Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi

Bu prosedürün genel amacı, birçok memeli hücresinin tercihen daha sert bir substrata doğru göç ettiği hücre durotaksisi analizi için basitleştirilmiş bir sistem sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle belirli sertlikte Polimetilsiloksan veya PDMS substratlar hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, hazırlanan PDMS altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna dökülür ve tüm hava kabarcıkları giderilir.

Ardından, her kuyuktaki PDMS'in üzerine sterilize edilmiş bir lamel yerleştirilerek bir kapak oluşturulur ve Durotax odaları tamamlanır. Son adım, hücrelerin, diğer hücrelerle önemli etkileşimlere girmeden göç edebilecekleri kadar alan kalacak bir yoğunlukta Durotax odalarına ekilmesidir. Nihayetinde, göç eden hücrelerdeki eksenleri incelemek için canlı hücre mikroskopisi kullanılır.

Bu tekniğin poliakrilamid gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, gradyan jel alternatifleri yerine yumuşak PDMS ile sert cam arasında tek bir adımın bulunmasıdır. Ayrıca, PDMS'in fibronektin gibi hücre dışı matriks bileşenleri ile kaplanması, poliakrilamid jeller için gerekli olan kimyasal çapraz bağlama işlemini gerektirmez. Bir adet altı kuyucuklu doku kültürü plağı hazırlamak için, öncelikle denge çözeltisini 50 milliliter'lik konik bir tüp ile hazırlayın.

50 mililitrelik tüp içerisine yaklaşık 10 gram poli dimetil siloksan veya PDMS baz çözeltisi tartın. 90'a bir oranındaki bir substrat için, ölçülen PDMS baz çözeltisi ağırlığını 90'a bölün. Gerekli olan doğru çapraz bağlayıcı çözelti miktarını belirlemek için, hesaplanan miktardaki PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisini tüpe ekleyin ve PDMS baz-çapraz bağlayıcı karışımını oda sıcaklığında beş dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.

Bu aşamada küçük bir spatula kullanıldığında, karışım az miktarda hava kabarcığı içerecektir. PDMS altlığı, masaüstü bir santrifüjde 50 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Kabarcıklar hâlâ mevcutsa, bunları gidermek için oda sıcaklığında bekletin.

Beş dakikalık sürenin ardından tekrar santrifüjleyin ve 90:1 PDMS substratından bir mililitreyi doku kültürü için işlenmiş altı kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa pipetleyin. PDMS içerisinde kalan hava kabarcıkları, bu aşamada 21 gauge iğne ile patlatılarak giderilebilir.

PDMS'nin kuyucuk içerisinde 30 dakika boyunca yayılmasına izin verin. Ardından, 12 milimetrelik 1 numaralı cam lamelleri distile suda beşer dakika olmak üzere toplam üç kez kaynatın. Kurulanmış her bir lameli, kapağın bir kenarına nazikçe dokunarak doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna yerleştirin.

Lameli PDMS çözeltisine daldırın ve ardından lameli PDMS'in üzerine bırakın. Lamel yerleşirken, PDMS lamelin kenarlarına doğru yayılmaya başlayacak ancak lameli tamamen örtmeyecektir. Bu işlem, kürlenme sonrası PDMS ve cam arasında bir arayüz oluşturacaktır.

PDMS'yi kürlemek için plakayı bir fırında 70 °C'de 16 saat inkübe edin. Son olarak, plakayı bir hücre kültürü davlumbazına yerleştirin ve 10 dakika boyunca UV ile sterilize edin. Her bir durox bölmesini, kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin içindeki bir mililitre fibronektin ile 30 °C'de bir saat boyunca kaplayın.

Tüm yüzeyin PBS içindeki fibronektin çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun. 0,5 gram BSA tartıp 50 mililitre filtreli PBS içinde çözerek ısı ile denatüre edilmiş %1 sığır serum albümini veya BSA hazırlayın. Çözeltiyi, 80 °C'de 12 dakika boyunca ısıtmadan önce 0,22 mikronluk bir filtreden geçirerek sterilize edin.

Ardından, fibronektin solüsyonunu aspire edin ve odacıkları üç kez PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuğa PBS içinde ısı ile denatüre edilmiş 1 mL BSA ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, tripsinize edin ve hücreler seçilirken durex odacıkları ısı ile bloke olsun. Hücre ekimi yapmadan hemen önce odacıklardaki BSA solüsyonunu aspire edin.

Doax haznesinin her bir kuyucuğuna, iki mililitrelik hacimde 10.000 hücre ekleyin. Seçilen hücre tipine uygun besiyerini kullanarak hücrelerin substrata tutunması ve yayılması için hücreleri 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde dört saat bekletin; ardından bir ters mikroskopta, 10 x objektif ve faz kontrastı kullanarak canlı hücre görüntülemesi gerçekleştirin. Mikroskop, uzun süreli görüntüleme sırasında sıcaklığın 37 °C'de ve CO2 oranının %5'te kontrol edilmesine olanak tanıyan kapalı bir çevresel nemlendirme haznesi ile donatılmış olmalıdır.

Görüntüleme için, hücreler yaklaşık 3,5 saat boyunca yayıldıktan sonra plakayı mikroskop haznesine yerleştirin. Numunelerin hazne içinde 30 dakika boyunca dengelenmesini sağlayın. Varsa, mikroskopta otomatik çok noktalı ziyaret sistemini kurun.

PDMS ile cam lamel arasındaki ara yüze odaklanın ve ara yüzün çevresinden görüntüleme yapılacak noktalar seçin. Durex odası görüntüsü başına ortalama 40 nokta ile, hücreleri 16 saate kadar her 10 dakikada bir görüntülediğinizde, ilgi bölgesi iki çizgi şeklinde görünecektir; dış çizgi lamelin kenarına, iç çizgi ise PDMS ile lamel arasındaki gerçek ara yüze karşılık gelir. Verileri analiz etmek için, metin protokolünde gösterilene benzer bir hesap tablosu oluşturun.

Oluşturulan her videodaki PDMS'den cam yüzeye ve ters yöndeki geçiş olaylarının sayısını belirleyin. Geçiş olayı, hücre çekirdeğinin PDMS ile cam arasındaki sınırı her iki yönde geçmesi olarak tanımlanır. Birden fazla geçişi nicelleştirmek için geçiş olaylarının sayısını Excel hesap tablosundaki uygun sütuna kaydedin.

Hücrenin arayüzü kaç kez geçtiğini sayın. Bu sayı, videonun sonunda hücrenin bulunduğu substrata karşılık gelen Excel sütununa kaydedilmelidir. Analizi, videoda arayüzü geçen her bir hücre için tekrarlayın.

Görüntüleme sırasında görüş alanının dışına çıkan hücreleri hariç tutun. PDMS'den cam yüzeye göç eden ve dolayısıyla Durotaksise uğrayan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Bunun için şu adımları izleyin.

Yumuşak yüzeyden sert yüzeye geçiş olaylarının sayısını ve sert yüzeyde sonlanan çoklu geçiş olaylarını toplayın ve toplam geçiş olaylarının sayısına bölün. Hücrelerin çevrelerindeki mekanik ipuçlarına nasıl karşılık verdiğinin moleküler mekanizmasını anlamaya başlamak için, toplam çoklu geçiş sayısını toplam geçiş sayısına bölerek çoklu geçişlerin yüzdesini hesaplayın. Belirli proteinler, burada gösterildiği gibi iRNA kullanılarak susturulabilir.

Kontrol irna ile işlem görmüş hücrelerin yaklaşık %70'i aksis sergilemiştir. Buna karşılık, RNAi kullanılarak CD gap susturulduğunda, hücrelerin sert veya yumuşak substrata göç etme konusunda herhangi bir tercihi olmamıştır. Ayrıca, CD gap susturulmuş hücreler sınırı birden fazla kez geçmiştir.

Kontrol siRNA ile işlem görmüş hücreler genel olarak sınırı yalnızca bir kez geçerken, kontrol siRNA hücrelerinin temsilci izleri, hücrelerin genellikle sınırı bir kez geçtiğini ve CD gap ile karşılaştırıldığında tercihen daha sert yüzeyde kaldığını göstermektedir. Herhangi bir sertlik tercihi göstermeyen siRNA ile işlem görmüş hücreler ise sınırı birden fazla kez geçmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, PDMS altlıkların nasıl hazırlanacağı, duris odacıklarının nasıl kurulacağı ve DUR takslerinin nasıl nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.