Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, zebra bow klonal hücre analizi aracılığıyla kondrositlerin etkileşimini ve uzamasını görselleştirmektir. Bu, kraniofasiyal kıkırdaktaki embriyolarda klonal analiz için dokuya özgü rekombinasyon sağlamak amacıyla bir SOX 10 ERT two Cree zebra bow M hattı oluşturularak gerçekleştirilir. Ardından, rekombinasyon sürecini başlatmak için embriyolara 10 somit aşamasında üç saat boyunca tamoksifen uygulanır.

Ardından, CRE aktivitesi ekspresyonu ve güçlü kırmızı floresan veya RFP ekspresyonu için embriyolar seçilir ve C kraniofasiyal kıkırdağın görüntülenmesi için embriyolar monte edilir. Sonuçlar, konfokal görüntülemeye dayalı kraniofasiyal kondrositlerin multispektral hücre analizini göstermektedir. Bu tekniğin, mavi boyama gibi mevcut yöntemlere veya so ve GFP veya SOX ve kde gibi transgenik hatlara göre temel avantajı, zebra bow'un bir organ oluşumunda yer alan klonal hücre popülasyonlarını spesifik olarak gözlemlememize ve takip etmemize olanak tanımasıdır.

Birinci gündeki embriyo toplama işlemine hazırlanmak için, birkaç erkek ve dişi sox, 10 ERT two Cree zebra bow M transgenik zebra balığı çiftini saat 17:00 ile 18:00 arasında bölmeli çiftleşme tanklarına yerleştirin. Ertesi gün, embriyoların 10 hücreli evreye ulaştığını ışık mikroskobu altında doğruladıktan sonra, RFP filtreli bir floresan mikroskop altında inceleyin. Parlak kırmızı embriyoları izole edin ve Cre rekombinasyonunu indüklemek için taze E3 besiyeri içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Petri kabına 10 µM hidroksitamoksifen çözeltisi ekleyin ve embriyoları 28,5 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.

Ardından Tamoxifen çözeltisini biyolojik atık konteynerine boşaltın ve embriyoları gece boyunca inkübe ettikten sonra birkaç kez E3 ile yıkayın; embriyolar 28 ila 29 somit evresine geldiğinde, onları E3 PTU çözeltisine aktarın ve inkübatöre geri koyun. Tam gelişmiş kraniofasial yapıları görselleştirmek için, retinada yoğun kırmızı sinyal ve sarı Cree ekspresyonu gösteren 4 DPF'deki embriyoları seçin. Protokole uygun olarak bir embriyoyu Tricaine ile anestezi ettikten sonra, temiz bir konfokal lam üzerindeki bir damla Metilselüloz içeren Petri kabına aktarın.

Taze Metilselülozdan bir damla damlatın ve bir mikro yükleyici uç kullanarak, embriyo ile doğrudan temas etmemeye dikkat ederek embriyoyu dorsal konumda yerleştirin ve üzerine 25 by 25 boyutunda bir lameli kapatın. Embriyoyu kapatın ve gerekirse embriyoyu manipüle etmek için lameli kullanın. Embriyoyu görüntülemek için 20 x kuru objektif lens kullanın.

Konuya odaklanmak için mikroskoptaki L 100 düğmesine basın, ardından konfokal kurulum düğmesini seçin. Auto seçeneğine tıklayın; birinci kanal için CFP, ikinci kanal için GFP ve üçüncü kanal için RFP veya M cherry'yi seçin. Ardından pencereyi kapatın.

Interlock kaldırma butonuna tıklamadan önce iki ve üç numaralı kanalları açın. Ardından taramaya başlamak için oynat düğmesine tıklayın. Ayarları yaptıktan sonra istenilen görüntüleri yakalayın ve bunları hem konfokal yazılım formatında hem de kanal bazlı görüntü işleme için TIF formatında kaydedin.

CFP görüntüleme yapmak için odak alanını değiştirmeden iki ve üç numaralı kanalları kapatın ve bir numaralı kanalı açın. Görüntüleri yakalamadan önce tarama ayarlarını yeniden düzenleyin, görüntüleri az önce açıklandığı gibi kaydedin ve görüntü işlemeyi, burada gösterildiği gibi Pan ve meslektaşları tarafından tanımlandığı şekilde gerçekleştirin. Bütün boyama Alcian mavisi boyama ile geleneksel kıkırdak görselleştirmesi, gelişmekte olan Meckel kıkırdağının gözlemlenmesinde paha biçilmez olmuştur ve gelişen kondrositleri zaman içinde soy takibi ile daha fazla analiz etmek için nihai hücresel organizasyonu görselleştirmek amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır.

SOX 10 kda transgenik hatları, zebra balığı bow M transgenik hattının canlı görüntülemesi kullanılarak canlı embriyolarda hücre göçü ile konverjans ve ekstansiyonu incelemek için kullanılmıştır. C kraniofasiyal iskelet yapısındaki kondrosit organizasyonunun daha ayrıntılı incelenmesi, Meckel kıkırdağının uzama ve büyümesini sağlayan kondrosit interkalasyonu ve elongasyonu sürecini ortaya koymaktadır. Bu şekil, 3 dpf ile 5 gün post fertilizasyon arasındaki UI zebra balığı bow M Sox 10 ERT iki Cree transgenik embriyolarının alt çenesini göstermektedir.

Alt çene, burada gösterildiği gibi Meckel kıkırdağındaki hücre organizasyonunun net bir şekilde görülmesini sağlamak için en iyi ventral olarak görüntülenir. Stabil bir şekilde korunan ve aktarılan renkler, kolay soy takibi ve kranial nöral krist hücre kader haritalaması yapılmasına olanak tanır. Tek bir mavi hücrenin, komşu hücreleriyle birlikte göç edip araya girdiği, ardından ön-arka aks boyunca uzayarak tekdüze şekilli bir kondral bölge oluşturduğu ve böylece anterior yönde uzarken Meckel kıkırdağının genel şeklini koruduğu görülmektedir.

Bu teknik, kedi gelişimi alanındaki araştırmacıların zebrafish iskelet oluşumundaki kondro yapıları incelemesinin önünü açmaktadır.