Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, fare beyin ventrikülleri içinde yer alan Motr append CLIA'nın atışlarının ex vivo gözlemini sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle tüm beynin hasat edilmesi ve ardından lateral ventriküller üzerinden ince kesitler alınmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, dokunun deney sırasında canlı kalmasını sağlamak için kesitler, vücut sıcaklığında yüksek glukozlu besiyeri içeren özel bir cam tabanlı plakada inkübe edilir.

Son olarak, siliyumların atımları yüksek çözünürlüklü bir diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak kaydedilir. Nihayetinde, siliyumların yapısı ve protein lokalizasyonu, immunofloresan görüntüleme ile görselleştirilebilir. Mevcut yöntemimizin bu tekniğe göre temel avantajı, epidermal hücrelerin kendilerine özgü siliyer tekrarlama frekansları ve açılarına göre üç farklı gruba ayrılmasına olanak tanıyan ilk teknik olmasıdır.

Bu oldukça iyi. Bu tekniğin ima ettiği sonuçlar, hidrosefalus tedavisine kadar uzanmaktadır; çünkü anormal epidermal CLIA fonksiyonu, beyinde serebrospinal sıvının birikmesine yol açar.

Ventriküller. Prosedürü uygulamak üzere laboratuvarımızın çok yetenekli öğrencileri Bayan Zaha Alam ve Bayan Hannah sat görev alacaklar. Yetişkin bir farenin başını %70 ethanol ile temizleyerek başlayın. Ardından, başın üst kısmından başlayarak, deriyi sıyırmak ve kafatasını açığa çıkarmak için steril makas ve pens kullanın.

Ardından, posterior taraftan başlayıp anterior tarafa doğru ilerleyerek kemiği parça parça iyileştirin. Kafatasını çıkarmak için tüm beyni seçin ve 37 °C'de, yüksek glukozlu besiyerli 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Keskin bir bıçak kullanarak beyni median sagittal düzlemden kesin ve her iki yarıdan ilk 100 ila 200 µm'lik kesiti elde edin.

Ardından kesitleri 37 °C PBS ile durulayın ve dokuyu derhal 37 °C'ye yerleştirin. Kesitleri görüntülemek için, beyin dilimlerini 1 mL yüksek glikozlu besiyeri içeren 30 mm cam tabanlı kültür kaplarına yerleştirin ve kapalı mikroskop odası ortamını, 60x objektifli yağ daldırma lens kullanarak 37 °C ve %5 CO2 değerlerine ayarlayın. Sonrasında, standart DIC iletim ışığı ile hücrelere odaklanın.

Ardından, motil append clia'nın konumunu belirlemek için kılavuz olarak DMEM kabarcığının hareket yönünü takip edin. Beynin lateral ventrikülünde, motil CLIA içeren sağlıklı hücrelerin bulunduğu bir alanı seçmek için DIC filtresini kullanın. Append clia tanımlandıktan sonra, tatmin edici bir görüntü elde etmek için ışığı ve odağı ayarlayın.

Ardından, görüntüleme yazılımında canlı görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Örneğin burada, 60 x objektif ve 5 ila 10 milisaniyelik pozlama süresiyle birlikte, kamera binning değeri bir kere bir olarak ayarlanmış şekilde 24 bit görüntüler alınmaktadır. Minimum pozlama süresi için mikroskop diyaframını optimal seviyeye açın ve DIC görüntülerini toplayın.

Görüntüleri gecikmesiz, hızlı ve anlık olarak elde edebilmek için kameraya aktarılan canlı görüntüleri gözlemleyin. Silly beating hızı, kalsiyum sinyallemesini kaydetmek için yeterli görüntü kontrastı elde edilmesini sağlayan minimum pozlama süresi gereksinimine göre hesaplanabilir. Beyin dilimlendikten sonra, dokuyu kısa bir süre PBS ile yıkayın ve kesitleri hemen cam tabanlı bir plaka içinde, yeni hazırlanmış 20 micrograms per milliliter lu O2 ile inkübe edin.

37 °C'de 30 dakika bekledikten sonra, kalsiyum osilasyonunu beş milisaniyelik bir yakalama hızıyla minimum bir saniye boyunca kaydedin. Önce 488 nanometre uyarım dalga boyunda, ardından 515 nanometre emisyon dalga boyunda işlem yapın. İlgilenilen hücre belirteçlerini immünofloresan mikroskopi ile görselleştirmek için örnekleri PBS içinde %4 paraformaldehit ve %2 sükroz ile 10 dakika boyunca sabitleyin.

Dokuyu, her yıkama beş dakika sürecek şekilde, PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, beyin kesitlerini 0,1% Triton X içinde beş dakika boyunca inkübe edin. Örnekleri az önce gösterildiği gibi duruladıktan sonra, fare anti asetile alfa tubulin ile inkübe edin.

Bir başka PBS yıkamasının ardından, örnekleri oda sıcaklığında bir saat boyunca floresein anti-US IgG ile inkübe edin. Son olarak, kesitleri beş dakika boyunca DPI ile karşı boyayın ve hücreleri mümkün olan minimum pozlama süresiyle hemen görüntüleyin. Bir penal CLIA varlığı, DPI karşı boyamasıyla birlikte siliyer marker asetile alfa tubulin ile doğrulanır. Çekirdekleri tanımlamak için, bir penal CLIA motilitesinin akış analizi, hareketli hücrelerin vuruş frekansı ve açı paterni sayılarak gerçekleştirilir.

CLIA, bu verilere dayanarak üç gruptan birine ayrılabilir. Önemli bir nokta olarak, CLIA'nın %0,25 Ethanol'e maruz bırakılması, tiplerinden bağımsız olarak CLIA vuruş frekansını önemli ölçüde baskılamaktadır. CLIA'nın daha fazla bükülmesi, beyin ventrikülleri içindeki hücre içi kalsiyum sinyalinin ölçülmesine olanak tanıyan siliyum bağımlı bir hücre içi kalsiyum sinyallemesini tetikler. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütülürse bir saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedür uygulanırken, beyin ventriküllerinin gelişimi tamamlandıktan sonra zarar görmemesi için beyin dokusunun nazikçe ve verimli bir şekilde işlenmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların append CLIA ve canlı fare beyin dokusunun fonksiyonlarını keşfetmelerine yol açmıştır.