çözeltisi, yaklaşık 30 ul kullanın. </li><li> RT deneysel çözümler Isınma ve patch-kelepçe odasını ve pipet doldurun. TrpC kanalları izleme, mM banyo solüsyonu kullanın: 126 NaCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glukoz, pH 7.4; Pipet: 126 NaCl, 1.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glukoz; pH 7.4. <ol><li> Tavsiye çalışmalarda (ilgili olmayan endojen kanal aktivitesini engellemek için pipet solüsyonuna inhibitörleri ekleme vardır: 100 uM niflumik asit ya da DIDS (Ca2 + ile aktive edilen Cı engellemek için - kanalları), 10 mM TEA (inhibe yüksek ölçüde iletkenliğe sahip Ca2 + - bağımlı K + kanalı), 10 nM iberiyotoksin (,) 10 uM nikardipin Ca2 + ile aktive edilen K + kanallarını bloke etmek (N-tipi Ca engellemek2+ doğrudan patch-kelepçe deneyden önce kanalları)). </li></ol></li><li> Yavaşça glomerüller içeren çözüm karıştırmak ve sonra poli-ʟ-lizin kaplı kapak cam cips bunun yaklaşık 50 ul uygulayın. Glomerül yaklaşık 5 dakika süreyle tutunma olsun. </li><li> Patch-kelepçe odasına banyo solüsyonu ile önceden doldurulmuş için glomerül cam cips taşı; serbest glomerül kaldırılmasını sağlamak için 1 dakika için / dakika 3 ml bir oranda bölme serpmek. </li><li> Bir hücre ekli modunda 7 geleneksel bir yama-kelepçe deney. Bir cam pipet ile, (7-10 M? Pipet direnci), bir pipet ve hafif bir emme (izole glomerulus yüzeyi üzerinde bir podosit bağlanmış bir pipet uygulayarak podosit membran arasında yüksek dirençli bir yalıtım oluşturmak ilgili, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi olduğu sol). </li><li> Hücre bağlı ölçümler için, sekiz kutuplu Bessel filtresi ile 300 Hz akımları düşük geçmektedir. </li><li> U6 saat - se kadar 4 için patch-kelepçe deneylerinde glomerüller izole. Buz üzerinde stok glomerüller fraksiyonu tutun. </li></ol> Podositler hücre içi kalsiyum konsantrasyonu 4. oranlı metrik Konfokal floresans ölçümleri <ol><li> Konik tüp, 0.5 ml (2.5 açıklanan) glomerüller fraksiyonu 500 ul yerleştirin ve kalsiyum boyalar Fura Kırmızı, AM ve Fluo-4, AM ekleyin. 2 mm ve (DMSO içinde çözülmüş -20 ° C&#39;de saklayın) Fura Kırmızı, AM ve Flu-4, GM, sırasıyla 1 mM stok konsantrasyonları kullanımı ve glomerüller fraksiyonunun 500 ul her bir boya 2.5 ul kullanın. Hemen boyaların ilave edilmesinden sonra, alüminyum folyo ile tüp kapsamaktadır. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat için en az 20 dakika kadar bir döner çalkalayıcı üzerinde yer borular. Not: Farmakolojik maddeler, bu aşama sırasında eklenebilir. </li><li> Cam lamelleri hazırlanması poli-ʟ-lisin ile kapak ve 70 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı levha seti kullanarak kurutma sağlar. </li><li> Kalsiyum boyalar yükleme komplet sonraE, poli-ʟ-lizin kaplı kapak çözeltiyi içeren glomerül 100 ul uygulamak ve bununla ilgili olarak, 5 dakika için yüzeye dönelim. Bir görüntüleme odasına glomerüller bağlı lamelleri monte edin ve banyo çözeltisi (() mM olarak ihtiva eden: MgCl2 145 NaCl, 4.5 KCl, 2, 10 HEPES, pH 7.35) ile serpmek 3 ml / dk hızda kaldırmak için bekâr glomerüller ve kalan boyalar. </li><li> Bir 488 nm eksitasyon dalga boyu ve radyasyon filtreleri (sırasıyla Fluo-4 ve Fura Red için 525/25 ve 650/25 nm) konfokal lazer tarama mikroskobu ayarlayın. İstediğiniz bir frekans ve çözünürlük görüntüleme yazılımı ayarlayın. </li><li> Aydınlık içinde glomerüller bulun ve sonra floresan sinyalinin tespiti açın. Sinyalin doygunluk önlemek için her boya için lazer yoğunluğunu ayarlar. Doğrudan cama bağlı Podositler ile odak düzlemi seçin. Bu ilaca yanıt olarak bir glomerulus büzülmesiyle kaynaklanan etkiyi en aza indirirUygulama. Seçim glomerulus iyi cama takılı olduğundan çift çek; </li><li> Seçim odak düzlemi görüntüleme başlayın, (yüksek çözünürlüklü görüntü için 60X / NA 1.4 veya benzer objektif lens kullanın. Hızlı Ca 2+ geçici değişiklikleri görmenizi 4 sn set frekans ile 512 x 512 görüntü almak) ilgi ilaçları uygulamak ve yanıtı kaydedin. <ol><li> (Glomerül yüzeyinde Podositler görüntülenmesini sağlamak için, mümkün olduğu kadar camın yüzeyine yakın olarak) arzu edilen bir odak düzlemi seçin. Fluo4 ve FuraRed kanallarda floresan yoğunluğunu kontrol edin ve glomerulus açıkça aydınlık görülür olduğundan emin olun. </li><li> Görüntüleme başlatın. Herhangi bir ilaç uygulamasından önce, bazal floresans rekor en az 1 dakika sinyali (hiçbir ani sivri veya sinyal solma) kararlı olduğundan emin olmak için. </li><li> Bir mikropipet yardımıyla istenilen ilaçları uygulayın; dikkatli olmak ve ilaç iyi diffüz başardı sağlamak ve glomer ulaşmakulus. Gerekirse, seçilen odak düzlemi izlemek ve çünkü ilaç uygulamasının odak dışına taşımak olmadığını kontrol ediniz hafifçe banyo çözüm karıştırın. </li><li> Fluo4 ve FuraRed sinyalleri için flüoresan yoğunluğundaki değişimlerle kaydedin. Kayıt sinyal plato seviyesine ulaştığında veya bir zirveye ulaşır ve daha sonra bazal dönene kadar bekleyerek, yeterince uzun olduğundan emin olun. Gerekirse Çözelti değişiklik ya da başka herhangi bir ilaç ilave gerçekleştirin. </li><li> Kaydı durdurmak ve yazılım özgün biçiminde dosyayı kaydedin. </li></ol></li></ol> Kalsiyum Ölçümleri 5. Görüntü Analizi <ol><li> Yerli ND2 formatındaki görüntüleri içe izin veren ND Programı eklentisi ile donatılmış ImageJ açık yazılım ile görüntü analizi yapın. </li><li> Görüntü dizisi İthalat; Kanal bölmek ve bir hyperstack gri tonlama modu kullandığınızdan emin olun. </li><li> O kadar ImageJ yazılımı analiz → Araçlar → ROI yöneticisi yolunu izleyinkalem ROI yöneticisi penceresi. Oval seçim aracını ve ROI Yöneticisi &quot;Add (t)&quot; fonksiyonunu kullanarak faiz (Podositler) birkaç bölgeleri seçin. Son ROI olarak arka planda alanı seçin; (→ Kaydet fazla) seçilen ROI kaydedin. </li><li> Analizler için seçilen kanalı içeren pencereyi vurgulayın. , YG Yöneticisi Çoklu Ölçüm işlevi → Daha kullanın dışarı çıkar diyalog içinde &quot;tek satır dilim başına&quot; kutusunu işaretleyin ve sonra Tamam &#39;ı tıklatın. seçeneğini ayarlayın Ölçümleri → menü seçeneği Sonuçlar girmek &quot;gri Ortalama değer&quot; ve görüntülenir her ROI için piksel yoğunluğu değerlerini hesaplamak: Sonuçlar Sonuçları penceresinde ayarlanabilir formatında gösterilir Her ROI için ayrı sütunlarda Sonuçları penceresi. </li><li> Tercih veri analiz yazılımı içine her bir kanal (Fluo-4 ve Fura Kırmızı) için ölçülen ROI yoğunluk değerlerini kopyalayın; Her bir DAT dan çıkarma arka plan yoğunluğu değerleribir nokta. </li><li> Her bir zaman noktası için, Fura kırmızı kanallara Flu-4 yoğunluklarının oranı hesaplanır. Plot dağılım / her ROI için Ca 2+ geçici hat noktası zamanı değişir. Seçilen glomeruli için ortalama / SE değerlerini hesaplamak. Not: Zaman sütunu 4,5 seçilen görüntüleme frekansına göre ayarlanması gerekir. </li></ol> Flu-4 Floresan Sinyal kullanma 6. Hücre içi kalsiyum Konsantrasyon Hesaplamaları <ol><li> Glomerulusların bir örneğini alın ve 4.7 adıma deneysel protokol yukarı gerçekleştirin. Eşiğe kaydından sonra banyo çözeltisine ve kayıt floresan yoğunluğu artışı (10 uM olmalıdır banyo odasında nihai konsantrasyon) İyonomisin ekleyin. Yoğunluk maksimuma ulaşır ve çürüme başladığında, MnCI2 eklemek floresan 8 gidermek için (nihai konsantrasyon 5 mM olmalıdır). </li><li> 6.1 elde edilen verileri analiz edin. Elde edilen Flu-4 sinyal ROI yoğunluğu değerleri doğrultusunda kopyalamaTercih analiz yazılımı ile 5,1-5,5 açıklanan protokole. </li><li> Bir formül kullanılarak ROI karşılık gelen Podosit olarak (nM) hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu hesaplayın: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> Kd Fluo-4 (345 nM) sabit, önceden belirlenmiş bir ayrılma olduğu, F (taban) için kalsiyum konsantrasyonunun hesaplanması olan zaman noktasında yoğunluğudur ve F dakika ve Fmax de yoğunluk değerleri (iyonomisin uygulama sonrası) ve (MnCI2) ile flöresan soğutmadan sonra, maksimum kalsiyum yük noktası, sırasıyla, (Şekil 3&#39;e bakınız). </li></ol>

<ol><li>Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+nephrotic+syndrome%3A+connecting+molecular+genetics+to+podocyte+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).</li>
<li>Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+glomerular+barrier+and+mechanisms+of+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria.</a> Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).</li>
<li>Patrakka, J., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+podocytes+in+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of podocytes in proteinuria.</a> Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).</li>
<li>Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+albumin+reflection+coefficient+with+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).</li>
<li>Gloy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+depolarizes+podocytes+in+the+intact+glomerulus+of+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat.</a> J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).</li>
<li>Nitschke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+the+intracellular+calcium+activity+in+podocytes+of+the+intact+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus.</a> Kidney Int. 57, 41-49 (2000).</li>
<li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+analysis+of+TRPC+channels+in+the+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li>
<li>Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+heavy+metal+ions+perturb+fura-2+measurements+of+basal+and+hormone-evoked+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals.</a> Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).</li>
<li>Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mineralocorticoid+and+angiotensin+II+receptor+blockers+on+proteinuria+and+glomerular+podocyte+protein+expression+in+a+model+of+minimal+change+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+%28Carlton%29%22%5BJournal%5D)">Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome.</a> Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).</li>
<li>Abramowitz, J., Birnbaumer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+canonical+transient+receptor+potential+channels%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels).</a> FASEB J. 23, 297-328 (2009).</li>
<li>Heeringa, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+TRPC6+mutation+that+causes+childhood+FSGS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS.</a> PLoS ONE. 4, e7771(2009).</li>
<li>Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+role+of+TRPC6+in+vitamin+D+ameliorating+podocyte+injury+in+STZ-induced+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats.</a> Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).</li>
<li>Bohrer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+puromycin-induced+defects+in+the+transglomerular+passage+of+water+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules.</a> J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).</li>
<li>Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+charge+and+size+selectivity+barrier+of+the+glomerular+filter+in+aminonucleoside+nephrosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats.</a> Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).</li>
<li>Schiessl, I. M., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+AT2+receptor+activation+attenuates+AT1+receptor-induced+increases+in+the+glomerular+filtration+of+albumin%3A+a+multiphoton+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSAIDs+acutely+inhibit+TRPC+channels+in+freshly+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).</li>
<li>Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+wave+of+tubuloglomerular+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium wave of tubuloglomerular feedback.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).</li>
<li>Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+directly+stimulates+ENaC+activity+in+the+cortical+collecting+duct+via+AT%281%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+the+P2+receptors+profile+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+has+acute+effects+on+TRPC6+channels+in+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).</li>
<li>Schaldecker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+TRPC5+ion+channel+protects+the+kidney+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter.</a> J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).</li>
<li>Roshanravan, H., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+acting+through+P2Y+receptors+causes+activation+of+podocyte+TRPC6+channels%3A+role+of+podocin+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).</li>
<li>Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+activation+of+TRPC6+channels+in+rat+podocytes+requires+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species.</a> J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif edilen bir yaklaşım, kemirgen glomerül Podositler kalsiyum işleme analizi sağlar. Bu teknik, patch-kelepçe tek kanallı elektrofizyoloji ve floresan rasyometrik konfokal görüntüleme uygulama sağlar. Bununla birlikte, her iki yaklaşım da kendi ayrı ayrı kullanılabilir. Önerilen protokol 1) böbrek temizleme dahil olmak üzere birçok nispeten basit adımları vardır; 2) diferansiyel eleme ile glomerül izolasyonu; 3) patch-kelepçe elektrofizyolojik deneyler veya hücre içi kalsiyum değişiklikler rasyometrik konfokal...

Böbrekler, çeşitli maddeler için homeostatik dengeyi korumak ve toplam kan basıncını belirleyen bir şekilde kan hacmini düzenler. Hiper veya hipotansiyon arasında değişen renal filtrasyon, geri emiliminin veya salgı kurşun bozukluklar veya eşlik patolojik durumlar, sonunda böbrek nakli gerektiren son dönem böbrek hastalığı için. kapiller endotel, bazal membran ve epitel hücreleri tek-hücre tabakası - - yarık diyafram bütünlüğü ve işlevi 1 korunmasında önemli bir rol oynamaktadır Podositler renal filtreleme birimi (glomerulus) üç tabakadan oluşur. Permselektif glomerüler filtre Disfonksiyon gibi proteinüri olarak makromoleküllerin, idrar kaybına neden olur. Çeşitli ajanlar glomerüller filtrasyon bariyerinin bütünlüğünü belirleyen Podositler ve ayak süreçleri, yapısını etkileyebilir. Podositler glom bakım katılaneruli filtrasyon işlevi. Bu Podosit tarafından uygunsuz kalsiyum taşıma hücre hasarı yol açar ve nefropatilerin 2,3 çeşitli biçimlerde ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Bu nedenle, podosit fonksiyonunun çalışmalar için etkili olacaktır hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri, doğrudan ölçümü için izin veren bir modelinin geliştirilmesi. İzole glomerüller önce albümin yansıma katsayısı ölçümü 4 ve bütün hücre elektrofizyolojik patch-kelepçe ölçümlerde 5,6 integral hücresel akımların değerlendirmesini değiştirir dahil çok sayıda çalışmalarda kullanılmıştır. Mevcut yazıda, farmakolojik ajanların uygulamalarına tepki olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri ölçmek hücrelerin içinde kalsiyum bazal düzeylerini tahmin ve bireysel kalsiyum kanalları aktivitesini değerlendirmek için araştırmacı izin veren protokol açıklar. Ratometric kalsiyum konsantrasyonu ölçümleri ve patch-kelepçe electrophysiology sırasıyla podosit ve kanal aktivitesi olan hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri belirlemek için kullanıldı.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>DMSO içinde 500 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>solüsyon</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tüp rotatörü</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>Almanya</td></tr><tr><td>Nikon konfokal mikroskop (ters çevrilmiş)</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Lazer uyarımı 488 nm. Emisyon filtreleri 500-550 nm ve 570-620 nm</td></tr><tr><td>Objektif</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>Lameli</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek vakum gresi</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Silikon Bileşik</td></tr><tr><td>Yazılım</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Kayıt/perfüzyon odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifikatörü</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Veri toplama sistemi</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; Sistemi</td></tr><tr><td>Alçak geçiren filtre</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8 kutuplu Bessel</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal tüpler</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çekici</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Alevli/Brown tipi mikropipet çekici</td></tr><tr><td>Mikroforj</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japonya</td></tr><tr><td>Motorlu mikromanipülatör</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotitreşim izolasyon masası</td><td>TMC</td><td></td><td>Faraday kafesi ile donatılmış</td></tr><tr><td>Çok kanallı valf perfüzyon sistemi</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Kayıt/perfüzyon odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Yazılım</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nikardipin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Iberiyotoksin</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Niflumik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TEA klorür</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>antibiyotiksiz</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>%30 albümin solüsyonu</td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü cerrahi masa</td><td>MCW core</td><td></td><td>kemirgenler için</td></tr><tr><td>Çelik elekler:</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>mesh 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>CD-1 için elek</td></tr><tr><td>Binoküler mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Binoküler mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası tabanlı perfüzyon sistemi</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietilen tüp</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran anestezisi</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Diğer temel reaktifler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

taze İzole glomerulusların podositler tek kanallı analizi ve kalsiyum görüntüleme

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podositlerin (renal glomerüler epitel hücreleri) glomerüler geçirgenliği düzenlediği ve glomerüler yapıyı koruduğu bilinmektedir; Podosit hasarının proteinüriye ve ayak sürecinin silinmesine yol açması nedeniyle bu hücrelerin çeşitli böbrek hastalıklarının patogenezinde anahtar bir rol olduğu belirlenmiştir. Daha önce, çeşitli endojen ajanların podositlerde hücre içi Ca2 + konsantrasyonunda dramatik bir aşırı yüklenmeye neden olabileceği ve muhtemelen albüminüriye yol açabileceği ve bunun muhtemelen kalsiyum ileten iyon kanalları yoluyla meydana geldiği bildirilmişti. Bu nedenle, hem normal koşullar altında hem de çeşitli patolojik durumlarda podositlerde kalsiyum işlemeyi incelemek önemli görünmektedir. Bununla birlikte, mevcut deneysel yaklaşımlar, kültürlenmiş ve transfekte edilmiş hücrelerle biraz sınırlı kalmıştır. Bu tür çalışmalar için iyi bir temel modeli temsil etseler de, esasen glomerulusun doğal ortamından çıkarılırlar. Burada, yeni izole edilmiş bütün glomerulusun bir parçası olarak podositleri inceleme metodolojisini açıklıyoruz. Bu hazırlık, hala kılcal damarlara bağlı olan podositlerin fonksiyonel potansiyelini korur; Bu nedenle, podositler, glomerül filtrasyon aparatının ana kısımlarını koruyan ortamda kalır. Bu el yazması, 1) oransal konfokal floresan mikroskobu yardımıyla kalsiyum konsantrasyonu değişikliklerinin gerçek zamanlı tespitine ve 2) yeni izole edilmiş glomerüllerin podositlerindeki tek iyon kanalları aktivitesinin kaydedilmesine izin veren iki deneysel yaklaşımı detaylandırmaktadır. Bu metodolojiler, araştırmacıların çeşitli ajanların uygulamalarına yanıt olarak hücre içi kalsiyum işlemedeki akut değişiklikleri çözmelerine, hücreler içindeki bazal kalsiyum konsantrasyonunu ölçmelerine (örneğin, hastalık ilerlemesini değerlendirmek için) ve tek iyon kanalları düzeyinde kalsiyum iletkenliğini değerlendirmelerine ve manipüle etmelerine olanak tanıyan glomerulusun doğal ortamının avantajlarını kullanır.

Burada Podositler kalsiyum seviyeleri akut değişiklikler ölçülerek değerlendirilmesi amaçlanmıştır. 1, taze bir Podositler yüksek çözünürlüklü canlı floresan konfokal görüntüleme ve tek iyon kanalı aktivitesi kayıtları gerçekleştirmek için tasarlanan deney protokolünün şematik bir temsilini göstermektedir, Şekil İzole kemirgen glomerüller. Sıçan anestezi sonra Kısaca, böbrekler kan bunları temizlemek için PBS ile yıkanmalıdır. Ardından, böbrekler kesilmiş ve decapsulated ve glomerül dif...

Podositlerdeki hücre içi kalsiyum seviyelerindeki değişiklikler, glomerüllerin filtrasyon fonksiyonunu kontrol etmenin en önemli yollarından biridir. Burada, yeni izole edilmiş glomerüllerin podositlerinde gerçek zamanlı kalsiyum işlemenin ve tek iyon kanalları aktivitesinin tespit edilmesini sağlayan yüksek verimli bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Bu prosedürün genel amacı, farmakolojik ajanlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişimleri ölçmektir. Taze olarak izole edilmiş glomerulusun bir parçası olan podositlerde bazal kalsiyum seviyelerini tahmin edin ve bireysel kanal aktivitesini değerlendirin. Bu işlem, öncelikle abdominal aorta üzerinden yıkama yaparak sıçan böbreklerindeki kanın temizlenmesiyle gerçekleştirilir.Ardından, böbrekler hasat edilir ve böbrek korteksi izole edilip bir jiletle ince parçalara ayrılır. Üçüncü adımda, kortikal glomerüller diferansiyel santrifüjleme ile izole edilir. Sonrasında, izole edilen dekapsüle glomerüllere ya elektrofizyolojik deneyler uygulanabilir ya da floresan boyalarla yüklenerek konfokal kalsiyum konsantrasyon ölçümleri için alınabilir.Nihayetinde, bu prosedürler araştırmacıların çeşitli ajanların uygulanmasına yanıt olarak hücre içi kalsiyum yönetimindeki akut değişimleri çözümlemelerini ve tekil iyon kanalları düzeyinde kalsiyum iletkenliğini değerlendirip manipüle etmelerini sağlar. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, podositleri izole edilmiş tüm glomerulusun bir parçası olarak incelememize olanak tanımasıdır. Hazırladığımız düzenek, podositlerin fonksiyonel potansiyelini korur.Kılcal damarlara tutunmaya devam ederler ve glomerüler filtrasyon aparatının ana kısımlarını koruyabilen ortamdaki homeostaza katılırlar. Bu tekniğin uygulaması, farmakolojik taramalarımızı genişletmektedir. Normal ve patolojik durumlarda, podositlerin kalsiyum yönetme mekanizması; diyabetik nefropati, fokal segmental glomerüloskleroz veya hipertansiyon gibi hastalıklarda renal komplikasyonların gelişimi ve önlenmesinde temel bir düzenleyici rol oynar. Bu hücrelerdeki kalsiyum girişinin ilaçlara karşı verdiği yanıtın gözlemlenmesi ve bunun kolaycale taranabilmesi büyük önem taşımaktadır.Bu hazırlıkta, VLA Hunka sonraki prosedürler için böbreğin nasıl yıkanacağını gösterecektir. Glomeruli izolasyonunu ve V klempli elektrofizyolojiyi göstereceğim ve Dr. GaN size konfokal kalsiyum görüntüleme konusunda rehberlik edecek. Bu prosedüre başlamak için, anestezi uygulanmış bir sıçanı sıcaklık kontrollü cerrahi masaya yerleştirin. Mikroskop altında, Vena Cava ve aortu açığa çıkarmak için karın bölgesinde orta hat üzerinden bir insizyon yapın.Ardından, çölyak ve superior mezenterik arterlerin çevresine ve bunların üzerindeki abdominal aortaya ligatür yerleştirin. Renal arterlerin altındaki abdominal aortayı künt diseksiyonla açın. Daha sonra buraya iki ligatür yerleştirin ancak bağlamayın.Aortu ligatürlerin üzerinden klempleyerek alt ipi bağlayın. Ardından, klembin alt kısmından, PBS ile doldurulmuş bir şırınga pompasına bağlı polietilen bir tüp ile aortu kateterize edin ve kateteri ikinci bir ligatürle sabitleyin. Sonrasında klembi kaldırın ve onları ligatürleyin.Enterik ve çölyak arterleri belirleyin. Aortayı, dakikada altı mililitre hızla üç dakika boyunca önceden soğutulmuş PBS ile infüze edin. Aynı zamanda, basıncı düşürmek için renal venlerin yakınındaki vena cava'da bir insizyon yapın.Üç dakika sonra perfüzyonu durdurun, böbrekleri çıkarın ve kapsülleyin. Böbrekleri buz üzerinde PBS solüsyonuna yerleştirin. Şimdi RPMI 1640 ortamında 30 mililitre taze %5BSA hazırlayın.Bir jilet ve makas kullanarak her iki böbreğin korteksini izole edin, ardından homojen hale gelene kadar MIT uygulayın. Sonra, kıyılmış dokuyu %5 P-S-A-R-P-M-I çözeltisinde önceden bekletilmiş 100 mesh paslanmaz çelik bir süzgeçten geçirin. Akışla gelen kısmı toplayın ve 140 mesh bir süzgeçten geçmesine izin verin.Ardından, 140 mesh elekten toplanan akışı önceden ıslatılmış 200 mesh bir elek kullanarak süzün. Filtratı atın ve üstteki eleği 10 ila 15 mililitre hazırlanmış B-S-A-R-P-M-I çözeltisi ile yıkayıp glomerülleri eleğin üst kısmından toplayın. Daha sonra, G Glomerülleri içeren B-S-A-R-P-M-I çözeltisini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve glomerüllerin tüpün dibine çökmesi için 20 dakikaya kadar bekletin.Bu prosedürde, beş tarafından beş milimetrelik lamine cam chipleri 70.000 ile 150.000 moleküler ağırlığındaki polilizin ile kaplayın ve ısıtılmış bir plaka üzerinde kurutun. Ardından, deney çözeltilerini oda sıcaklığına getirin ve patch clamp haznesini ile pipeti doldurun. Glomeruli içeren çözeltiyi nazikçe karıştırın. Daha sonra, bu çözeltiden yaklaşık 50 µL miktarını her bir polilizin kaplı lamine cam chip'e uygulayın.Ardından, glomerülleri içeren cam çipleri, Beth solüsyonu ile önceden doldurulmuş olan patch clamp haznesine taşıyın. Hücre iliştirilmiş (cell attached) modunda konvansiyonel patch clamp kaydı gerçekleştirmeden önce, yapışmamış glomerülleri uzaklaştırmak için hazneyi bir dakika boyunca dakikada 3 mL hızla perfüze edin.Şimdi, her bir 0,5 mililitrelik konik tüpe 500 µL glomeruli fraksiyonu yerleştirin ve kalsiyum boyaları olan pure red AM ve fluo-4 AM ekleyin. Ardından, tüpleri oda sıcaklığında bir saate kadar döner çalkalayıcıya yerleştirin. Bu sırada, lam üzerine kapatılacak cam örtüleri polylysine ile hazırlayın ve 70 °C'deki ısıtma plakasında kurumaya bırakın. Kalsiyum boyalarının yüklemesi tamamlandığında, polylysine kaplı örtülerin üzerine glomeruli içeren çözeltiden 100 µL uygulayın ve yüzeye yapışmaları için yaklaşık beş dakika bekleyin.Ardından, glomerüllerin yapıştığı lamelleri bir görüntüleme haznesine yerleştirin ve yapışmamış glomerülleri ve kalan boyaları uzaklaştırmak için dakikada 3 mL hızla banyo çözeltisi ile perfüzyon uygulayın. Sonrasında, konfokal lazer tarama mikroskobunu 488 nanometre uyarım dalga boyuna ayarlayın. Ardından görüntüleme yazılımını istenen frekans ve çözünürlüğe ayarlayın.Ardından, glomerülleri parlak alanda bulun. Sonrasında floresan sinyalinin tespitini açın. Bundan sonra, istenen bir odak düzlemi seçin ve flu oh four ve firo red kanallarındaki floresan yoğunluğunu kontrol edin.Glomerülün brightfield görüntüsünde net bir şekilde görüldüğünden emin olun. Ardından, flu oh four ve furor red sinyalleri için floresan yoğunluğundaki değişiklikleri kaydedin. Görüntü dizisini aktarmak için kanalları ayırın ve hyper stack gri tonlama modunu kullanın.Image J yazılımında, analiz araçları (analyze tools), ROI Yöneticisi (ROI Manager) yolunu izleyerek bir ROI yöneticisi penceresi açın. Oval seçim aracını ve ROI yöneticisindeki ekle T (add T) işlevini kullanarak bir veya daha fazla ilgi bölgesi seçin. Ardından arka plandaki alanı seçin ve seçilen ROI'leri kaydedin.Ardından, diyalog penceresindeki dilim başına bir satır kutucuğunu işaretleyin ve menü seçenekleri sonuçlarından tamam'a tıklayın. Ölçümleri ayarlayın. Ortalama gri değeri seçeneğini belirleyin ve her ROI için piksel yoğunluk değerlerini hesaplayın; bu değerler sonuçlar penceresinde ayrı sütunlar halinde görüntülenecektir.Ardından, her bir ROI için ölçülen ROI yoğunluk değerlerini her kanal için tercih edilen veri analiz yazılımına kopyalayın ve her zaman noktası için her veri noktasından arka plan yoğunluk değerlerini çıkarın. Fluo-4 ile URA red kanallarının yoğunluk oranını hesaplayın ve ardından her bir ROI için kalsiyum transiyentinin zamanla değişimini grafiğe dökün. Bu görüntü, sıçan glomerulü yüzeyindeki oksit gövdeye takılmış patch clamp pipetini göstermektedir.Elektrofizyolojik kayıt sırasında, görüntünün sağ alt köşesinde kapsüllenmiş glomerulün bir kısmı görülebilir. Burada, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu ölçmek için podosit üzerinde yapılan hücre bağlantılı (cell-attached) patch işleminden elde edilen, TRP benzeri kanal aktivitesine ait temsili bir akım izi yer almaktadır. Hücre içi kalsiyumu işaretlemek için glomeruller Fluo-4 AM ile yüklenmiştir.Bu video, CIN ve manganez klorürün glomerüllerdeki kalsiyum girişine etkilerini göstermektedir. Bu grafik, CIN ve manganez klorüre yanıt olarak tek bir podositten kaydedilen flu oh four sinyal yoğunluğundaki değişimleri nicelleştirmektedir. Beklendiği üzere, CIN maksimum floresan miktarını üretirken, manganez klorür boyayı söndürerek en düşük floresan yoğunluğuna neden olmaktadır.Bu ilaçların uygulanması, araştırmacının daha sonra hücre içindeki kesin kalsiyum konsantrasyonunu belirlemesine olanak tanır. Bu video, 10 micromole a TP'nin glomerüllerdeki kalsiyum konsantrasyonu üzerindeki etkisini göstermektedir. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki artışı temsil eden, yeşil flu O four floresansında bir artış ve kırmızı fu red floresansında bir düşüş olduğuna dikkat edin.Bu teknik, farmakolojik tedaviler veya diğer manipülasyonlar sonrası, tek iyon kanalı ve bireysel hücre düzeyinde kalsiyum girişindeki değişiklikleri izlemek için benzersiz bir fırsat sunar. Bu nedenle, mevcut çok sayıda genetiği değiştirilmiş kemirgen modeli göz önüne alındığında, bu yaklaşım oldukça güçlü bir araçtır. Bu videoyu izledikten sonra, podositlerde kalsiyum ölçümlerinin nasıl yapılacağının yanı sıra, hem tek başına hem de birlikte kullanılan elektrofizyolojik voltaj klemp deneylerinin nasıl yürütüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu teknikler, normal ve patolojik koşullarda podositlerdeki kalsiyum yönetiminin düzenlenmesine ilişkin derinlemesine ve mekanistik bir anlayış sağlar.

single-channel-analysis-calcium-imaging-podocytes-freshly-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İmmünohistokimya protokolleri retinada, spesifik bir proteinin lokalizasyonu incelemek için kullanılır. Kalsiyum görüntüleme teknikleri retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamiklerini incelemek için istihdam edilmektedir.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Kalsiyum çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yollarında rol oynamaktadır. Canlı hücre görüntüleme özel ekipman gerektirir ve zaman alıcı olabilir. Süspansiyon haline getirilmiştir yapışık epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum göreli değişiklikleri belirlemek için bir akış Sitometreyi kullanarak hızlı, basit bir yöntem optimize edilmiştir.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Renal tübüler epitel ifade iyon kanalları polikistik böbrek hastalığı patolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada taze kemirgen böbrekler izole kistik epitel patch-kelepçe analizi ve hücre içi kalsiyum seviyesi ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan deneysel protokolleri açıklayın.

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

Burada, pankreas adacık hücreleri gibi heterojen hücre popülasyonlarında kalsiyum dinamiğinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için bir protokol saklıyız. Floresan muhabirler adacık içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir, daha sonra hareketsiz hale getirilir ve görüntülenir ve floresan yoğunluğunun dinamiğinin hücre başına analizi yapılır.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Bu protokolün amacı, vibratom kesitlerini kullanarak fare renal pelvisinin sağlam kalp pili bölgelerini izole etmektir. Bu bölümler daha sonra vibratom dilimlerinde kalp pili hücrelerinin ve diğer geçiş hücrelerinin Ca 2+ geçici özelliklerini aydınlatmak için in situCa 2+ görüntüleme için kullanılabilir.

Vibratom Kesitleme ile Fare Renal Pelvisin Canlı, Sağlam Kalp Pili Bölgelerini İzolasyon ve Görüntüleme

Sunulan yöntem, floresan etiketli hücresel proteinlerin, geleneksel bir mikroskopta 70 nm çözünürlüğe yol açan genleşme mikroskopisi ile görselleştirilmesini sağlar.

Podosit Proteinleri Nephrin, Actin ve Podocin'in Genleşme Mikroskopisi ile Görüntülenmesi

Hücre kalsiyum görüntüleme, benzersiz fonksiyonel imzalar veren kalsiyum geçirgen kanalların / reseptörlerin ekspresyonuna dayanarak, bireysel hücrelerin, kültürdeki karışık popülasyonların ve hatta uyanmış hayvanların dinamik sinyalizasyonunu incelemek için çok yönlü bir metodolojidir.

Kalsiyum Görüntüleme Tekniği ile Nöron-Glia Devresindeki Değişimlerin Görselleştirilmesi

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca2+ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca2+ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Keşfedin yüksek verimli kalsiyum görüntüleme yöntemini, taze izole glomerulusların podositlerinde iyon kanalı aktivitesini gerçek zamanlı izlemek için. Bu teknik böbrek fonksiyonu ve hastalık mekanizmalarını anlamada ileri düzeyde bilgi sağlar.

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Daha fazla video keşfet