Name: Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Öğrenin fare beyni lateral ventrikül ependimal silyalarının canlı görüntüleme yöntemini. Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast mikroskobisi ile silya atım frekansı ve açısını inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, düzenleme hizmeti için Charisse Montgomery'ye teşekkür eder. A. Alomran'ın çalışması, Farmakoloji alanında yüksek lisans derecesi için gerekli şartları kısmen karşılamaktadır.Bu çalışma, Toledo Üniversitesi'nin WAA için intramural başlangıç fonu ve SMN için NIH hibesi (DK080640) tarafından finanse edilmektedir.

Hayvan kullanımı için prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Bakım ve Kullanımı Kılavuzu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu yönergelerine uygun olarak Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır Laboratuvar Hayvanları. 1. Beyin Ekstraksiyon, Kesit ve Doku Hazırlama <ol><li> Derin 5 dakika için CO2 ile boğularak ile ötenazi yabani-tip fare soyu C57BL / 6 Kurban. Servikal dislokasyon ile ölüm emin olunuz. </li><li> % 70 etanol ile fare kafasını temizleyin. </li><li> İlk kafatası açığa çıkarmak için başın üstünden başlayarak, kapalı cilt çekerek steril makas ve forseps kullanarak kraniyektomi. </li><li> Sonra, kafatası maruz kaldığında, kemik parçası-by-parça soyma arka tarafında başlayan ve ön tarafına doğru hareket ettirerek kafatası çıkarın. Beyin ventriküllerin yok etmek değil dikkatli olun. </li><li>Tüm beyin toplayın. </li><li> Penisilin 10,000 ünite / ml ve streptomisin ve önceden ısıtılmış 10,000 ug / ml ihtiva eden% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM / Yüksek glikoz ve% 1 penisilin / streptomisin solüsyonu içeren bir 100 mm Petri kabındaki beyin yerleştirin 37 ° C arasındadır. </li><li> Keskin bir bıçak ile elle medyan sagital düzlemde beyin dilimleyin ve bir vibratome kullanarak her yarısından itibaren ilk 100-200 mm bölümünü edinin. </li><li> Önceden ısıtılmış 37 ° C, fosfat tamponlu tuzlu su (1 x PBS) çözeltisi ile beyin dokusu durulayın. </li><li> Hemen, DMEM / Yüksek Glikoz ortamı 37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış beyin bölümü yerleştirin. </li></ol> 2. Canlı Görüntüleme Yapılandırma ve Kurulum <ol><li> DMEM / Yüksek Glikoz ortamı 1 ml içeren 30 mm cam alt kültür tabaklarında beyin dokusu kesitleri yerleştirin. % 95 /% 5 O2 / CO2 içeriği 37 ° C, (Şekil 1 &#39;e mikroskop Kapalı bir odanın ortam ayarlama </strong&gt;). </li><li> 60X objektif immersiyon yağı lens kullanarak, ilk 60X objektif lens üzerinde bir yağ damla yerleştirme ve düzenli DIC ile hücrelerin odaklanarak ependimal hücre / kirpikler görüntüleri toplamak ışık iletti. </li><li> Silier dayak alanında kabarcık hareketinin bir tür oluşturmak Sonra, hareketli ependim kirpikler konumu için bir rehber olarak DMEM kabarcık hareket yönünü takip edin. DIC filtresi kullanılarak beynin lateral ventrikül içinde hareketli kirpikler ile sağlıklı hücreleri içeren bir alan seçin. Ependim kirpikler bulunduktan sonra, ışık ayarı ve tatmin edici bir görüntü elde etmek odaklanır. </li><li> Metamorph görüntüleme yazılımı kullanarak belirli bir amaç doğrultusunda canlı görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Mevcut gösteri, objektif 60X ve 5-10 msn maruz kalma süresi ile birlikte, 1 x 1 kamera binning seti ile yirmidört-bit görüntüleri kazanır. </li><li> Asgari exp olması için optimal düzeye mikroskop diyafram açarak DIC görüntüleri toplayınosure zaman. Gecikmeden hızlı ve anında görüntü alımını sağlamak için kameraya canlı görüntüleri akışı gözlemleyin. Yeterli görüntü kontrastını elde etmek için en az pozlama süreleri gereksinimi dayalı kirpikler dayak hızını hesaplayınız. </li></ol> 3. Veri Görselleştirme ve Analiz <ol><li> 1 dakika içinde dayak sayısını sayarak kirpikler dayak sayısını hesaplayın. Video hızını azaltarak ve hücre sayacı veya benzeri bir alet kullanarak vuruş sayısını sayarak bunu yapın. </li><li> Dayak sıklığını hesaplamak için, video sn numarasını almak için edinilen kare ya da time-lapse görüntü sayısına göre kaydedilen hangi pozlama süresini çarpın. (Örnek: pozlama süresi 5 msn 200 kare = 1,000 milisaniye veya 1 sn). </li><li> Tek saniyede yenerek sayısı olarak ifade edilir frekansı elde etmek için bir saniye içinde dayak sayısını hesaplayın. Tek ikinci kez Inter, üzerinde kirpikler dayak sayısına bölünmesiyle yapınval (Örnek: kirpikler = 1 sn 5 msn yani 5 msn x 200 kare pozlama süresi kaydedilen 200 kare video 50 kez yendi, şimdi 1 sn = 50 Hz ile 50 atım bölmek). </li><li> Her iki güç ve kurtarma vuruş sırasında ependim kirpikler tarafından alınan yolu değerlendirerek siliyer dayak açısını hesaplayın. Küçük değişikliklerle 11, daha önce tarif edilen yönteme uygun olarak, bu gerçekleştirme. Bireysel kirpikler kesin hareketi tam yendi döngüsü sırasında görülmektedir. </li><li> Monitörün üzerine yerleştirilen bir asetat sayfasında, ependimal kenarı ve güç inme başlangıcında kirpikler orta hat pozisyonuna yoluyla dikey bir çizgi boyunca yatay bir çizgi çizin. </li><li> Güç inme sırasında ileri hareket ederken kare cilium çerçevenin kesin konumunu çiziniz. Benzer bir tarzda, geri stroku esnasında Sil hareketi çizilir. </li><li> T sırasında orta hattan cilium maksimum sapma gelen siliyer dayak açısını hesaplamakgüç inme yanı sıra kurtarma inme o. </li></ol> 4. Kalsiyum sinyal kayıt <ol><li> Beyin dilimleme sonra, kısa bir süre için 1 x PBS veya Dulbecco PBS (pH 7.0), beyin dilim yıkayın. Floresanlık sönmesini önlemek için ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, taze Fluo-2 hazırlayın. </li><li> , Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde Fluo-2 çözeltisi, 1 mM stok çözelti hazırlayın karıştırmak ve Fluo-2 homojen DMSO içinde eritildi sağlamak için, en az 5 dakika boyunca çözeltiden vorteks. </li><li> % 2 B27 ile takviye edilmiş DMEM / Yüksek Glikoz 500 ml Fluo-2 stok solüsyonu ile seyreltilir, 20 mg / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar 37 ° C&#39;ye kadar ön-ısıtılır. NOT: B-27 vitamini, antioksidan kokteyli ve hipokampus ve diğer merkezi sinir sistemi nöronlarının kısa veya uzun vadeli canlılığı desteklemek için kullanılan insülin içeren optimize edilmiş serum serbest ekidir. </li><li> Hemen bir cam alt plaka 37 ° C&#39;de 30 dakika süre ile 20 mg / ml Fluo-2 beyin dilim inkübe edin. </li><li> Kalsiyum fluorofor Flu-2 optimal yükleme konsantrasyonunu belirlemek için ve ATP ile kalsiyum boya hücre toksisite, meydan hücreleri önlemek için, ve ATP cevaben zaman ders ve kalsiyum sinyallerinin tepe büyüklüğünü belirleyerek hücre canlılığı kontrol ediniz. </li><li> 488 nm ve 515 nm, sırasıyla, (Film 2) eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile, 1 saniye (sn 200 kare) bir en az 5 msn bir yakalama oranında kalsiyum salınım için video kaydedin. </li><li> Otofloresans veya hareket eserler arasından Flu-2 kalsiyum sinyalini ayırt etmek, 515 nm yayılan şiddetleri ayrı izlenir emin olun. Not: Flu-2 hücre içi kalsiyum ölçmek için uygun bir kalsiyum fluoremetric değildir. Bununla birlikte, örneğin kalsiyum salınımları hızlı kalsiyum değişiklikleri tespit etmek için mükemmel bir dinamik kalsiyum boyadır. Daha doğru bir kalsiyum ölçümü için, Fura-2 tavsiye edilir. Bununla birlikte, Fura-2&#39;nin dinamik değişimler de rasyometrik ile sınırlıdırboya doğası. </li><li> Tam serbest hücre içi kalsiyum değerlerini hesaplamak için üretici tarafından sağlanan formüller izleyin. Örnek [Ca 2 +] = Kd × (R - R dk) / (R max - R). Kd serbest kalsiyum boyanın ayrışma sabiti olduğu durumlarda, R, 488 ölçülen floresans olduğu, ve R &#39;ve R max dakika minimum ve maksimum iyon konsantrasyonu 12 floresan oranlarıdır. </li></ol> 5. İmmünofloresan Mikroskopi <ol><li> % 4 paraformaldehit (PFA) ile 10 dakika süre ile,% 2 sukroz ihtiva eden fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile beyin bölümleri sabitleyin. Seçenek olarak ise, bir kriyostat kullanarak 50 mm bölüme% 4 daha sonra PFA ve bölüm ile bütün beyin sabitleyin. </li><li> 5 dakika her zaman için 1x PBS ile dokuya üç kez yıkayın. </li><li> Bir soluti beyin dilim inkübe5 dakika boyunca 1 x PBS içinde% 0.1 Triton-X ile, daha sonra 5 dakika, her seferinde 1 x PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Gece boyunca 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında (RT) ya da bir saat boyunca 1 x PBS içinde% 10 FBS içinde 5000: fare primer antikor ile beyin dilim inkübe 1 bir seyreltmede kullanılan a-tubulin, antiacetylated. </li><li> 5 dakika her zaman için 1x PBS ile dokuya üç kez yıkayın. </li><li> Sekonder antikor beyin dilim inkübe 1 bir seyreltme floresein anti-fare IgG: oda sıcaklığında 1 saat süre ile 1 x PBS çözeltisi içinde 500,% 10 FBS. </li><li> 5 dakika çekirdeği (veya DNA) 13 leke 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile bölüm counterstain bir floresan mikroskobu altında gözlem, önce. Mümkün olan minimum pozlama süresi ile bölümler hemen photobleaching, görüntüyü en aza indirmek için. </li></ol>

<ol><li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia%3A+Highly+sophisticated+biological+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li>
<li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li>
<li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li>
<li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li>
<li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x%287%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+signalling%22%5BJournal%5D)">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li>
<li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li>
<li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+%28New+York%2C+N.Y.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li>
<li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function%2C+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li>
<li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476(2012).</li>
<li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li>
<li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging%3A+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li>
<li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li>
<li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+membrane+biology%22%5BJournal%5D)">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li>
<li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5(2013).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Canlı görüntüleme ve beyin ventriküller içinde ependim kirpikler hızlı ve duyarlı bir yakın gözlem sağlayan floresan mikroskopi hem fare beyin dokusu hazırlanması için bir protokol burada açıklanmıştır. Bu teknik sadece lateral ventrikül ile sınırlı değildir; diğer beyin ventriküllerde kirpikler gözlemlemek için yararlanılabilir. Bu görüntüleme tekniği bir ex vivo ortamda siliyer dayak ile BOS hareketine benzer bir canlı akışı sağlar. Ayrıca, kirpikler yönlü hareketin analizi sağlar. Bu esas olarak bir yüksek ç...

Silyum hücre dışı ortama hücre yüzeyinden uzanan duyu mikrotübül tabanlı organellerdir. &quot;9 + 0&quot; ya da &quot;9 + 2&quot; - kendi mikrotübül Kuruluşunuza bağlı olarak, kirpikler iki tip olarak kategorize edilebilir. Fonksiyonel, onların hareketliliği dayanarak, bu hareketli veya non-motil kirpikler 1 olarak kabul edilebilir. Birincil kirpikler genellikle &quot;9 + 0&quot; non-motil kirpikler belirtmek için kullanılan bir terimdir. Bunlar (&#39;9&#39; ile gösterilir), dokuz paralel çifti mikrotübülleri ve mikrotübüller merkezi çifti (&#39;0&#39; ile gösterilir), merkezi kılıf içinde yoktur. Ancak, embriyo lateraliteyi düzenleyen gibi düğüm kirpikler gibi bazı &quot;9 + 0&quot; kirpikler, 2 hareketli vardır. Diğer yandan, hareketli silia mikrotübül çifti, bir ilave merkezi çift dokuz paralel mikrotübül çifti ek olarak karakterize edilmiştir ve motilite kolaylaştırmak için dinein motor protein ile bağlantılı. Buna ek olarak, bazı &quot;9Böyle koku cilia olarak +2 &quot;kirpikler 3 olmayan hareketli vardır. Beyin ventriküller ve omuriliğin merkezi kanal döşeyen hücreler ependimal beyin ventriküller 4 boyunca beyin omurilik sıvısı (BOS) itmek hareketli kirpikler ile karakterizedir. Bu yöntemin genel amacı kirpikler dinamikleri ve yapısal anomaliler hareketli okuyan kolaylaştırmaktır. Beynin sağlığı ve gelişimi ağır beyin ventriküllerin içinde BOS etkin dolaşımı bağlıdır. Örneğin, normal bir BOS akım ve sıvı dengesi normale dayak ve sırayla nöronal hücrelerin yönlü hareketini düzenleyen kritik rol oynayan ve hücre göçü 7 kök fonksiyonel ependim kirpikler 5,6 gerektirir. Böyle anormal ependim kirpikler işlevi veya hidrosefali ile ilişkili anormal BOS akışına yol açabilir yapısı, tıbbi bir durum olduğu b ventrikül BOS anormal birikimi varYağmur. Bu sonuç kafa içi basınç ve baş, konvülziyon, tünel görme ilerici genişleme ve zihinsel engelli 8 arttı neden olabilir. Mevcut yöntemlere göre bu tekniğin avantajları üç farklı ependim hücre tiplerini bildirmek için ilk kez izin olduğunu: Ben, onların eşsiz siliyer dayak sıklığı ve açı yenerek dayanan II ve III. Bu ependimal hücreler beyin ventriküllerinde belli bölgeler içinde lokalize. Ayrıca, yaş ve alkol ve ependim hücre tiplerini veya lokalizasyonu değiştirerek üzerinde silostazolün olarak farmakolojik ajanların etkileri ependimal hücrelerin bu sınıflandırmaya önce mümkün değildi, ispat edilebilir. Silostazol, fosfodiesteraz-3 inhibitörü, AMP cAMP&#39;yi metabolize eden bir enzimdir ve bu, aynı zamanda, hücre içi kalsiyum 9 düzenler. Yüksek hızlı floresan görüntüleme analizi kullanılarak eşsiz hücre içi görüntüleme ve niceleme veriyorependim hücrelerin kalsiyum salınımı özellikleri. Örneğin, alkol ve silostazol hem anlamlı sırayla, ependim kirpikler 10 ile beyin omurilik sıvısı volüm replasmanı bir değişikliğe yol açabilecek ependim siliyer dayak frekansı yanı sıra hücre içi kalsiyum salınımlar özellikleri, değiştirilemez. Özet olarak bu teknik, farklı kalsiyum salınım özellikleri olan ependimal hücrelerinin üç farklı tip ilk kanıt sağlamak için önemli idi. Aşağıdaki bölümde, prosedürün ayrıntılı bir adım-adım genel doku hazırlanması ve kullanımdan yakından ilgilenerek, sağlanır.

<table><tbody><tr><td>DMEM/YÜKSEK GLİKOZ</td><td>Cellgro Mediatech Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Hidroklon</td><td>SH30088-03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30256-01</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710-SP</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-2395</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-2&nbsp;</td><td>TEF Labs</td> <td># 0200</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD DAPI Vector</td><td>Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-asetillenmiş a-tubulin antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451 ile</td> HardSet Montaj Ortamı &<td>klon 6-11B1</td></tr><tr><td>FITC Anti-fare antikoru</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>FI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü plakası</td><td>VWR Vista Vision</td><td>30-2041</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Kayması (18 x 18)</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004.326</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>Biosystems Leica CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Ters Floresan Mikroskobu</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Nikon TE2000</td><td>60X yağ&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı 24 x 60 mm2</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Vektör Laboratuvarları ile Montaj Ortamı</td><td></td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI filtre küpü</td><td>Chroma Teknolojisi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare beyin lateral ventrikül ependimal cilia canlı görüntüleme

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependimal hücreler erişkin beyninde ventrikül sıralanıyor. Anormal işlevi veya ependim kirpikler yapısı çeşitli nörolojik defisitler ile ilişkilidir. hareketli ependim kirpikler tekniğinin ex vivo canlı görüntüleme mevcut birkaç adım takip siliyer dinamikleri ayrıntılı çalışma için izin verir. Bu adımlar şunlardır: farelere karbon dioksid ile ötenazi Toledo Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Üniversitesi protokollerine göre; bir vibratome veya keskin bıçak ile beyin kaldırma ve sagital beyin diseksiyonu ardından kraniektominin ependim kirpikler görüntülenmiştir beyin lateral ventriküller, üzerinden çok ince kesitler elde etmek. % 95 /% 5 O mevcudiyetinde 2 / CO2 karışımı, 37 ° C&#39;de Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) / Yüksek glikoz içeren özel bir cam alt plaka beynin dilimlerin Kuluçka canlı doku tutmak esastır sırasındadeney. Kirpikler dayak bir video daha sonra yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak kaydedilir. video sonra siliyer dayak frekansı hesaplamak için kare kare analiz edilir. Bu onların siliyer dayak sıklığı ve açısına göre üç kategoriye veya tipe ependimal hücrelerin farklı sınıflandırma verir. Ayrıca, bu tekniğin ependimal hücrelerin özel hücre içi kalsiyum salınım özelliklerinin yanısıra, kalsiyum salınımlarına farmakolojik ajanların etkisi ve siliyer atan frekans karakterize etmek için yüksek hızlı flüoresan görüntüleme analizi kullanımına izin verir. Buna ek olarak, bu teknik, siliyer yapı ve siliyer protein lokalizasyonu çalışmaları için immünofloresan görüntüleme için uygundur. Bu hastalık teşhis ve fenotip çalışmalarında özellikle önemlidir. Beyin dokusu ölmek başladığında tekniğin ana sınırlama canlı hareketli kirpikler hareketinde azalma atfedilir.

Canlı fare beyninde ependim kirpikler fonksiyonu Ölçme Bu protokol açıklanan yöntem fare beyninin yanı sıra izleme ve kirpikler dayak frekansı incelemek için disseke taze dokuda ependim kirpikler işlev ve yapısını izlemek için kullanılır. Tam bir deney gerçekleştirmek için, ardından adım şematik bir akış şeması (Şekil 1) &#39;de tasvir edilmektedir. Oldukça deneme mümkün olduğunca aktif hareketli kirpikler tutmak için kısa bir zaman dilimi içinde yapılır tavsiye edilir. Tems...

Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak, fare beyin ventriküller içinde yer alan hareketli ependim kirpikler dayak bir ex vivo gözlem canlı görüntüleme ile gösterilmiştir. teknik, özel bir siliyer atan frekansının kayıt ve dayak açısı aynı zamanda bunların hücre içi kalsiyum salınım ilerleme hızı özellikleri sağlar.

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Bu prosedürün genel amacı, fare beyin ventrikülleri içinde yer alan Motr append CLIA'nın atışlarının ex vivo gözlemini sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle tüm beynin hasat edilmesi ve ardından lateral ventriküller üzerinden ince kesitler alınmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, dokunun deney sırasında canlı kalmasını sağlamak için kesitler, vücut sıcaklığında yüksek glukozlu besiyeri içeren özel bir cam tabanlı plakada inkübe edilir.Son olarak, siliyumların atımları yüksek çözünürlüklü bir diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak kaydedilir. Nihayetinde, siliyumların yapısı ve protein lokalizasyonu, immunofloresan görüntüleme ile görselleştirilebilir. Mevcut yöntemimizin bu tekniğe göre temel avantajı, epidermal hücrelerin kendilerine özgü siliyer tekrarlama frekansları ve açılarına göre üç farklı gruba ayrılmasına olanak tanıyan ilk teknik olmasıdır.Bu oldukça iyi. Bu tekniğin ima ettiği sonuçlar, hidrosefalus tedavisine kadar uzanmaktadır; çünkü anormal epidermal CLIA fonksiyonu, beyinde serebrospinal sıvının birikmesine yol açar.Ventriküller. Prosedürü uygulamak üzere laboratuvarımızın çok yetenekli öğrencileri Bayan Zaha Alam ve Bayan Hannah sat görev alacaklar. Yetişkin bir farenin başını %70 ethanol ile temizleyerek başlayın. Ardından, başın üst kısmından başlayarak, deriyi sıyırmak ve kafatasını açığa çıkarmak için steril makas ve pens kullanın.Ardından, posterior taraftan başlayıp anterior tarafa doğru ilerleyerek kemiği parça parça iyileştirin. Kafatasını çıkarmak için tüm beyni seçin ve 37 °C'de, yüksek glukozlu besiyerli 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Keskin bir bıçak kullanarak beyni median sagittal düzlemden kesin ve her iki yarıdan ilk 100 ila 200 µm'lik kesiti elde edin.Ardından kesitleri 37 °C PBS ile durulayın ve dokuyu derhal 37 °C'ye yerleştirin. Kesitleri görüntülemek için, beyin dilimlerini 1 mL yüksek glikozlu besiyeri içeren 30 mm cam tabanlı kültür kaplarına yerleştirin ve kapalı mikroskop odası ortamını, 60x objektifli yağ daldırma lens kullanarak 37 °C ve %5 CO2 değerlerine ayarlayın. Sonrasında, standart DIC iletim ışığı ile hücrelere odaklanın.Ardından, motil append clia'nın konumunu belirlemek için kılavuz olarak DMEM kabarcığının hareket yönünü takip edin. Beynin lateral ventrikülünde, motil CLIA içeren sağlıklı hücrelerin bulunduğu bir alanı seçmek için DIC filtresini kullanın. Append clia tanımlandıktan sonra, tatmin edici bir görüntü elde etmek için ışığı ve odağı ayarlayın.Ardından, görüntüleme yazılımında canlı görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Örneğin burada, 60 x objektif ve 5 ila 10 milisaniyelik pozlama süresiyle birlikte, kamera binning değeri bir kere bir olarak ayarlanmış şekilde 24 bit görüntüler alınmaktadır. Minimum pozlama süresi için mikroskop diyaframını optimal seviyeye açın ve DIC görüntülerini toplayın.Görüntüleri gecikmesiz, hızlı ve anlık olarak elde edebilmek için kameraya aktarılan canlı görüntüleri gözlemleyin. Silly beating hızı, kalsiyum sinyallemesini kaydetmek için yeterli görüntü kontrastı elde edilmesini sağlayan minimum pozlama süresi gereksinimine göre hesaplanabilir. Beyin dilimlendikten sonra, dokuyu kısa bir süre PBS ile yıkayın ve kesitleri hemen cam tabanlı bir plaka içinde, yeni hazırlanmış 20 micrograms per milliliter lu O2 ile inkübe edin.37 °C'de 30 dakika bekledikten sonra, kalsiyum osilasyonunu beş milisaniyelik bir yakalama hızıyla minimum bir saniye boyunca kaydedin. Önce 488 nanometre uyarım dalga boyunda, ardından 515 nanometre emisyon dalga boyunda işlem yapın. İlgilenilen hücre belirteçlerini immünofloresan mikroskopi ile görselleştirmek için örnekleri PBS içinde %4 paraformaldehit ve %2 sükroz ile 10 dakika boyunca sabitleyin.Dokuyu, her yıkama beş dakika sürecek şekilde, PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, beyin kesitlerini 0,1% Triton X içinde beş dakika boyunca inkübe edin. Örnekleri az önce gösterildiği gibi duruladıktan sonra, fare anti asetile alfa tubulin ile inkübe edin.Bir başka PBS yıkamasının ardından, örnekleri oda sıcaklığında bir saat boyunca floresein anti-US IgG ile inkübe edin. Son olarak, kesitleri beş dakika boyunca DPI ile karşı boyayın ve hücreleri mümkün olan minimum pozlama süresiyle hemen görüntüleyin. Bir penal CLIA varlığı, DPI karşı boyamasıyla birlikte siliyer marker asetile alfa tubulin ile doğrulanır. Çekirdekleri tanımlamak için, bir penal CLIA motilitesinin akış analizi, hareketli hücrelerin vuruş frekansı ve açı paterni sayılarak gerçekleştirilir.CLIA, bu verilere dayanarak üç gruptan birine ayrılabilir. Önemli bir nokta olarak, CLIA'nın %0,25 Ethanol'e maruz bırakılması, tiplerinden bağımsız olarak CLIA vuruş frekansını önemli ölçüde baskılamaktadır. CLIA'nın daha fazla bükülmesi, beyin ventrikülleri içindeki hücre içi kalsiyum sinyalinin ölçülmesine olanak tanıyan siliyum bağımlı bir hücre içi kalsiyum sinyallemesini tetikler. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütülürse bir saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, beyin ventriküllerinin gelişimi tamamlandıktan sonra zarar görmemesi için beyin dokusunun nazikçe ve verimli bir şekilde işlenmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların append CLIA ve canlı fare beyin dokusunun fonksiyonlarını keşfetmelerine yol açmıştır.

live-imaging-ependymal-cilia-lateral-ventricles-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Source: Maruoka, H., et. al. uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2022) Bu video, görsel stimülasyon sırasında uyanık bir farede nöronal aktiviteyi ve mikroglial dinamikleri görüntülemek için iki fotonlu bir mikroskopi prosedürünü göstermektedir. kalsiyum geçişleri ve hücresel etkileşimler.

Uyanık Bir Farede Mikroglial Dinamiklerin ve Nöronal Aktivitenin Eş Zamanlı Görüntülenmesi

Kaynak: Wiegreffe, C., et. al.,  {{}}In Utero Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 44}} (2017) Bu video, transdüksiyonlu fare embriyonik beyin dilimlerinde radyal glial iskeleler yoluyla subventriküler bölgeden kortikal plakaya kortikal nöron radyal göçünü gözlemlemek için hızlandırılmış konfokal mikroskopiyi göstermektedir.

Transdüksiyonlu Fare Embriyonik Beyin Dilimlerinde Kortikal Nöron Radyal Migrasyonunun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Source: Al Omran, A. J., et al. Fare beyninin lateral ventriküllerindeki ependimal kirpiklerin canlı görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2015). Bu video, ependimal vuruşunu gözlemlemek için diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanan bir canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir Sagital fare beyin bölümlerinde kirpikler. Ependimal kirpikler beyin omurilik sıvısını (BOS) iter ve aktiviteleri, besin açısından zengin bir ortamda tutulan beyin bölümlerinde kaydedilir ve iklim kontrollü bir...

Bir fare beyin bölümünde ependimal hücreli siliyer aktivitenin canlı görüntülenmesi

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Bu yöntem, gezinmek ve hayvanın başının sağlam tespiti gerektiren mikroskobik görüntüleme veya tek hücreli elektrofizyolojik kayıtlar sırasında keşfetmek fare için somut, tanıdık bir ortam yaratır.

Düz zeminli Hava kaldırdı Platform: Yeni Bir Yöntem Awake üzerinde Mikroskopi veya Elektrofizyoloji ile davranışı birleştiren için serbestçe Kemirgenler Hareketli

Multifoton görüntüleme sadece doku yüzeyinden sınırlı derinliklerde etkili olurken, pCLE ile herhangi bir derinlikte 3 μm çözünürlükte görüntüleme elde etmek mümkündür. Burada, iktal ve vahşi tip farelerin hipokampusundaki mikrovasküler dinamikleri ölçmek için pCLE görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.

Uyanık Farelerde Hipokampal Kılcal Damarların İn Vivo Fiber Bağlantılı Klinik Öncesi Konfokal Lazer Taramalı Endomikroskopisi (pCLE)

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin fare beyni lateral ventrikül ependimal silyalarının canlı görüntüleme yöntemini. Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast mikroskobisi ile silya atım frekansı ve açısını inceleyin.

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet