Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, zebra yay klonal hücre analizi yoluyla kondrositler arası harmanlama ve uzantıyı görselleştirmektir. Bu, klonal analiz için kraniyal yüz kıkırdağında ve embriyolarda dokuya özgü rekombinasyon elde etmek için bir SOX 10 ERT iki Cree zebra yayı M hattı oluşturularak elde edilir. Daha sonra, embriyolar 10'da tamoksifen ile vurulur, bu nedenle rekombinasyon sürecini indüklemek için üç saat boyunca akar aşaması.

Daha sonra CRE aktivitesinin ekspresyonu ve güçlü kırmızı floresan veya RFP ekspresyonu için embriyolar seçilir ve embriyolar C kraniyofasiyal kıkırdağının görüntülenmesi için monte edilir. Sonuçlar, konfokal görüntülemeye dayalı kraniyofasiyal kondrositlerin multispektral hücre analizini göstermektedir. Bu tekniğin, mavi boyamada S veya SO ve GFP veya SOX ve kde gibi transgenik çizgiler gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, zebra yayının bir organ oluşumunda yer alan klonal hücre popülasyonlarını özel olarak gözlemlememize ve takip etmemize izin vermesidir.

Birinci gün embriyo toplamaya hazırlanmak için, birkaç erkek ve dişi çift sox, 10 ERT iki Cree zebra yayı M transgenik zebra balığını, ışık mikroskobu altında embriyoların RFP filtreli bir floresan mikroskop altında 10 selülit aşamasına ulaştığını doğruladıktan sonra ertesi gün saat beş ile 18:00 arasında bölünmüş çiftleşme tanklarına yerleştirin. Parlak kırmızı embriyoları izole edin ve Cree rekombinasyonunu indüklemek için taze E üç besiyeri olan yeni bir Petri kabına aktarın. Petri kabına 10 mikromolar hidroksi tamoksifen çözeltisi ekleyin ve embriyoları üç saat boyunca 28.5 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra Tamoksifen çözeltisini biyolojik bir atık kabına boşaltın ve embriyoları gece boyunca 28 ila 29'a kadar inkübe ettikten sonra embriyoları birkaç kez yıkamak için E üçünü kullanın, bu nedenle akar aşaması, embriyoları E üç PTU çözeltisine aktarın ve inkübatöre geri koyun. Tam gelişmiş C kraniyofasiyal yapılarını görselleştirmek için, retinada yoğun bir kırmızı sinyal ve sarı Cree ekspresyonu ile dört DPF'de embriyoları seçin. Trica'da bir embriyoyu uyuşturduktan sonra, metin protokolüne göre, temiz bir konfokal slayt üzerinde bir damla Metilselüloz içeren bir Petri kabına aktarın.

Bir damla taze Metilselüloz yerleştirin ve 25'e 25'lik bir örtü kaymasıyla, doğrudan dokunmamaya dikkat ederek dorsal olarak konumlandırılmış embriyoyu monte etmek için bir mikro yükleyici ucu kullanın. Embriyoyu örtün ve gerekirse embriyoyu manipüle etmek için kapak fişini kullanın. Embriyoyu görüntülemek için 20 x kuru lens objektifi kullanın.

Konuya odaklanmak için mikroskop üzerindeki L 100 düğmesine basın, ardından konfokal kurulum düğmesini seçin. Otomatik'e tıklayın ve birinci kanal için CFP'yi, ikinci kanal için GFP'yi ve üçüncü kanal için RFP veya M kirazını seçin. Ardından pencereyi kapatın.

Kilidi kaldır düğmesine tıklamadan önce ikinci ve üçüncü kanalları açın. Ardından taramaya başlamak için oynat'a tıklayın. Ayarları yaptıktan sonra, istenen görüntüleri yakalayın ve konfokal yazılım formatında ve kanala göre görüntü işleme için TIF formatında kaydedin.

CFP görüntüleme yapmak için, odak alanını değiştirmeden ikinci ve üçüncü kanalları kapatın ve birinci kanalı açın. Görüntü yakalamadan önce tarama ayarlarını yeniden yapın, görüntüleri az önce açıklandığı gibi kaydedin ve burada gösterildiği gibi pan ve iş arkadaşları tarafından açıklandığı gibi görüntü işlemeyi gerçekleştirin. Tüm Sian Dağı mavisi boyama ile geleneksel kıkırdak görselleştirmesi, gelişmekte olan mekel kıkırdağının gözlemlenmesinde paha biçilmez olmuştur ve zaman içinde gelişen kondrositleri soy izlemesi boyunca daha fazla analiz etmek için nihai hücresel organizasyonu görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmıştır.

SOX 10 kda transgenik hatların kullanılması, zebra yay m transgenik hattının canlı görüntülemesini kullanarak canlı embriyolarda hücre göçünü ve yakınsamasını ve genişlemesini incelemek için kullanılmıştır. C kraniyofasiyal iskelet yapısındaki kondrositlerin organizasyonunu daha fazla incelemek için, meckel kıkırdağının uzamasına ve büyümesine aracılık eden kondrositler arası harmanlanma ve uzama sürecini ortaya çıkarır. Bu şekil, 3D PF ile döllenmeden beş gün sonra iki Cree transgenik embriyo olan UI zebra yayı M Sox 10 ERT'den alt çeneyi göstermektedir.

Alt çene, burada gösterildiği gibi meles kıkırdağındaki hücre organizasyonunun net bir şekilde görülmesini sağlamak için en iyi ventral olarak resmedilir. İstikrarlı bir şekilde korunan ve kalıtılan renkler, kolay soy izlemesine ve kraniyal nöral krest hücresi kader haritalamasına izin verir. Tek mavi hücre, komşu hücrelerle göç ediyor ve enterpolasyon yapıyor gibi görünüyor, daha sonra tek tip şekilli bir kondra bölgesi oluşturmak için ön arka eksen boyunca uzar, böylece meles kıkırdağının öne doğru uzanırken küresel şeklini korur.

Bu teknik, kedi gelişimi alanındaki araştırmacıların zebra balığı iskelet oluşumunda kondroyu incelemesi için bir yol açmaktadır.