Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme In Vivo Beta ve gamma-Radyasyonun Çok Düşük Doz Maruz Kalma

Fare dalak lenfositlerinde kronik in vivo düşük doz ışınlamanın neden olabileceği DNA hasar seviyelerindeki ve DNA onarım kapasitesindeki değişiklikleri, DNA çift sarmallı kırılmaların bir belirteci olan fosforile histon H2AX'i ölçerek, akış sitometrisi kullanarak değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, düşük dozlarda beta veya gama radyasyonuna kronik in vivo maruz kalma yoluyla fare dalak hücrelerinde indüklenen DNA hasarını ve onarımını ölçmektir. Bu, DNA hasarı ve onarımındaki potansiyel değişiklikleri tetiklemek için önce fareleri dahili beta veya harici gama ışınlamasına maruz bırakarak elde edilir. İkinci adım olarak, PLE sitleri izole edilir ve DNA onarımının izlenmesine izin vermek için saptanabilir DNA hasarını indükleyen yüksek zorlu bir gama radyasyonu dozu ile ışınlanır.

Zamanla, dalak hücreleri daha sonra DNA hasarının niceliksel olarak ölçülmesine izin vermek için gama H, iki A x'e karşı floresan olarak immüno-etiketlenir. Sonuç olarak, 10 santigrat kadar düşük akut gama radyasyonu dozları tarafından üretilen DNA hasarı, akış sitometrisi ile ölçülebilir. Bu yöntem, mesleki, tıbbi veya kamusal bir ortamda tipik olarak karşılaşılan düşük dozda radyasyonun kanser gibi zararlı sağlık etkilerinin olasılığını gerçekten artırıp artırmadığı gibi radyo koruma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Tekniğimizin, immünofloresan mikroskobu kullanarak gama H iki A X odağını sayma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, tekniğimizin analiz için önemli ölçüde daha az zaman gerektirmesi, büyük ölçekli hayvan çalışmaları için uygun hale getirmesi ve gama H iki A X kantifikasyonunda operatörle ilgili yanlılığı azaltmasıdır. Bu tekniğin etkileri, ilacın kişiselleştirilmesine ve kanserin radyoterapisine kadar uzanır ve hastanın Radyoterapi doz rejimini ayarlamak için periferik kan lenfositleri kullanılarak bireysel hasta radyo duyarlılıkları belirlenebilir. Bu yöntem radyasyonun toksisitesi hakkında fikir vermesine rağmen, çevresel kimyasal kirleticilerin toksisitesinin araştırılması veya in vivo farelerde DNA hasarı oluşumu ve onarımının temel mekanizmaları gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir.

Dahili beta ışınlaması için, hayvanları bir ay boyunca harici gama ışınlaması için trityum suyuna AD libitum erişimi ile tedavi edin. Trityum maruziyetinin doz hızına uyması için tüm fare kafesini bir gama radyasyon kaynağından uygun mesafeye yerleştirin. Bir ay boyunca maruziyeti başlatın ve koruyun.

Maruziyetin sonunda toplam absorbe dozlarını ölçmek için termolüminesans dozimetreleri kullanın. Dalak toplama gününde, hayvan başına küçük bir boş Petri kabının içine bir hücre süzgeci yerleştirin ve her yemeğe beş mililitre RPMI ortamı ekleyin. Daha sonra ötenazi yapılmış bir fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve hayvan tamamen ıslandığında saça% 70 etanol püskürtün.

Üretral açıklığın önündeki cildi tutmak için forseps kullanın ve bu kesiden perineal bölgede küçük bir kesi yapın. Ventral orta hat boyunca göğüs boşluğuna kadar kesin, altındaki kas duvarını değil, sadece cildi kesmeye özen gösterin. Cildi orta hattan uzakta inceleyin.

Daha sonra karın duvarını forseps ile kavramak. Karın boşluğunu açmak için kasın medyan erişimini kesin. Dalağı bulun ve steril forseps ile hafifçe kavrayın.

Ardından, aynı anda bağ dokusunu temizlerken dokuyu nazikçe çekin. Aşağı akış analizleri için dalağın yaklaşık 10'da birini çıkarın. Daha sonra dokunun geri kalanını, tüm dalaklar toplandıktan sonra iki saate kadar hücre süzgeçlerinden birine aktarın.

Dokuların her birini kendi hücre süzgeçleri içinde kıymak için steril kavisli forseps kullanın. Dalaklar yeterince homojenize edildiğinde, süzgeçleri çıkarın ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik tüplere aktarın. Süzgeçlerin her birini ek beş mililitre ortamla durulayın, yıkamaları hücre süspansiyonlarının geri kalanıyla birlikte çekin ve hücreleri iki kez santrifüjleyin Resus, ilk dönüşten sonra peletleri her biri 10 mililitre taze RPMI'de askıya alın.

İkinci dönüşün ardından. Peletleri beş mililitre RPMI'de yeniden süspanse edin ve elde edilen hücre süspansiyonlarının dört mililitresini 37 santigrat derecede inkübasyon için 25 mililitrelik doku kültürü şişelerine ve %80 nemli% 5 karbondioksite aktarın. Hücre süspansiyonlarının geri kalanını yeni 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve dört santigrat derecelik hücreleri santrifüjleyin.

Bir vakum pompası kullanarak, süpernatanları dikkatlice aspire edin ve peletleri bir mililitre TBS tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin ve supinatı tekrar vakumladıktan sonra hücreleri tekrar döndürün. Reese, peletleri her biri 300 mikrolitre TBS'de askıya alır. Daha sonra düşük hızda girdap yaparken, 700 mikrolitre eksi 20 santigrat derecede, her tüpe% 100 etanol.

Daha fazla karıştırmak için tüpleri birkaç kez ters çevirin. Daha sonra numuneleri eksi 20 santigrat derecede 12 aya kadar saklayın. Onarım makinesine meydan okumak için DNA çift iplikçik kırılmalarını indüklemek için.

Dakikada 200 mini gras'a eşit veya daha az bir doz hızında iki gri gama radyasyonu ile ışınlayıcı scy kültürü. Meydan okumanın hemen ardından, kültürü CO2 inkübatörüne geri koyun. Bir saat sonra, ışınlanmış kültürü biyolojik bir güvenlik kabinine aktarın ve hücreleri nazikçe yeniden süspanse etmek için bir pipet kullanın.

Elde edilen hücre süspansiyonunun bir mililitresini buz üzerinde 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve ardından hücreleri aşağı doğru döndürün. Supinatı dikkatlice aspire etmek için vakum pompasını kullanın ve ardından peletleri bir mililitre TBS'de nazikçe tekrar süspanse edin. Daha sonra ikinci bir TBS yıkamasından sonra, hücrelerin immünofloresan analizi için eksi 20 santigrat derece depolama için gösterildiği gibi hücreleri etanole sabitleyin.

İlk olarak, uygun numune tüplerine 0,5 mililitre buz gibi TBS ekleyin. Bir sonraki girdap aliquot Eloqua, sabit bir eksi 20 santigrat derece SPL sitlerini beş saniye boyunca depoladı. Daha sonra 0,5 mililitre hücreyi uygun tüplere aktarın ve hafifçe döndürün, peletleri %1 FBS ve santrifüj hücreleri içeren bir mililitre buz gibi soğuk TBS'de yeniden süspanse edin.

Yine, daha sonra numuneleri buz üzerinde tüp başına bir mililitre TST tamponunda 20 dakika inkübe edin. Hücreleri döndürdükten sonra, peletleri tekrar 200 mikrolitre birincil anti gama H iki balta antikoru içinde yeniden askıya alın. Daha sonra tüpü, inkübasyonun sonunda 300 kez G ve oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca 45 ila 60 derecelik bir açıyla dönen bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.

Numuneleri% 2 FBS içeren bir mililitre buz gibi soğuk TBS'de iki kez yıkayın. Daha sonra peletleri çalkalama platformunda 200 mikrolitre taze hazırlanmış ikincil antikor içinde yeniden süspanse edin. Bir saat sonra, hücreleri% 1 FBS içeren TBS adı verilen bir mililitre buzda yıkayın, ardından tek başına TBS adı verilen bir mililitre buzda yıkayın.

Son olarak, PROPIDIUM iyodür içeren 0,5 mililitre TBS'deki peletleri yeniden süspanse edin Bu grafiklerde, temsili akış sitometrik sonuçları gösterilmektedir: Hücreler ilk olarak elektronik hacim taraflarına göre kapılanmıştır. Saçılma propidyum iyot boyama, hem kontrol hem de radyasyon meydan okuma numunelerinin normal bir hücre döngüsü dağılımı sergilediğini doğruladı. Gama H iki eksen sinyalinin ölçümü, burada tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla iki gri ışınlanmış hücre içinde DNA çift sarmallı kırılmada iki kattan daha büyük bir artış gösterirken, fare sitlerinde nispi gama H iki AX seviyeleri, düşük veya yüksek dozlarda gama radyasyonuna ex vivo maruziyetten bir saat sonra beklendiği gibi gösterilmiştir.

İki gri meydan okumadan sonra çift iplikçik kopmalarının güçlü bir üç kat indüksiyonu tespit edildi. 0.1 griye maruz kaldıktan sonra hafif fakat istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlendi, bu da yöntemin yeterli duyarlılığını gösteriyor. Mikroskopi ile gözlemlenen belirgin odaklar benzeri floresan modeli, sinyalin, boyamanın özgüllüğünü doğrulayan CH kromatin içindeki bireysel DNA çift iplikçik kırılmalarından kaynaklandığını gösterir.

Burada, bir aylık tritiatlı suya maruz kalan farelerden hasat edilen PLE sitleri tarafından sergilenen DNA çift iplikçik kırılmalarının seviyesi gösterilmektedir. Tedavi bazal gama H iki A X seviyesinde% 10'luk bir artışla sonuçlanmasına rağmen, değişiklik istatistiksel olarak anlamlı değildi. Ayrıca, ölçülen gama H iki eksen oluşumu ve kaybında hiçbir fark yoktur.

DNA'nın kinetiğini temsil eden zorluktan sonra, tritiye edilmiş su ile muamele edilmiş farelerden alınan hücreler ile kontrol arasında çift sarmallı fren onarımı gözlendi. Bu prosedürü denerken, yerel radyasyondan korunma derneğiniz tarafından belirlenen kural ve düzenlemelere uymayı ve hem iç hem de dış radyasyon kaynakları kullanılarak büyük ölçekli fare projelerinin gerçekleştirilebileceği sertifikalı bir laboratuvar veya tesis kullanmayı unutmamak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknikler düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse tamamlanması için 10 fare başına yalnızca bir buçuk gün gerektirir.

Bu videoyu izledikten sonra, düşük dozlarda trityum veya gama radyasyonuna maruz kalarak in vivo olarak indüklenen DNA Doublet iplik kırılmalarını ve onarımını ölçmek için Gamma H iki A X ekspresyonunun akış sitometrik analizinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedüre ek olarak, düşük doz radyasyona maruz kalma ile ilişkili sağlık risklerini değerlendirmek için kan lenfositlerinde M FISH, kemik iliği MICRONUCLEUS testi ve stres yanıtı genlerinin ekspresyonunu ölçmek için R-T-Q-P-C-R gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.