In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

Bakterilerin kesme gerilimi altındaki kan damarları ile etkileşimini incelemek için, vasküler yapışmaya katkıda bulunan bakteri ve konak faktörlerini incelemeye izin veren bir akış odası ve in vivo mezenterik intravital mikroskopi modeli tanımlanmıştır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, saf stres altında bakteri ile endotel ve alt endotel arasındaki etkileşimi araştırmaktır. Bu, ikinci adım olarak video mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için bakterileri floresan olarak etiketleyerek elde edilir. Bir in vitro akış odası, akan bakterilerin hücresel veya matris bileşenlerine yapışması ile ilgili farklı oyuncuları incelemek için kullanılır.

Daha sonra, in vitro modelde tanımlanan etkileşimler, karmaşık bir organizmadaki ilgilerini test etmek için in vivo mezenterik perfüzyon modelinde incelenmiştir, sonuçlar staphylococcus reus'un aktive edilmiş endotel hücrelerine ve kesme stresi altında alt endotelyuma yapışabildiğini göstermektedir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, endovasküler enfeksiyonların patogenezini incelemek için ücretsiz olan hem in vitro hem de in vivo model içermesidir. Bu yöntemler, bulaşıcı hastalıklar ve vasküler biyoloji alanında, enfektif endokardit ve metastatik enfeksiyonların fizyolojik stres altında nasıl oluştuğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, bu da laboratuvarımızdan hayvan işlerinde uzmanlaşmış bir teknisyen olan Malin'e bakar Bakterileri izlemek için kullanılan floresan boyayı hazırlayarak başlayın.

Stok karboksi floresan solüsyonundan 150 mikrolitre laboratuvar sınıfı suya 850 mikrolitre ekleyin ve karıştırın. Solüsyonu ışıktan korunarak eksi 20 santigrat derecede ihtiyaç duyulana kadar saklayın. Sonraki pelet, beş mililitrelik bir S reus kültürü.

Triptik soya suyunda gece boyunca üreyen bakteriler PBS ile bir kez yıkanır ve ardından yeniden süspanse edilir. 800 mikrolitre PBS'deki yeni pelet, in vitro perfüzyon deneyleri için yeniden süspanse edilmiş hücrelere 200 mikrolitre boya çözeltisi veya 400 mikrolitre boya çözeltisi ekler. İn vivo deneyler için, boyanın foto-ağartılmasını önlemek için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Daha sonra, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için karışıma PBS'de% 6 sığır serum albümin çözeltisi ekleyin. Optik sitometri kullanarak hücrelerin konsantrasyonunu kontrol edin ve uygulamalarına bağlı olarak bakterileri çeşitli konsantrasyonlarda PBS'ye seyreltin. Seyreltildikten sonra tüpleri ışıktan koruyun ve buzun üzerine yerleştirin.

Laboratuvar sınıfı suda von Vand faktörünü mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Ayrıca kollajeni izotonik glikoz çözeltisi içinde mililitre başına 160 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Daha sonra her kaplamanın 200 mikrolitresini bir paraform şeridine bırakın.

Proteinlerle kaplamak için kapak fişlerini damlacıkların üzerine yerleştirin. Kapak fişini nemlendirilmiş bir kapta oda sıcaklığında dört saat inkübe edin. Daha sonra, kapak fişlerini künt bir iğne ile paraformdan dikkatlice kaldırın ve endotel hücreleri ile deneyler için kapak fişini bir akış odasının alt kısmına monte edin, plastik fişleri PBS'de bir mililitre% 1 jelatin çözeltisi ile kaplayın ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra insan göbek damarı endotel hücrelerini jelatin kaplı plastik astarlar üzerine tohumlayın ve bunları %70 ila 80 co akıcılığına kadar büyütün. Protein kaplı kapak fişini veya endotel hücresi kaplı plastik astarı akış odasının alt kısmına monte edin. Ardından giriş ve çıkış borusunu akış odasının üst kısmına bağlayın ve çıkış borusunu bir atık kabına bağlayın.

Akış odasının üst kısmını yavaşça alt kısma yerleştirin ve akış odasını monte edin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlerken. Haznenin sızıntı yapmadığından emin olmak ve fazla kaplama solüsyonunu çıkarmak için hazneye bir mililitre ortam enjekte edin.

Daha sonra, infüzyon pompasını bir mililitrelik bir şırınga için dakikada 75 mikrolitre akacak şekilde ayarlayın. Karanlık bir odada çalışarak, bir mililitrelik şırıngayı bir mililitre floresan etiketli bakteri ile doldurun ve infüzyon pompasına yerleştirin. Şırınganın çıkışını akış odasının girişine bağlayın.

Hava kabarcıklarını önlemeye dikkat ederek, infüzyon pompasını dakikada 75 mikrolitre ile 10 dakika çalıştırın. 10 dakika sonra, ilk şırıngayı çıkarın ve PBS veya DMEM içeren bir mililitrelik bir şırıngayı giriş tüpüne bağlayın. İnfüzyonu başlatın, pompalayın ve bağlanmamış bakterileri temizlemek için 10 dakika durulayın.

Durulandıktan sonra, infüzyon pompasını açık bırakın ve rastgele konumlarda 1,5 saniyelik bir pozlama süresi kullanarak, akış odasının kaplanmış yüzeyine yayılmış en az 15 siyah beyaz görüntü çekin. Image J. gibi bir görüntü analiz programı kullanarak görüntüden düzgün sürekli arka planları kaldırmak için arka planı çıkarın ve gri tonlamalı görüntüleri ilgilenilen özelliklere ayıran alt ve üst eşik değerlerini ayarlamak için eşiği tanımlayın. Ardından, yeni oluşturulan eşikle sınırlı alanı ölçün ve her numune için floresan alan olarak bilinen bu değeri kaydedin.

Bağırsak hareketini azaltmak için deneyden önceki gece sekiz haftalık farelere hızlı bir şekilde test edildi. Deney günü, vücut ağırlığının kilogramı başına 0.1 miligram buprenorfin analjezik olarak enjekte edilerek başlar. Ardından, fareyi uyuşturun ve gözlere merhem sürün.

Fareyi diseksiyon dürbünü altındaki termo kontrollü ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve farenin taç yaprağı refleksi göstermediğini test edin. Şah damarına paralel bir santimetrelik bir kesi yapın. Servikal kasın sağ tarafını çıkarın ve ardından juguler veni çevreleyen dokudan izole edin.

Sağ juguler ven içine iki Fransız intravenöz kateter yerleştirin ve dikişler kullanarak yerine sabitleyin. Daha sonra periton boşluğunu açmak için orta hat abdominal insizyon yapın. Fareyi sağ tarafına şeffaf bir plaka üzerine yerleştirin ve kanülü bantla sabitleyin.

Pamuklu çubuklar kullanarak bağırsakları nazikçe dışarı çekin ve mezenteryumu yayın. Mezenterik arteriolar ve ular dolaşımı görselleştirmek. Hipotermiyi önlemek için farenin üzerine sıcak bir paket yerleştirin ve dokunun dehidrasyonunu önlemek için her 30 dakikada bir bağırsaklara 500 mikrolitre% 0.9 NACL damlatın.

Damarları hareketsiz hale getirmek için pamuklu çubuklar kullanın ve bunları ters çevrilmiş bir mikroskop altında görselleştirin. Daha sonra topikal olarak, DMSO'da çözünmüş 10 milimolar kalsiyum iyono dört çözeltisinden beş mikrolitre uygulayın. Bu, damarlardaki endotel hücrelerinden gelen faktör olan Von Villa Brandt'ın salınımını aktive edecektir.

10 saniye sonra, floresan işaretli bakterilerden 100 mikrolitre juguler kateter yoluyla enjekte edin. Şu anda, hızlandırılmış görüntüler çekmeye başlayın, saniyede 1000 görüntüden oluşan 40 döngü kullanarak araç çubuğundaki yakalama aracını kullanarak hızlandırılmış görüntüler elde edin. Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, fareyi kurumsal yönergelere göre ötenazi yapın.

Görüntüleri uygun bir görüntü dosyası formatında kaydedin ve ardından görüntüleri, bakteriyel yapışma üzerindeki saf stresin rolünü vurgulamak için daha önce açıklandığı gibi görüntü J analiz yazılımını kullanarak işleyin, staphylococcus aureus perfüzyonları Von Vbr faktör kaplı örtü fişleri üzerinde farklı kesme hızlarında gerçekleştirildi. Saf oranlar arttıkça, bakteriyel yapışma da artar, bu da yüksek kesme kuvvetlerinin bakterilerin proteine yapışmasını engellemediğini, ancak güçlendirdiğini gösterir. Von Vand faktörünün yokluğunda, staphylococcus aureus'un kollajene yapışması, artan kayma hızları ile azalmıştır.

Bununla birlikte, ortamda Von Vand faktörü mevcut olduğunda, artan kesme hızları ile bakterilerin yapışması artmış, vand faktörünü serbest bırakmak için bir kalsiyum iyono dört ile aktive edilen endotel hücreleri, aktive edilmemiş hücrelere göre önemli ölçüde daha fazla bakteriyel yapışma göstermiştir. Ek olarak, bakteriler, saf kuvvet yönünde hizalanmış, floresan olarak etiketlenmiş bakteri kümelerinin tipik dize benzeri desenlerini oluşturdu, bu da bakterilerin Von Vbr faktörünün etkisini test etmek için doğrusal gerilmiş bir VWF molekülü boyunca bağlanmasını düşündürdü. mezenterik dolaşımın in vivo endotel hücreleri von Vbr faktörünü serbest bırakmak için aktive edildi, Daha sonra floresan etiketli bakteri hücreleri kan dolaşımına sokuldu. Bakteriler lokal olarak aktive olmuş damar duvarına yapışmış ve agregalar oluşturmuştur.

Bu videoyu izledikten sonra, bakterileri floresan olarak etiketleyerek ve hem in vitro akış odasında hem de in vivo intra vital mezenterik füzyon modelinde görselleştirerek, kesme gerilimi üzerinde bakteriler ve damar duvarı ile etkileşimin nasıl araştırılacağını daha iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, kardiyovasküler enfeksiyonlar alanındaki araştırmacıların, enfektif endokardit ve metastatik enfeksiyonlarda patojenler ve damar duvarı arasındaki etkileşimi keşfetmelerinin önünü açmaktadır.