Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bilinmeyen işlevlere sahip faj genlerini taramak ve karakterize etmektir. İlk olarak, varsayılan faj. ORF adı verilen viral açık okuma çerçeveleri e coli cinsinden ifade edilir.

Faj klonları. E coli eksprese eden Orff, büyüme, ortam ve çeşitli substratlar içeren çoklu fenotip tahlil plakalarına veya haritalarına aşılanır. Bakteri üremesi daha sonra ikinci bir analiz yöntemi olarak spektrometri ile zaman içinde izlenir, e coli eksprese eden faj geni ya sürekli kültürde ya da seri toplu kültürleme ile büyütülür.

Elde edilen büyüme metabolitleri daha sonra toplanır ve gaz kromatografisi, uçuş zamanı kütle spektrometresi ile metabolomik analiz için gönderilir. Elde edilen veriler, tek bir varsayılan faj açık okuma çerçevesinin ekspresyonu ile ilişkili fenotipik bir profil sunar. Bu yöntem başlangıçta bilinmeyen flakon proteinlerinin işlevini aydınlatmak için geliştirilmiştir.

Ayrıca, genotipler ve fenotipler arasındaki bağlantıyı inceleyen çalışmalara ve biyomlar arasında bakteri fajı ve konakçı arasındaki etkileşimleri inceleyen çalışmalara da uygulanabilir. Bu prosedüre, steril 96 kuyulu mikrotitre plakalarını, testte test edilen substratları gösteren e coli klon tanımlama numarası ve harita şematik tipi ile etiketleyerek başlayın. Steril suyu aseptik olarak sıvı bir rezervuara aktarın.

Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, mikrotitre plakasının her bir oyuğuna 60 mikrolitre su aktarın. Daha sonra, üç X bazal ortamı aseptik olarak bir sıvı rezervuara aktarın. Daha sonra çok kanallı bir pipetleyici kullanarak, mikrotitre plakasının her bir oyuğuna 50 mikrolitre aktarın.

Aynı tekniği kullanarak, harita şemasında kullanılan her bir bazal ortamdan 50 mikrolitre pipetleyin. Daha sonra, her bir alt tabakanın 30 mikrolitresini uygun olana aktarın. Daha sonra, çok kanallı bir pipetleyici kullanarak, her bir oyuğa 10 mikrolitre bakteri hücresi aktarın.

Pipeti kültür stoğuna yeniden yerleştirmeden önce uçları değiştirdiğinizden emin olun. Her plakayı yapışkan bir plaka filmi ile kaplayın. Eşit ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için filmi plakanın kuyularının üzerine ve kenarları boyunca sıkıca bastırın.

Steril bir tıraş bıçağı kullanarak, mikrotitre plakasının kenarlarındaki fazla filmi temizleyin. Hazırlanan haritayı bir çoklu spektrofotometrenin giriş manşonuna yerleştirin. Plaka okuyucu yazılımını açın ve toplam 32 saat boyunca her 30 dakikada bir absorbansı ölçmek için bir protokol oluşturun.

Okumalar arasında 60 saniye çalkalayarak, cihazdaki sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Harita ayarlanan sıcaklığa dengelendikten sonra, 32 saat sonra protokolü başlatın, haritayı plaka okuyucunun çıkış manşonundan çıkarın. Her veri dosyasını e coone kimlik numarası, tarih ve harita şematik türü ile etiketleyin.

Büyümeyi ve biyolojik olarak ilgili büyümeyi değerlendirmek için verileri ekteki belgede açıklandığı gibi analiz edin. Parametreler: Metabolit analizinden hücreler, sürekli veya seri geçişli toplu Turing ile kültürlenebilir. Kararlı bir durumu korumak için.

Burada sürekli bir kültür göstereceğiz. 75 mililitrelik sürekli kültür reaktörünün ve iki litrelik bir besleme şişesinin bileşenlerini ekteki belgede açıklandığı gibi sterilize edin Sterilizasyonun ardından, tüm otoklav malzemelerini biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin ve ortam soğurken ultraviyole ışığını açın. Ortam soğuduktan sonra,% 0.1 L arabinoz ve mililitre başına 100 mikrogram ekleyin.

75 mililitre 0.5 XLB et suyuna ampisilin ve sürekli reaktöre aktarın. Sürekli kültür reaktör kapağını açın ve reaktöre vidalayın. Numune alma tüpüne dokunmaktan kaçının, biberon kapağını açın ve biberona vidalayın.

Örnekleme tüpüne dokunmaktan kaçının, 18 inçlik boruyu port epsilon'a bağlı steril tutun. 18 inç boruyu ve peristaltik pompa borusunu açın. Adaptör, 18 inç borunun bir ucunu peristaltik pompa borusunun bir ucuna takın, adaptör peristaltik pompa boru adaptörünün diğer ucunu 18 inç boruya takın.

Biberon kapağının takılı portu epsilonu, sıfır noktası 22 mikron filtre ünitelerini sürekli kültür reaktörünün portlarına, betasına ve deltasına takın. Alfa portunun adaptörüne sıfır noktası 22 mikronluk bir filtre ünitesi takın. Ve bunun için, 18 inçlik boruyu biyogüvenlik başlığına takın.

Sürekli kültür reaktörünü, ekteki belgede açıklandığı gibi hazırlanan 100 mikrolitre bir gece boyunca e coli kültürü ile aşılayın. Reaktörü ve biberon kapaklarını sıkın ve ardından sistemi 37 derecelik bir inkübatöre taşıyın. Manyetik karıştırma plakası ve mini peristaltik pompa ile donatılmış, peristaltik pompa boru adaptörünü peristaltik pompaya takın.

Biberondan gelen boru pompaya girer ve reaktöre çıkar. Pompayı hızlı olacak şekilde ayarlayın ve ardından çalıştırın. Ortamın borudan akmaya başladığından emin olmak için ileri kontrole geçin.

Reaktörü manyetik karıştırma plakasına yerleştirin ve karıştırmaya başlayın. Ertesi gün numune almadan önce sürekli kültür reaktörünün 24 saat dengelenmesine izin verin. Sürekli kültürü örneklemek için, beş mililitrelik bir yem kilit şırıngasını port gamasına vidalayın ve 4,5 mililitre kültürü geri çekin.

600 nanometredeki optik yoğunluğu ölçmek için 500 mikrolitre kültür kullanın. Daha sonra, numuneleri gaz kromatografisi, uçuş süresi kütle spektrometresi veya GC'den F ms'ye hazırlamak için 0.35 ve 1.7 mililitrelik mikro füj tüplerinin OD 600'ünde dört adet bir mililitre kültür yapmak için alikotun geri kalanını kullanın. Hücreleri pelet yapmak için iki dakika boyunca 16, 900 kez G'de santrifüjleyin.

Sıkma işleminden sonra, süpernatan daha sonra 500 mikrolitre PBS ile yıkanır. Bu yıkamayı gerçekleştirin. İkinci kez adım atın, süpernatanı son kez boşaltın ve ardından peletlenmiş hücreler içeren mikro füj tüplerini sıvı nitrojene batırın.

Köpürme durana kadar numuneleri eksi 80 derecelik bir dondurucuda saklayın. Tüm numuneler toplandıktan sonra dört gün boyunca her 12 saatte bir numune alımını tekrarlayın. Viral açık okuma çerçeveleri elde etmek için numune işleme analizi ve GC'nin f ms'ye normalleştirilmesi için kuru buz üzerinde klon başına üç numuneyi bir metabolomik çekirdek tesisine gönderin.

Deniz suyu, mercan sınır tabakasının altındaki Southern Line Adaları'ndan Starbuck Adası ve Caroline AOL'den toplandı. 72 karbona özgü koşul altında bakteri üremesi, haritalar kullanılarak 47 klon için değerlendirildi. Elde edilen veriler daha sonra klonları beklenen büyüme, işlev kazancı, işlev kaybı ve büyüme fenotipi olmaması olarak kategorize etmek için kullanıldı.

İşlevsel olarak benzer proteinleri barındıran klonların metabolomik profillere sahip olduğu hipotezini test etmek. GC TOF ms ile sürekli kültürde yetiştirilen 84 klon için medyan metabolit bollukları belirlendi. Elde edilen veriler daha sonra klonları, renkle gösterilen nispi metabolit bolluklarına göre hiyerarşik olarak kümelemek için kullanıldı.

En bol metabolitler kırmızı renkle gösterilirken, en az bolluk koyu mavi ile gösterilir. Ön metabolomik analiz, yapısal ve metabolik genlerin birbirinden net bir şekilde ayrılmamasına rağmen, konakçı üzerinde benzer etkiler sergileyen genlerin korelasyon gösterdiğini ortaya koydu. Örneğin, açıklamalı kapsid geni, bu çalışmada vurgulanan varsayılan metabolik genlerle yakından kümelenir EDT 24 40 ve EDT 24 41 araştırmaları, halka açık bir transmembran topolojisi ve sinyal peptit tahmin programı kullanılarak yapılan araştırmalar, her iki varsayılan metabolik genin de tek bir transmembran alanı barındırdığına dair kanıt gösterdi.

İlginç bir şekilde, ilk küme grubundaki dokuz klondan beşi, aynı topolojiyi kullanarak transmembran alanlarını tahmin etmiştir. Bu veriler birlikte ele alındığında, bu yöntemin klon metabolit profilleri, ilgili fonksiyonlara sahip potansiyel klonlar ve klon metabolit aykırı değerleri hakkında bilgi sağlayabildiği görülmektedir. Bu prosedürü denerken, sunulan yöntemlerin bakteri fizyolojisinden büyük ölçüde etkilendiğini hatırlamak önemlidir.

Klonal bağımsız grupların kontaminasyonla deney yapılmasının önlenmesi ve uygun kontroller kullanılarak tek bir değişkenin test edilmesini sağlamak için dikkate alınması gerekir.