Name: Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi İn Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Öğrenin hücre durotaksisini in vitro basitleştirilmiş sistemle değerlendirmeyi. PDMS substratları kullanarak memeli hücrelerinin sert yüzeylere göçünü canlı hücre mikroskobisiyle gözlemleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH R01 GM47607, CA163296 ve CET NSF 1334493 tarafından desteklenmektedir. Biz yazının eleştirel okuma Turner laboratuar üyelerine teşekkür ediyorum. Bu raporda gösterilen tüm veriler Wormer ve ark., 2014 11 izni ile yeniden üretildi.

Durotaxis Chambers hazırlanması 1. <ol><li> Bir 6-yuvalı doku kültürü plakası hazırlanması için, 50 ml konik tüp ile denge dara. 50-ml tüp PDMS baz çözeltisi yaklaşık 10 gr tartılır (çözüm oldukça viskoz). </li><li> 90: 1 substrat (~ 1 kPa Uyum), gerekli çapraz bağlayıcı çözeltisinin doğru miktarını belirlemek için 90 ile tüp içinde PDMS baz çözeltisi ölçülen kilo bölün. Aynı tüp PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisi hesaplanan miktar ekleyin. Örnek: 10 g / 90 = 0.11 g. PDMS baz çözeltisine PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisi 0.11 g ekleyin. NOT: Baz ve çapraz bağlayıcı çözümleri hem PDMS kit sağlanmaktadır. </li><li> Şiddetle küçük bir spatula kullanılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PDMS baz / çapraz bağlayıcı karışımı karıştırın. Bu aşamada kanşım hava kabarcıkları çok sayıda içerir. </li><li> Bub çıkarmak için oda sıcaklığında 50 x g&#39;de 5 dakika boyunca, bir tezgah üstü santrifüj içinde PDMS substratı santrifüjbles. Varsa hala tekrar 5 dakika, santrifüj sonra kabarcıklar. </li><li> 90 pipetle 1 ml: Doku kültürü her oyuğuna 1 PDMS alt-tabaka 6 oyuklu plaka işlemden geçirildi. PDMS mevcut olan herhangi bir geri kalan hava kabarcıkları, bir 21 G iğnesi kullanılarak bunları haşhaş bu aşamada elimine edilebilir. PDMS oyuk 30 dakika boyunca yaymak için izin verir. </li><li> Kaynama 12 mm cam # 5 dakika için damıtılmış su içinde 1 lamelleri. Iki kez tekrarlanır ve damıtılmış su içinde lamelleri saklayın. </li><li> Yavaşça PDMS üzerine lamel damla PDMS çözeltisi içine lamel bir tarafını dokunarak doku kültür plakasının her bir oyuğuna, bir kurutulmuş, lamel yerleştirin. Lamel yerleşir gibi, PDMS lamel kenarları boyunca tecâvüz başlayacak, ama tamamen kapsayacak olmaz. Bu (B Şekil 1A bakınız) sertleştikten sonra PDMS ve cam arasında bir arayüz oluşturur. </li><li> PDMS tedavi (sertleşmesine) 16 saat için bir fırın içinde 70 ° C &#39;de plaka inkübe edin. Plat yerleştirinBir hücre kültürü kaputu ve UV e 10 dakika süreyle sterilize edin. NOT: Bu kullanım bir kaç gün içinde plakaları yapmak en iyisidir. Bununla birlikte, levha Herhangi bir tampon maddesi olmadan Parafilm ile sarılmış ve kalitede herhangi bir fark azalma olmadan, 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 2. Hücre Ekimi NOT: siRNA aracılı demonte etkisini inceleyerek varsa, üreticinin talimatlarına veya seçim hücre tipi için optimize edilmiş protokolü kullanılarak demonte gerçekleştirin. <ol><li> Kaplama, her 37 ° C &#39;de 1 saat süre ile, kalsiyum ve magnezyum olmaksızın / ml fibronektin PBS içinde 10 ug 1 ml bölmeyi durotaxis. Seçenek olarak ise, fibronektin, 4 ° C&#39;de 16 saat boyunca / ml fibronektin PBS içinde 10 ug PDMS inkübe ile analizden önce gün tatbik edilebilir. Tüm yüzey PBS çözüm fibronektin batmış olduğundan emin olun. </li><li> Isı ile denatüre edilmiş,% 1 BSA hazırlayın. 0,5 g BSA tartılır ve 50 ml PBS içinde çözülür.Filtre 12 dakika boyunca 80 ° C &#39;de, 0.22 um&#39;lik bir filtreden ve ısı yoluyla çözüm sterilize edin. Not: Bu çözüme 4 ° C&#39;de kaplama ve mağaza hücre öncesinde güne hazırlayın. </li><li> Fibronektin solüsyonu aspire edildi ve PBS ile 3 kez yıkayın. Her bir oyuğa, PBS içinde ısı ile denatüre BSA 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Durotaxis odaları ısı denatüre BSA ile bloke ederken Trypsinize ve seçim hücreleri saymak. </li><li> Levha seçim, belirli bir hücre tipi için gerekli ortam kullanılarak durotaxis bölmesinin her bir kuyunun içine 2 ml lik bir hacim içinde, 1 x 10 5 hücre. Hücreler uygun ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 4 saat süre ile alt-tabaka üzerinde yayılmasına izin verir. Not: U2OS hücreleri rutin 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat ve 10 lU / ml penisilin, 10 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş,% 10 FBS bulunan DMEM içerisinde muhafaza edilir. NOT: Bu örnekte kullanılan hücre sayısı için optimize edilmiştirU2OS hücreleri. Diğer hücre türleri için optimizasyon gerekebilir. Bu yoğunluk hücreleri, diğer hücrelerle önemli etkileşimler olmadan geçirmek için yeterli oda verir. </li></ol> 3. Canlı hücre Görüntüleme <ol><li> 10X amacı ile faz kontrast kullanarak, ters bir mikroskop canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Mikroskop, uzun vadeli görüntüleme sırasında 37 ° C sıcaklığın kontrol edilmesi ve% 5 CO2 sağlayan kapalı bir çevre, nemli bir bölmede ile donatılmış olmalıdır. </li><li> Hücreler yaklaşık 3.5 saat boyunca yayıldı sonra, mikroskop odasında plaka monte edin. Örnek (ler) 30 dakika boyunca oda içinde dengelenmeye bırakın. </li><li> Varsa mikroskop ziyaret otomatik, çok noktalı ayarlayın. 90 arasındaki arayüze odaklanın: 1 PDMS ve cam lamel ve tüm durotaxis odasına başına 40 sayılık bir ortalama ile arayüzü etrafında görüntü noktaları seçin. Resim hücreleri kadar 16 saat boyunca her 10 dakikada bir. NOT: Yenidenilgi gion lamel kenarı ve PDMS ve kapak arasında fiili bir arayüz karşılık gelen iç hat karşılık gelen dış hat ile, iki çizgi olarak görünür. Şekil 1B bakınız. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Tablo 1 deki gibi bir elektronik tablo oluşturur. </li><li> Üretilen her film cam yüzey ve tersi PDMS gelen geçiş olaylarının sayısını. Excel uygun sütununda geçiş olaylarının numarasını kaydedin. NOT: Bir geçiş olayı her iki yönde PDMS ile cam arasındaki sınır üzerinden geçen hücre çekirdeğinde olarak tanımlanır. </li><li> Birden geçişleri ölçmek için, hücre arayüzü geçti sayısını saymak. Bu sayı, hücre filmin sonunda yer edildiği yüzeye karşılık gelen excel sütunda kayıt altına alınmalıdır. T arayüzü haçlar her hücre için analiz tekrarlayınO film. Görüntüleme sırasında görüş alanının dışına göç hücreleri hariç. NOT: Bu hücrelerin fibronektin kaplı PDMS ve cam lamel yüzeylerine eşit olarak yapışır mümkün olduğunu, denemenin başında sayma hücre tarafından, doğrulamak için de önemlidir. </li><li> Cam yüzey (yani, durotaxis yapıldı) için PDMS göç hücrelerinin yüzdesini hesaplayın. Yumuşak sert ve geçiş olaylarının toplam sayısına göre sert ve bölmek tarihinde sona eren birden geçiş olaylara olayları kapısı sayısını ekleyin. </li><li> Geçitlerin toplam sayısına göre birden geçişleri sayısına bölünmesiyle birden geçişleri yüzdesini hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+cell+migration+by+tugging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li>
<li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).</li>
<li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li>
<li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker’s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+component+of+the+exocyst%2C+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir çelişkisi yoktur.

Bu yazıda hücrelerin taşınmasıyla durotaxis incelemek için basit bir tahlil açıklar. Bu deneyde önemli bir gücü PDMS kullanarak durotaxis odaları hazırlamak kolaylığıdır. Alt-tabakaların sertliği, kolayca deneyinde, çeşitli katılıklarının bir çalışma sağlamak için bir çapraz bağlayıcı PDMS baz çözeltisi oranı değiştirilerek kontrol edilebilir. Ancak, sistemin bir potansiyel sınırlama daha sofistike sistemlerin 4 tarafından sağlanan bir sertlik degrade yaşandığı karşıt olarak hücreler sadece alt tabaka sertlik...

Hücre dışı matris (ECM), kolajen, fibronektin ve laminin gibi yapısal ve çapraz bağlama proteinlerinin karmaşık bir dizi oluşur. De ECM hücre dokular için önemli bir yapısal destek sağlar tespit edilmesine rağmen, hücreler aktif olarak, hücre hayatta kalması, farklılaşma ve hücre göçü de dahil olmak üzere çok çeşitli hücresel işlemleri düzenleyen kendi ECM ortamında fiziksel değişikliklere yanıt olduğunu belirtmek için artan kanıtlar vardır. Sert (~ 25 kPa) yüzeyler osteojenik farklılaşma 1 teşvik Örneğin, ECM sertlik farklılıklar yumuşak yüzeylerde (~ 1 kPa) nörojenik soy teşvik ile, farklı soy karşı mezenkimal kök hücrelerin sürebilirim. Benzer şekilde, stromal matrisi katılıkta bir artış çevre doku 2,3 halinde meme epitelyal hücre tümörogenez ve işgali teşvik ettiği gösterilmiştir. Bu mechanosign için özellikle ilginç bir yönüHücreler daha sert bir alt-tabaka 4,5 doğru tercihli olarak göç ettiği durotaxis olarak bilinen bir işlemde aling etki gösterir. Hücreler sürekli ECM bağlanarak integrin reseptörü yoluyla hücre dışı ortamın fiziksel özelliklerini hissederler. Bu da, fokal yapışmalarda ve fokal temas 6,7 olarak bilinen yapıştırma yapıların oluşumunu sürücü sitoplazmik alanlarında çok sayıda yapısal ve sinyal proteinlerinin birikimi teşvik eder. Integrinlerinin hiçbir doğasında enzimatik aktiviteye sahip olduğundan, sinyaller değişen çevre 8 hücrenin yanıtı koordine etmek, bu aksesuar proteinleri aracılığıyla ECM&#39;den aktarılmaktadır. Buna göre, mechanosignaling ve durotaxis düzenleyen kilit rol oynayan proteinlerin belirlenmesi ve karakterizasyonu araştırılması gereken önemli bir alandır. Çeşitli model sistemler durotaxis in vitro incelemek için geliştirilmiştir, ancak çoğu varkullanılan kollajen kaplı poliakrilamid yüzeyler 4. Bununla birlikte, poliakrilamid substratlar hazırlanması teknik olarak zor olabilir ve bu deneylerde kullanılan kollajen alt-tabaka 9 kimyasal olarak çapraz bağlanmış olması gerekir. Polidimetilsiloksan (PDMS) alt-tabakalar poliakrilamid alt tabakalar 10 için karşılaştırılabilir mekanik özellikler göstermektedir gösterilmiştir. Bununla birlikte, alt-tabakalar, sadece çapraz bağlayıcı madde PDMS bazın bir karıştırma oranı ile hazırlanabilir ve bu alt-tabakalar bu şekilde PDMS hücre davranışı üzerindeki sertlik etkilerini incelemek için daha kolay bir araç yapan kimyasal çapraz bağlama için gerek kalmadan ECM proteinleri ile kaplanabilir. Bu yazıda, yumuşak bir PDMS substrat sert cam lamel ile entegre edildiği bir basit durotaxis odasını nasıl hazırlanacağını açıklar. Deney aşağıda açıklandığı gibi, durotaxis incelemek için hızlı ve basit bir yöntem temin etmektedir. Bu çalışma için siRNA aracılı ile birlikte, insan osteosarkoma hücreleri kullanılır U2OScdGAP demonte durotaxis 11 bu fokal yapışma proteininin rolünü araştırmak için. Önemli olarak, bu protokol, kolaylıkla kişisel gereksinimlere uyarlanabilir. Diğer hücre tipleri U2OS hücreleri için ikame edilebilir ve herhangi bir protein düşürülmüş olup durotaxis sırasında hücre davranışı üzerindeki etkilerini belirlemek için aşırı ifade edilebilir. Ayrıca, bu protokol dinamiklerini ve davranışları kullanılarak sıkı bağlamak ya da yaklaşımlar FRET analizi, floresan etiketli proteinler dahil adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td></tr><tr><td>#1 Kapak camı 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu</td><td>plaka Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Pirüvat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpleri</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

değerlendirilmesi hücre mechanosensing ve durotaxis için basitleştirilmiş sistemi<em&gt; İn vitro</em

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mekanik özellikleri, doku tipleri arasında oldukça değişkendir. Bu bağ dokusu stroma ölçüde çeşitlilik etkileri, hücre davranış hücre çoğalması, farklılaşması, yapışma sinyalizasyon ve yön göç de dahil olmak üzere, normal ve patolojik süreçleri düzenler. Bu bağlamda, bazı hücre tiplerinin doğal yeteneğini durotaxis olarak ifade edilir, bir katı ya da daha az uyumlu bir matriks substrat tabakasına doğru göç. Bu olgu, embriyonik gelişim, yara iyileşmesi ve kanser hücresi yayılımını tamamen sırasında önemli bir rol oynar. Burada, polidimetilsiloksan (PDMS) alt tabakalar kullanarak, in vitro olarak durotaxis çalışma için basit bir deney tarif eder. Odaları durotaxis tarif hazırlanması nispeten yumuşak PDMS jel ve katı bir cam lamel arasında bir sertlik arabirimi oluşturur. Verilen örnekte, cdc42 bir rol göstermek için bu durotaxis odaları kullandık / Rac1 GTPaz aktive protecdGAP bölgesi, mechanosensing ve insan U2OS osteosarkoma hücrelerinde durotaxis düzenlenmesinde. Bu deney, mechanosignaling ve durotaxis bunların rollerini araştırmak için başka hücre tipleri ve / veya önemli diğer proteinlerin demonte kolaylıkla uyarlanabilir.

Durotaxis bölmesinin şematik Şekil 1A &#39;de gösterilmiştir. Yumuşak PDMS alt-tabaka (90: çözüm çapraz bağlayıcı PDMS baz 1 karışımı) 6 iyi bir çanak içinde yayılır ve bir cam lamel böylece bir ara yüzey oluşturarak, daha sonra kısmen lamel üst yüzeyini kaplayan PDMS, üst üste yerleştirilir Farklı uyum iki alt tabaka arasında yer almaktadır. Yumuşak PDMS alt-tabakanın sertliği cam sertliği yaklaşık GPa&#39;dır 01-02 Ocak iken, beyin dokusu tipik bir uyum ile karşılaştırılabilir ~ 1 kPa vardı...

Birçok memeli hücresi, tercihen durotaksis yoluyla daha sert bir matrise veya substrata doğru göç eder. Bu protokolün amacı, cam lameller ile arayüz oluşturarak, tanımlanmış sertliğe sahip polidimetilsiloksan (PDMS) substratlarını birleştirerek hücre durotaxis davranışlarını incelemek ve manipüle etmek için kullanılabilecek basit bir in vitro sistem sağlamaktır.

Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi<em&gt; İn Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Bu prosedürün genel amacı, birçok memeli hücresinin tercihen daha sert bir substrata doğru göç ettiği hücre durotaksisi analizi için basitleştirilmiş bir sistem sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle belirli sertlikte Polimetilsiloksan veya PDMS substratlar hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, hazırlanan PDMS altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna dökülür ve tüm hava kabarcıkları giderilir.Ardından, her kuyuktaki PDMS'in üzerine sterilize edilmiş bir lamel yerleştirilerek bir kapak oluşturulur ve Durotax odaları tamamlanır. Son adım, hücrelerin, diğer hücrelerle önemli etkileşimlere girmeden göç edebilecekleri kadar alan kalacak bir yoğunlukta Durotax odalarına ekilmesidir. Nihayetinde, göç eden hücrelerdeki eksenleri incelemek için canlı hücre mikroskopisi kullanılır.Bu tekniğin poliakrilamid gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, gradyan jel alternatifleri yerine yumuşak PDMS ile sert cam arasında tek bir adımın bulunmasıdır. Ayrıca, PDMS'in fibronektin gibi hücre dışı matriks bileşenleri ile kaplanması, poliakrilamid jeller için gerekli olan kimyasal çapraz bağlama işlemini gerektirmez. Bir adet altı kuyucuklu doku kültürü plağı hazırlamak için, öncelikle denge çözeltisini 50 milliliter'lik konik bir tüp ile hazırlayın.50 mililitrelik tüp içerisine yaklaşık 10 gram poli dimetil siloksan veya PDMS baz çözeltisi tartın. 90'a bir oranındaki bir substrat için, ölçülen PDMS baz çözeltisi ağırlığını 90'a bölün. Gerekli olan doğru çapraz bağlayıcı çözelti miktarını belirlemek için, hesaplanan miktardaki PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisini tüpe ekleyin ve PDMS baz-çapraz bağlayıcı karışımını oda sıcaklığında beş dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.Bu aşamada küçük bir spatula kullanıldığında, karışım az miktarda hava kabarcığı içerecektir. PDMS altlığı, masaüstü bir santrifüjde 50 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Kabarcıklar hâlâ mevcutsa, bunları gidermek için oda sıcaklığında bekletin.Beş dakikalık sürenin ardından tekrar santrifüjleyin ve 90:1 PDMS substratından bir mililitreyi doku kültürü için işlenmiş altı kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa pipetleyin. PDMS içerisinde kalan hava kabarcıkları, bu aşamada 21 gauge iğne ile patlatılarak giderilebilir.PDMS'nin kuyucuk içerisinde 30 dakika boyunca yayılmasına izin verin. Ardından, 12 milimetrelik 1 numaralı cam lamelleri distile suda beşer dakika olmak üzere toplam üç kez kaynatın. Kurulanmış her bir lameli, kapağın bir kenarına nazikçe dokunarak doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna yerleştirin.Lameli PDMS çözeltisine daldırın ve ardından lameli PDMS'in üzerine bırakın. Lamel yerleşirken, PDMS lamelin kenarlarına doğru yayılmaya başlayacak ancak lameli tamamen örtmeyecektir. Bu işlem, kürlenme sonrası PDMS ve cam arasında bir arayüz oluşturacaktır.PDMS'yi kürlemek için plakayı bir fırında 70 °C'de 16 saat inkübe edin. Son olarak, plakayı bir hücre kültürü davlumbazına yerleştirin ve 10 dakika boyunca UV ile sterilize edin. Her bir durox bölmesini, kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin içindeki bir mililitre fibronektin ile 30 °C'de bir saat boyunca kaplayın.Tüm yüzeyin PBS içindeki fibronektin çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun. 0,5 gram BSA tartıp 50 mililitre filtreli PBS içinde çözerek ısı ile denatüre edilmiş %1 sığır serum albümini veya BSA hazırlayın. Çözeltiyi, 80 °C'de 12 dakika boyunca ısıtmadan önce 0,22 mikronluk bir filtreden geçirerek sterilize edin.Ardından, fibronektin solüsyonunu aspire edin ve odacıkları üç kez PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuğa PBS içinde ısı ile denatüre edilmiş 1 mL BSA ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, tripsinize edin ve hücreler seçilirken durex odacıkları ısı ile bloke olsun. Hücre ekimi yapmadan hemen önce odacıklardaki BSA solüsyonunu aspire edin.Doax haznesinin her bir kuyucuğuna, iki mililitrelik hacimde 10.000 hücre ekleyin. Seçilen hücre tipine uygun besiyerini kullanarak hücrelerin substrata tutunması ve yayılması için hücreleri 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde dört saat bekletin; ardından bir ters mikroskopta, 10 x objektif ve faz kontrastı kullanarak canlı hücre görüntülemesi gerçekleştirin. Mikroskop, uzun süreli görüntüleme sırasında sıcaklığın 37 °C'de ve CO2 oranının %5'te kontrol edilmesine olanak tanıyan kapalı bir çevresel nemlendirme haznesi ile donatılmış olmalıdır.Görüntüleme için, hücreler yaklaşık 3,5 saat boyunca yayıldıktan sonra plakayı mikroskop haznesine yerleştirin. Numunelerin hazne içinde 30 dakika boyunca dengelenmesini sağlayın. Varsa, mikroskopta otomatik çok noktalı ziyaret sistemini kurun.PDMS ile cam lamel arasındaki ara yüze odaklanın ve ara yüzün çevresinden görüntüleme yapılacak noktalar seçin. Durex odası görüntüsü başına ortalama 40 nokta ile, hücreleri 16 saate kadar her 10 dakikada bir görüntülediğinizde, ilgi bölgesi iki çizgi şeklinde görünecektir; dış çizgi lamelin kenarına, iç çizgi ise PDMS ile lamel arasındaki gerçek ara yüze karşılık gelir. Verileri analiz etmek için, metin protokolünde gösterilene benzer bir hesap tablosu oluşturun.Oluşturulan her videodaki PDMS'den cam yüzeye ve ters yöndeki geçiş olaylarının sayısını belirleyin. Geçiş olayı, hücre çekirdeğinin PDMS ile cam arasındaki sınırı her iki yönde geçmesi olarak tanımlanır. Birden fazla geçişi nicelleştirmek için geçiş olaylarının sayısını Excel hesap tablosundaki uygun sütuna kaydedin.Hücrenin arayüzü kaç kez geçtiğini sayın. Bu sayı, videonun sonunda hücrenin bulunduğu substrata karşılık gelen Excel sütununa kaydedilmelidir. Analizi, videoda arayüzü geçen her bir hücre için tekrarlayın.Görüntüleme sırasında görüş alanının dışına çıkan hücreleri hariç tutun. PDMS'den cam yüzeye göç eden ve dolayısıyla Durotaksise uğrayan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Bunun için şu adımları izleyin.Yumuşak yüzeyden sert yüzeye geçiş olaylarının sayısını ve sert yüzeyde sonlanan çoklu geçiş olaylarını toplayın ve toplam geçiş olaylarının sayısına bölün. Hücrelerin çevrelerindeki mekanik ipuçlarına nasıl karşılık verdiğinin moleküler mekanizmasını anlamaya başlamak için, toplam çoklu geçiş sayısını toplam geçiş sayısına bölerek çoklu geçişlerin yüzdesini hesaplayın. Belirli proteinler, burada gösterildiği gibi iRNA kullanılarak susturulabilir.Kontrol irna ile işlem görmüş hücrelerin yaklaşık %70'i aksis sergilemiştir. Buna karşılık, RNAi kullanılarak CD gap susturulduğunda, hücrelerin sert veya yumuşak substrata göç etme konusunda herhangi bir tercihi olmamıştır. Ayrıca, CD gap susturulmuş hücreler sınırı birden fazla kez geçmiştir.Kontrol siRNA ile işlem görmüş hücreler genel olarak sınırı yalnızca bir kez geçerken, kontrol siRNA hücrelerinin temsilci izleri, hücrelerin genellikle sınırı bir kez geçtiğini ve CD gap ile karşılaştırıldığında tercihen daha sert yüzeyde kaldığını göstermektedir. Herhangi bir sertlik tercihi göstermeyen siRNA ile işlem görmüş hücreler ise sınırı birden fazla kez geçmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, PDMS altlıkların nasıl hazırlanacağı, duris odacıklarının nasıl kurulacağı ve DUR takslerinin nasıl nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

ECIS / Taksiler sistemi hücresel kemotaksis ölçer otomatik, gerçek zamanlı bir testtir. Bu deneyde, bir hedef hücreler elektrot varmak için agaroz bir katmanı altındaki hareket eder. Hücresel hareketi AC akım 0 direnç başlangıcı ile ölçülür.

ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü

Mekanosasyonu etkileyen yeni mutasyonları tanımlamak için, MARCM yöntemi ile üretilen mutant klonlarda sinek kıllarının dokunsal uyarımına davranışsal tepkiyi ölçen bir test tasarladık. Tekniklerin kombinasyonu, aksi takdirde ölümcül olabilecek mekanosensitif mutasyonların tanımlanmasına izin verir.

Arasında Mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda MARCM tabanlı<em&gt; Drosophila melanogaster</em

mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Mechanobiology araştırma için yeni araçlar nasıl mekanik stres anlamak için gerekli biyokimyasal yollar etkinleştirir ve biyolojik yanıt aydınlığa çıkartıyor. Burada, hücresel tepkilerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan bir mikrosıvısal tuzak ile immobilize hayvanların seçici mekanik uyarılması için yeni bir yöntem vitrin.

Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma

Biz Optik cımbız hafif levha mikroskop ve hücre mekaniği Drosophila embriyo boncuklar olmadan soruşturma için uygulanması için birleştiğinde bir kurulumu mevcut.

Hücre mekanik ile boncuk-Alerjik Optik cımbız Drosophila embriyo sondalama

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti (iTACS) platformu, bağlı hücrelerdeki çok çeşitli kimyasal ve mekanik sinyalleri aynı anda ölçme işlemini otomatikleştirir. iTACS, topluluk odaklı gelişimi kolaylaştırmak ve araştırmacıların eğitim geçmişlerine bakılmaksızın tüm platform özelliklerini kullanmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.

Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti: Kuvvetler, Hareket, Morfoloji ve Floresan

Bu çalışma, floresan olarak etiketlenmiş elastomerik büzülebilir yüzeyler (FLECS) Teknolojisini, floresan protein mikrodesenlerinin görselleştirilmiş yer değiştirmelerine dayanan tek hücreli kontraktil kuvvetlerin basitleştirilmiş, eller kapalı nicelleştirilmesi için mikrowell formatında kullanmak için esnek bir protokol sunmaktadır.

Mikrodesenli Elastomerler Kullanarak Tek Hücreli Kasılmanın Basitleştirilmiş, Yüksek Verimli Analizi

Mevcut protokol, yüzlerce Drosophila melanogaster embriyosunu minimum kullanıcı müdahalesiyle hizalayabilen, hareketsiz hale getirebilen ve hassas bir şekilde sıkıştırabilen mikroakışkan bir sistemin tasarımını, üretimini ve karakterizasyonunu açıklamaktadır. Bu sistem, stimülasyon sonrası analiz için numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini ve geri kazanılmasını sağlar ve diğer çok hücreli biyolojik sistemlere uyum sağlayacak şekilde ölçeklendirilebilir.

Çok Hücreli Organizmaların Yüksek Verimli Bir Mikroakışkan Sıkıştırma Sistemi Aracılığıyla Mekanostimülasyonu

Burada sunulan, mekano-düğüm-gözenek algılama (mekano-NPS) adı verilen elektronik tabanlı bir mikroakışkan platform kullanarak tek hücreleri mekanik olarak fenotiplemek için bir yöntemdir. Bu platform, hücrelerin hem elastik hem de viskoz biyofiziksel özelliklerini ölçerken 1-10 hücre / s'nin ılımlı verimini korur.

Mekano-Düğüm-Gözenek Algılama: Çok Parametreli Tek Hücreli Viskoelastik Ölçümler için Hızlı, Etiketsiz Bir Platform

Öğrenin hücre durotaksisini in vitro basitleştirilmiş sistemle değerlendirmeyi. PDMS substratları kullanarak memeli hücrelerinin sert yüzeylere göçünü canlı hücre mikroskobisiyle gözlemleyin.

Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi

Daha fazla video keşfet