Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi İn Vitro

Bu prosedürün genel amacı, birçok memeli hücresinin tercihen daha sert bir substrata doğru göç ettiği hücre durex'inin analizi için basitleştirilmiş bir sistem sağlamaktır. Bu, önce tanımlanmış sertliğe sahip Polimetil suboksan veya PDMS substratlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, hazırlanan PDMS, altı oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna dökülür ve herhangi bir hava kabarcığı giderilir.

Durex odaları daha sonra bir kaplama oluşturmak için her bir kuyucuktaki PDMS'nin üzerine sterilize edilmiş bir örtü astarının yerleştirilmesiyle tamamlanır. Son adım, hücreleri, diğer hücrelerle önemli etkileşimler olmadan göç etmek için yeterli alan sağlayan bir yoğunlukta Duro vergi odalarına tohumlamaktır. Sonuç olarak, göç eden hücrelerde axxis'i incelemek için canlı hücre mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin poli akrilamid gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yumuşak PDMS ile sert cam arasında gradyan jel alternatifleri yerine tek bir adım olmasıdır. Ayrıca PDMS'nin hücre dışı matris ile kaplanması Fibronektin gibi bileşenler, poli akrilamid jeller için gerekli olan kimyasal çapraz bağlama gerektirmez. Önce altı kuyulu bir doku kültürü plakası hazırlamak için, teraziyi 50 mililitrelik konik bir tüp ile yırtın.

50 mililitrelik tüpte yaklaşık 10 gram poli dimetil suboksan veya PDMS baz çözeltisini tartın. 90'a bir alt tabaka için, PDMS baz çözeltisinin ölçülen ağırlığını 90'a bölün. İhtiyaç duyulan doğru çapraz bağlayıcı çözeltisi miktarını belirlemek için, hesaplanan miktarda PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisini, oda sıcaklığında beş dakika boyunca kuvvetlice karıştırılmış A-P-D-M-S baz çapraz bağlayıcı karışımına ekleyin.

Bu aşamada küçük bir spatula kullanarak, karışım az sayıda hava kabarcığı içerecektir. PDMS substratını bir tezgah üstü santrifüjde 50 kez beş dakika santrifüjleyin. G. Hala kabarcıklar varsa kabarcıkları çıkarmak için oda sıcaklığını ekleyin.

Beş dakikalık santrifüjden sonra, tedavi edilen doku kültürünün her bir oyuğuna 90 ila bir PDMS substratının bir mililitresini tekrar pipetleyin. Altı kuyulu plaka. PDMS'de kalan hava kabarcıkları, bu aşamada 21 gauge iğne ile patlatılarak ortadan kaldırılabilir.

PDMS'nin kuyuda 30 dakika yayılmasına izin verin. Daha sonra 12 milimetre bardağı bir numarada kaynatın, kapak fişlerini damıtılmış suda beş dakika, toplam üç kez kaynatın. Kapağın bir tarafına hafifçe dokunarak doku kültürü plakasının her bir oyuğuna bir kurumuş kapak astarı yerleştirin.

PDMS çözeltisine kaydırın ve ardından kapak fişini PDMS'nin üzerine bırakın. Kapak kayması, yerleştikçe, PDMS kapak kaymasının kenarlarına girmeye başlayacak, ancak onu tamamen örtmeyecektir. Bu, kürlendikten sonra PDMS ile cam arasında bir arayüz oluşturacaktır.

PDMS'yi sertleştirmek için plakayı 70 santigrat derecede bir fırında 16 saat inkübe edin. Son olarak, plakayı bir hücre kültürü başlığına yerleştirin ve 10 dakika boyunca UV ile sterilize edin. Her durox odasını bir mililitre fibronektin ile 30 santigrat derecede bir saat boyunca kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin içinde kaplayın.

Tüm yüzeyin PBS solüsyonundaki fibronektin içine batırıldığından emin olun. 0.5 gram BSA'yı tartarak ve 50 mililitre PBS filtresinde çözerek ısı doğalı% 1 sığır serum albümini veya BSA'yı hazırlayın. Bir çözeltiyi 80 santigrat derecede 12 dakika ısıtmadan önce 22 mikronluk bir filtreden sterilize edin.

Daha sonra, fibronektin çözeltisini aspire edin ve odaları PBS ile üç kez yıkayın. Her bir oyuğa PBS'de bir mililitre ısıyla denatüre BSA ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, tripsin gözleri ve durex odaları ısı ile tıkanırken tercih edilen hücreleri sayın. Denatüre BSA, hücreleri kaplamadan hemen önce odalardan BSA çözeltisini aspire eder.

Doaks odasının her bir oyuğuna iki mililitrelik bir hacimde 10.000 hücre yerleştirin. Tercih edilen belirli hücre tipi için gerekli ortamı kullanarak,% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde hücrelerin dört saat boyunca substrat üzerinde yapışmasına ve yayılmasına izin verin, 10 x objektif ile faz kontrastı kullanarak ters çevrilmiş bir mikroskopta canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Mikroskop, uzun süreli görüntüleme sırasında 37 santigrat derece ve %5 CO2'de sıcaklığın kontrolüne izin veren kapalı bir çevresel nemlendirme odası ile donatılmalıdır.

Görüntüleme, hücreler yaklaşık 3,5 saat yayıldıktan sonra, plakayı mikroskop odasına monte edin. Numunelerin haznede 30 dakika dengelenmesine izin verin. Varsa, mikroskopta otomatik çok noktalı ziyareti ayarlayın.

PDMS ile cam kapak sürgüsü arasındaki arayüze odaklanın ve arayüzün her yerinde görüntülenecek noktaları seçin. Durex hazne görüntüsü başına ortalama 40 nokta ile, hücreler 16 saate kadar her 10 dakikada bir, ilgilenilen bölge, dış çizgi kapak fişinin kenarına karşılık gelen ve iç çizgi PDMS ile kapak fişi arasındaki gerçek arayüze karşılık gelen iç çizgi ile iki çizgi olarak görünecektir. Verileri analiz etmek için, metin protokolünde gösterilene benzer bir elektronik tablo oluşturun.

Oluşturulan her filmden PDMS'den cam yüzeye ve tam tersi geçiş olaylarının sayısını sayın. Bir geçiş olayı, PDMS ile cam arasındaki sınırı her iki yönde de geçen hücre çekirdeği olarak tanımlanır. Birden çok geçişi ölçmek için geçiş olaylarının sayısını Excel elektronik tablosundaki uygun sütuna kaydedin.

Hücrenin arayüzü kaç kez geçtiğini sayın. Bu sayı, filmin sonunda hücrenin bulunduğu alt tabakaya karşılık gelen Excel sütununa kaydedilmelidir. Filmdeki arabirimden geçen her hücre için analizi yineleyin.

Görüntüleme sırasında görüş alanının dışına taşınan hücreleri dışarıda bırakın. PDMS'den cam yüzeye göç eden ve bu nedenle Duro Texas'a maruz kalan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Bunu yapmak için.

Yumuşaktan serte geçiş olaylarının sayısını ve sertte biten çoklu geçiş olaylarını toplayın ve toplam geçiş olaylarının sayısına bölün. Hücrelerin çevrelerindeki mekanik ipuçlarına karşılık geldiği moleküler mekanizmayı anlamaya başlamak için çoklu geçişlerin toplamını toplam geçiş sayısına bölerek çoklu geçişlerin yüzdesini hesaplayın. Spesifik proteinler, burada gösterildiği gibi IRNA kullanılarak parçalanabilir.

Kontrollerin yaklaşık% 70'i irna ile tedavi edilen hücreler axxis sergiledi. Çarpıcı bir tezat olarak, CD boşluğu RNAi kullanılarak yıkıldığında, hücrelerin sert veya yumuşak substrata göç edip etmedikleri konusunda hiçbir tercihi yoktu. Ayrıca, CD boşluğu yıkım hücreleri sınır katını aştı.

Oysa kontrol irna ile muamele edilen hücreler genellikle sınırı yalnızca bir kez temsili kontrol izlerini geçer. Irna hücreleri, hücrelerin genellikle sınır boyunca bir kez göç ettiğini ve tercihen CD boşluğuna kıyasla daha sert yüzeyde kaldığını göstermektedir. Irna, her iki sertlik için de bir tercih göstermeyen ve sınırı birden çok kez geçen hücreleri tedavi etti.

Bu videoyu izledikten sonra, PDMS alt tabakalarının nasıl hazırlanacağını, duris odalarının nasıl monte edileceğini ve DUR vergilerinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.