Name: Bu yakın homologları, Nor1 ve Nur77 karşı çapraz-reaktivite Nurr-1 spesifik olan poliklonal antikorlar Free üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Keşfedin, homolog proteinlere karşı antikor spesifitesini artırmak için çapraz-reaktif antikorları kaldırma yöntemini. Bu teknik, Nurr-1 spesifik poliklonal antikor üretimi için immünoloji ve protein kimyasında uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibeleri (NS070577 ve NS084869) tarafından desteklenmiştir.

Not: Aşağıda belirtilen tüm çözümlerin kompozisyon Malzemeleri / Ekipman Tablo bulunabilir. 1. Protein A Sütun Antikor Arıtma <ol><li> Bir protein A spin kolon ve önceki işleme başlamadan 15 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar gerekli tüm tamponları dengelenmesi. </li><li> Bağışıklık serumu 1 seyreltin: 1 Protein A IgG Bağlama Tamponu ile. (Serum 5 mi tavsiye edilir). </li><li> Yavaşça kapağı açılmış olabilecek reçineyi çıkarmak için bir proteine ​​tezgah üstünde bir spin kolon dokunun. Üst kapağı çıkarın ve yavaşça alt kapatma koparmak. 15 ml toplama tüpüne sütun yerleştirin ve depolama çözümü süzülmesini bekleyin. </li><li> Bağlama Tamponu Protein A IgG 5 ml ilave edilir ve çözelti, kurumasına izin verin. </li><li> Sütuna seyreltilmiş bağışıklık serumu uygulayın ve flow-through toplamak. En iyi sonuçlar için, sütunun antikor-bağlanma capacit% 80 daha az bir antikor konsantrasyonunu içeren bir örnek hacim eklemeky. </li><li> Bağlama Tamponu Protein A IgG, 15 ml ya da 280 nm&#39;de absorbans aşağıdaki 0.1 kadar sütun yıkayın. </li><li> Beş etiketli toplama tüplerine Nötralizasyon Tamponu 100 ul ekleyin. </li><li> Protein A sütun IgG Elüsyon Tamponu 5 ml ilave edilir ve Nötralizasyon tampon 100 ul ihtiva eden tüplerin her biri, 1 ml&#39;lik fraksiyonların toplanması. </li><li> 0.5&#39;den daha büyük olan bir absorbans 280 nm ve havuz fraksiyonlar her fraksiyondan absorbansı ölçülür. Diyaliz için hazır olana kadar buz üzerinde Bir araya toplanan fraksiyonlar tutun. </li><li> IgG Elüsyon Tamponu 8 ml ekleyerek sütun yeniden oluşturun ve çözelti sütun üzerinden akmasına izin verir. </li><li> 7.4&#39;e yıkama sıvısı, pH dönene kadar Protein A IgG bağlanma solüsyonu ile sütun durulayın. </li><li> Depolama çözeltisi 5 ml (PBS içinde% 0.02 sodyum azid) eklenerek sütun saklayın. Yaklaşık 3 ml sütun, kapak altındaki kalır ve üst kapağı emniyete zaman. 4 ° C &#39;de sütun saklayın. </li><li> Uzunluk o belirleyinf Diyaliz tübü, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerekli. 16 mm, düz çaplı boru çözeltinin ml&#39;si başına boru uzunluğunun 5.47 cm kullanımı kullanılarak diyaliz edilmesi. Boru kesme ve 15-30 dakika boyunca PBS pH 7.4 ile yıkayın. </li><li> Katlama ve diyaliz hortumun bir ucunu klip, PBS pH 7.4 içinde dengelenmiş diyaliz tüp içeren fraksiyonlar bir araya toplanmış IgG aktarmak ve diğer ucu kapatın. </li><li> 2 saat süre ile, PBS, pH 7.4, 200 hacmine karşı oda sıcaklığında Dialyze. </li><li> Diyaliz tamponu (taze PBS pH 7.4) değiştirin ve oda sıcaklığında başka bir 2 saat boyunca diyaliz. </li><li> Diyaliz tamponu (taze PBS pH 7.4) değiştirin ve 4 ° C&#39;de gece boyunca diyaliz. </li><li> Daha fazla saflaştırma adımları ile devam etmek için hazır olana kadar 4 ° C&#39;de diyaliz edilir antikor çözüm tutun. </li><li> 280 nm&#39;de absorbans kullanılarak antikor konsantrasyonuna ve 210,000 M-1 cm-1 12 ve 280 nm &#39;de antikor Molar soğurma katsayısı değerlendirin. </li></ol> LBD Proteinlerin 2. Bağlantı Bağlantı Reçine AminoLink için <ol><li> Iki sütun, Nor1 diğeri Nur77 diğer hazırlayın. Her iki protein için de aynı protokol takip edin. </li><li> Protein çözülme buz üzerinde reçineye bağlanmak üzere. Onun moler sönüm katsayısı ve 280 mil 12, emiciliğinin kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. <ol><li> Alternatif olarak, bu bisinkoninik asit yöntemi 13 gibi bir protein tayini testi kullanılır. Protein bağlama tamponuna karşı bir amin-içeren tampon diyaliz ya da tampon alışverişi içinde eritildi edin. Protein, Uygun bir tampon maddesi içinde (serbest aminler) ise bu, bağlayıcı tampon içinde 4 kat seyreltilir. </li></ol></li><li> Protein 2 mg reçine 2 ml kullanın. Izleyen tüm adımlar 10 mi sütununda 2 mi reçine içindir. Protein 10 mg kadar reçine, 1 ml (1: bulamacın 1 2 ml) başına bağlanabilir. </li><li> Altına bir cam hamuru bastırıyor ve içinden PBS pH 7.4 çalıştırarak bir 10 ml sütun hazırlayın. Cap tO kolonun alt ve Kaplin Tampon 2 ml ekleyin. </li><li> , Kolona (reçine 2 ml elde etmek için 4 ml) çamurun istenen hacim ekleme alt kapağı çıkarın ve sütun drenaj sağlar. Bağlayıcı tampon içinde 6 ml (3 reçine yatak hacmi) &#39;in bir toplam sütun durulayın ve sütun boşalmasını sağlar. Kavrama tampon süzüldükten sonra, alt kapağı değiştirin. </li><li> (280 nm&#39;de emicilik ya bisinkoninik deneyi kullanarak adım 2.11 elüatın protein konsantrasyonu karşılaştırarak bağlanma verimliliğini değerlendirmek için protein çözeltisi bir kısım devam) kolonuna bağlayıcı tampon içinde süspansiyon haline getirilmiş protein, 2-4 ml ekleyin . Cap ve homojen bir çözüm var uca üzerine sonunu karıştırın. </li><li> Boş 1.8 ml&#39;lik ependorf tüp tartılır ve davlumbaz taşımak. Dikkatli bir şekilde önceden tartılmış bir tüp içinde NaCNBH3 (yaklaşık 0.05 g) aktarın. Tüp kapatılır ve NaCNBH3 içeren tüp tartın. Kaput dışında tüp açmayın. </li><li> Ağırlığına göreNaCNBH3, tüpüne aktarıldı, 1 M NaOH ilave edilerek 5 M bir solüsyon yapmak. NaCNBH3 moleküler ağırlığı 62.84 gr, bu nedenle 0.05 g (0.05 / 62.84 = 7.96 x 10 -4 mol) 7.96 x 10 -4 mol eşit olmasıdır. 5 M solüsyonu (7.96 x 10 -4/5), 1 M NaOH ile 159 ul yapmak için. </li><li> Reaksiyonun toplam hacmi dikkate reçine hacmi alarak ölçün. Reaksiyonun, ml başına 5 M NaCNBH3 10 ul ekle. <ol><li> Örnek: Bir 4 ml reaksiyon hacmi için 5 M NaCNBH3 40 ul ekle. Reçine 1 ml ilave protein, 3 ml için, toplam hacim 4 ml&#39;dir. </li></ol></li><li> Sütun Cap ve sonunda üzerinde sonunu karıştırın. Bir tüp döndürücü sütun Güvenli ve reaksiyon 4 ° C&#39;de gece boyunca devam edelim. </li><li> Sabah, kimyasal kaput sütun getirmek ve dikkatli bir gaz oluşmuş olabilir gibi kapağı çıkarın. Temiz bir tüp içine sütun boşaltın ve protein con ölçmek için eluatı kaydetmek280 nm yöntemiyle 12 absorbans veya bisinkoninik asit deneyi ve adım 2.6 başlayarak protein konsantrasyonu ile karşılaştırmak kullanarak santrasyonu. </li><li> Kavrama 4 ml tampon ile reçinenin yıkanır ve sütun süzdürülür. </li></ol> 3. Engelleme Kalan Siteler <ol><li> Tampon söndürülmesi 4 ml reçine yıkanır. Drenaj ve alt kapağını kapatın. Tampon söndürülmesi 2 ml ekleyin ve reçine askıya. </li><li> Reçine hacmi ve söndürme tampon hacmi daha sonra reaksiyon hacmi ml başına 5 M NaCNBH3 10 ul ekleyin ölçerek toplam reaksiyon hacmi değerlendirin. </li><li> 30 dakika ucu-üzerinde-sonu boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın. 30 dakika sonra, davlumbaz sütun getir. Dikkatle üst kaldırmak ve daha sonra alt kapağı çıkarın ve bir atık tüp içine sütun tahliye edelim. </li><li> Yıkama çözeltisi 5 reçine hacimleri ile sütun yıkayın. Taşıma ürününden en abso ölçülmesiyle bakiye proteinlerinin varlığı için yıkama Monitör280 nm&#39;de rbance. Kuplajsız proteinler yüksek tuz konsantrasyonu ile yıkanır. </li><li> Gazı alınmış, PBS, pH 7.4,% 0.02 sodyum azid, 6 ml reçine yıkanır. Gerekli olana kadar, 4 ° C &#39;de sütun tutun. </li></ol> Nurr1 Özgü Antikorlar 4. saflaştırılması <ol><li> PBS pH 7.4 10 ml Nur77 LBD bağlanmış sütun durulayın ve sütun süzdürülür. Sütunun alt Cap ve yeni bir 15 ml toplama tüpü drene Nur77 LBD birleştiğinde sütun yerleştirin. </li><li> Protein 5 ml saflaştırılmış bir anti-Nurr1 antikor ekleyin 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de, bir döndürücü üzerinde sütun ve yer kap. Üst ve alt kapaklarını çıkarın ve akışı toplamak. Nor1 LBD birleştiğinde sütuna eklemek için hazır olana kadar buz üzerinde bir kenara koyun. </li><li> PBS pH 7.4 10 ml Nor1 LBD bağlanmış sütun durulayın ve sütun süzdürülür. Sütunun alt kapağı ve bir 15 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde Nor1 LBD bağlanmış sütun yerleştirin. </li><li> Nur77 LBD darbeden akışını yoluyla Ekleyol kolon, 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de, bir döndürücü üzerinde sütun ve yer kap. Üst ve alt kapaklarını çıkarın ve akışı toplamak. </li><li> 280 nm&#39;de absorbans ölçümü ile antikor konsantrasyonu ölçümü. </li></ol> Saf Anti-Nurr1 Antikor 5. ELISA-tabanlı Analiz <ol><li> 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına protein, 100 ul (2.5 ug / ml) ilave et. 3 farklı protein test için, H4 Wells A1, H8 Wells A5 proteinin 2, 100 ul, ve H12 kuyu A9 proteinin 3 100 ul proteinin 1. 100 ul ilave edin. Plaka Kapak ve 4 ° C&#39;de bir gece inkübe edin. </li><li> PBS pH 7.4, oyuk başına 300 ul iki kez kaplanmış oyuklarına yıkayın ve tüm antijen kaplı oyuklara ELISA Bloke edici tamponun 300 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe et. </li><li> Plakası saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorun arzu edilen çıkış seyreltme hazırlanması bloke edilirken ELISA bloke tamponu içinde (10 ile 100 ug / ml arasında değişen). </li><li> Engelleme 2 saat sonra, tüm oyuklara taze ELISA blok tamponunda 100 ul ELISA blok tamponu değiştirin. </li><li> Seri olarak C satır satır B çözeltisinin 100 ul aktarma ardından satır B çukurlara satır A çözeltisi 100 ul aktarma ile antikorları seyreltik satır A&#39;da tüm oyuklara seyreltildi saflaştırılmış anti-Nurr1 antikoru 100 ul ekle aşağı doğru devam G ekstra 100 ul atmak aralıksız kuyularda çözüm karıştırıldıktan sonra G. satır. Satır H Wells, sadece tampon engelleme ilk 100 ul alırsınız. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> PBS pH 7.4 plaka,% 0,05 Tween 20, oyuk başına 300 ul olan üç (3) defa yıkayın ve fazla yıkama tamponu çıkması için plakayı blot. </li><li> Yaban turpu peroksidazı (HRP), ELISA Blok tamponu içinde seyreltilmiş biyotinle konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG, 100 ul ekle (1: 8000 seyreltme, tipik bir aralığı, 1: 25,000: 5,000 ile 1 arası). 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Plaka th yıkayınREE (3) defa 5.6 de tarif edildiği gibi. Iyonu giderilmiş su, 300 ul ile doldurarak her kuyu durulayın. Emici kağıt üzerine plakayı baş aşağı çevirerek fazla suyu kurulayın. </li><li> Tüm oyuklara tetrametilbenzidin (oda sıcaklığına kadar ılıtıldı) 3 100 ul, 3 &#39;5, 5&#39;, ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 karanlıkta 30 dakika için inkübe edilir. </li><li> SO 4 NH2 2 50 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> 650 nm &#39;de bir arka plan çıkarılması 450 nm&#39;de absorbansı okumak. </li></ol>

<ol><li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li>
<li>Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+brain-specific+transcription+factor%2C+NURR1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1.</a> Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).</li>
<li>Zetterström, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+agenesis+in+Nurr1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice.</a> Science. 276 (5310), 248-250 (1997).</li>
<li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nurr1+is+required+for+maintenance+of+maturing+and+adult+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons.</a> J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).</li>
<li>Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NURR1+in+Parkinson+disease--from+pathogenesis+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).</li>
<li>Peña de Ortiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Expression+of+the+Orphan+Nuclear+Receptor+Gene+hzf-3%2Fnurr1+during+Spatial+Discrimination+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning.</a> Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).</li>
<li>Vecsey, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+enhance+memory+and+synaptic+plasticity+via+CREB%3ACBP-dependent+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation.</a> J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).</li>
<li>Colón-Cesario, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Nurr1+in+the+rat+hippocampus%3A+implications+to+spatial+discrimination+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory.</a> Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li>
<li>Bridi, M. S., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NR4A+orphan+nuclear+receptors+mediate+transcription-dependent+hippocampal+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity.</a> Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).</li>
<li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li>
<li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+%28NGFI-B%29+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokolün bir başarı ilgili protein ailesinin belirli bir üye karşı üretilen antikorların karakterizasyonu için, saf proteinler mevcudiyetine dayanır. Bu açık bir şekilde ELISA ve Western blot analizi ile önemli çapraz reaktivite olduğu kurulana kadar protein A / G kullanılarak antikorları saflaştırmak için bir ihtiyaç vardır. Metinde belirtildiği gibi, bu tür Tris ya da glisin gibi bir amin-ihtiva eden tampon maddesi içinde sütuna çapraz bağlanmış olduğu protein (ler) süspansiyona önlem...

Transkripsiyon faktörü Nurr1 ve homologları (Nur77 ve Nor1), nükleer reseptör alt ailesi 4A (NR4A) 1 aittir. Onların endojen ligandlar henüz tespit edilmemiş çünkü onlar da yetim reseptörler vardır. Nurr1 ilk olarak 1992 klonlandı ve bilinen, ancak beyin 2&#39;de belirtildiği üzere, geliştirme ve orta beyin dopamin nöronlarının bakımı için de önemli bir rolü nakavt fare çalışmaları 3 konuldu. Buna ek olarak, orta beyin dopamin nöronlarının bakım için çok önemli bir rol son şartlı bir nakavt çalışma 4 ile gösterilmiştir. Nedeniyle orta beyin dopamin nöronları için Nurr1 en kritik roller gösteren bu zarif çalışmalara, birçok sonraki çalışmalarda büyük ölçüde dopamin nöronları ve dopamin ile ilişkili nörodejeneratif bozukluk orta beyin odaklanmıştır, Parkinson hastalığı (PH) 5. Özellikle, Nurr1 orta beyin dopamin (MDA) nöronlarda, aynı zamanda di sadece ifade edilirşiddetle Nurr1 çeşitli beyin fonksiyonlarında önemli rol oynadığını gösteren daha yeni çalışmalar tarafından desteklenmektedir olmayan birçok DA alanlarda işlevsel rollere sahip olabileceğini düşündüren ayet beyin bölgelerinin 2. Örnekler için, bu gibi öğrenme gibi bellek indükleyici aktiviteleri gösterilir, ya da diğer hipokampus bağımlı görevler yukarı regülasyonu hipokampus 6,7 Nurr1 ifade ile sonuçlanır. Buna ek olarak, aşağı hipokampus Nurr1 ifade vurmak şiddetle Nurr1 birçok beyin bölgelerindeki çeşitli roller oynadığını düşündüren, uzun süreli hafızayı ve / veya sinaptik plastisite 8-11 zarar için yeterli oldu. Bu nedenle, daha Nurr1 hücre-tipi-spesifik ve hücre içi ifade anlamak için, onun homologları ya da Nur77 Nor1 herhangi bir çapraz reaktivite sergilemez Nurr1 özgü antikorları kullanmak için tercih edilir. Bu kağıt özgüllüğü gösteren Nurr1 özgü antikorlar ve bu ek verileri oluşturmak için bir ön-adsorpsiyonu protokolü tarif eder.

<table><tbody><tr><td>Nurr1, Nor 1 ve Nur77</td><td></td><td></td><td>Kolonu Depolama solüsyonundan</td>Saflaştırılmış Ligand Bağlama</tr> Alanı <tr><td>AminoLink Kaplin Reçinesi ve Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Protein A spin sütunu</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Düz tabanlı plakalar, Yüksek Flanş, 330 &mu; l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>%10 Normal Keçi Serumu</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>Süt Seyreltici / Bloke Edici Konsantre&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elüsyon Tamponu</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Mikro BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>At Turpu Peroksidaz konjuge Keçi anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Reçine</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3 ', 5, 5' Tetrametilbenzidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H2SO4</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Protein A IgG Bağlayıcı Tampon</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elüsyon Tamponu</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Sütun Depolama çözeltisi</td><td></td><td></td><td>Fosfat Tamponlu % 0.02 sodyum azid içeren salin</td></tr><tr><td>Spectra / Por 7 ön işlem görmüş diyaliz tüpü</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Tek kullanımlık sütunlar</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>AminoLink Birleştirme Tamponu</td><td></td><td></td><td>0.1M sodyum fosfat, %0.05 NaN3, pH 7.0</td></tr><tr><td>Söndürme tamponu</td><td></td><td></td><td>1M Tris. HCI, %0,05 NaN3, pH 7.4</td></tr><tr><td>Yıkama Çözeltisi</td><td></td><td></td><td>1M NaCl, %0.05 NaN3</td></tr><tr><td>ELISA Bloke edici tampon</td><td></td><td></td><td>%1 Normal At serumu (NHS), %1 Normal Keçi Serumu (NGS) 1X KPL süt seyreltici</td></tr><tr><td>Depolama Çözeltisinde</td><td></td><td></td><td>PBS pH 7.4 %0.02 sodyum azid içeren</td></tr><tr><td>Mikropipetler: 10 &mu; l; 20 &mu; l; 200 &mu; l; 1000 &mu; l</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bu yakın homologları, nor1 ve nur77 karşı çapraz-reaktivite nurr-1 spesifik olan poliklonal antikorlar free üretimi

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

Nükleer reseptör alt ailesi 4 (NR4A), bir DNA bağlanma alanını (DBD) ve bir ligand bağlama alanını (LBD) paylaşan 3 ilişkili proteinden oluşur. Nükleer reseptörle ilgili 1 proteini (Nurr1 veya NR4A2), dopaminerjik sistemin korunmasında anahtar rol oynar. Nurr1 geni ile ilişkili dopamin fonksiyon bozuklukları arasında Parkinson hastalığı, şizofreni ve manik depresyon bulunur. Ayrıca, son kanıtlar Nurr1'in hipokampus gibi diğer beyin bölgelerinde de ifade edildiğini ve öğrenme ve hafıza için kritik roller oynadığını göstermektedir. Ailenin diğer üyeleri sinir büyüme faktörü IB (Nur77 veya NR4A1) ve nöron kaynaklı yetim reseptör 1'dir (NOR1 veya NR4A3). Nurr1'in dopaminerjik ve diğer beyin bölgesi ile ilgili nöronal disfonksiyonlardaki kesin fonksiyonel rollerinin araştırılmasına yardımcı olmak için, Nur77 ve NOR1'e karşı çapraz reaktivitelerden yoksun antikorlara ihtiyaç vardı. Proteinler LBD'lerinde DNA bağlanma alanlarından daha farklı olduğundan, saflaştırılmış LBD'lerle bağışıklama, Nur77 ve / veya NOR1'e karşı minimum reaktivite ile Nurr1'e özgü antikorlar vermelidir. Anti-Nurr1 antikorları başarılı bir şekilde üretilmesine rağmen, bunlar ailenin diğer üyelerine karşı önemli immünoreaktivite gösterdi. İmmobilize Protein A üzerinde afinite kromatografisi ve ardından immobilize Nur77 ve NOR1 LBD'lere karşı ön adsorpsiyon, çapraz reaktivite içermeyen Nurr1 spesifik antikorları verdi. Burada, hayvanları en farklı bölgeleriyle bağışıklayarak ve ardından ön adsorpsiyon ile çapraz reaktif antikorları uzaklaştırarak, yüksek oranda korunmuş bir protein ailesinin belirli bir üyesine karşı antikorları seçici olarak hedefliyoruz. Protokolün amacı, çapraz reaktif antijenlere karşı ön adsorpsiyon yoluyla poliklonal antikor özgüllüğünü arttırmaktır.

Protein bir karşılaştırması Nur77 LBD ve Nor1 LBD sütunları boyunca geçirilerek ve ardından bir saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorları görülebilir Şekil 1. As gösterilmiştir, Protein A sütun saf hale Nurr1-spesifik antikorlar, protein-A saf hale Nurr1 antikor güçlü bir bağlanma sergilemiştir Nurr1 LBD&#39;sine. Bununla birlikte, aynı zamanda Nur77 LBD ve Nor1 LBD bağlanmasını belirgin göstermiştir. Protein A saflaştırılmış Nurr1 antikorlar ayrıca Nur77 LBD ve Nor1 LBD, Nurr1 antikorları Nur77 ve Nor1 ola...

Burada, hayvanları en farklı bölgeleriyle bağışıklayarak ve ardından ön adsorpsiyonla çapraz reaktif antikorları çıkararak, yüksek oranda korunmuş bir protein ailesinin belirli bir üyesine karşı antikorları seçici olarak hedefliyoruz.

Bu yakın homologları, Nor1 ve Nur77 karşı çapraz-reaktivite Nurr-1 spesifik olan poliklonal antikorlar Free üretimi

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

Bu prosedürün genel amacı, çapraz reaktif antikorların uzaklaştırılması yoluyla, birbirine yakından benzer proteinlere karşı antikorların özgüllüğünü artırmaktır. Bu işlem, öncelikle homolog proteinler arasında en büyük farklılığa sahip protein domainlerinin belirlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, bu protein domainlerinin eksprese edilmesi ve saflaştırılmasıdır.Ardından, bu protein domainleri N veya C terminali aracılığıyla bir kromatografi matrisine bağlanır. Bu gösterimde Spheros kullanılmıştır. Son adım, immün serumun her bir çapraz reaktif domaine bağlı rezinlerle inkübe edilmesinden oluşur.Nihayetinde, prosedürün etkinliğini değerlendirmek için ELISA ve Western blotting uygulanır. Bu tekniğin, monoklonal antikor kullanımı veya afinite saflaştırması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bilinen çapraz reaktif epitopları elimine ederken istenen hedefe karşı afiniteyi koruyabilmemizdir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, çalışmaya çalıştıkları proteinin stabil olmaması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.Bu prosedür, laboratuvarımızdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Uri Kim tarafından gösterilecektir. Bu çalışma için iki kolon gerekmektedir; bunlardan biri nöron kaynaklı yetim reseptörü (nor1) için, diğeri ise NER büyüme faktörü IB (nor77) için kullanılacaktır. Her iki protein için de aynı protokol uygulandığından, yalnızca bir kolonun hazırlanışı gösterilecektir.Reçineye bağlanacak proteini buz üzerinde çözün ve ardından molar sönümleme katsayısını ve 280 nanometredeki absorbansını kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. İki miligram protein için iki mililitre reçine kullanın. İzleyen tüm adımlar iki mililitre reçine için geçerlidir.10 mililitrelik bir kolonda, FR'yi alta doğru iterek ve içerisinden PBS pH 7.4 geçirerek 10 mililitrelik bir kolon hazırlayın. Kolonun altını kapatın ve iki mililitre kenetleme tamponu ekleyin. İki mililitre reçine elde etmek için kolona dört mililitre süspansiyon ekleyin.Alt kapağı çıkarın ve kolonun boşalmasını bekleyin. Kolonu toplam altı mililitre veya üç reçine yatak hacmi bağlanma tamponu ile durulayın ve kolonun boşalmasına izin verin. Bağlanma tamponu boşaldıktan sonra alt kapağı tekrar yerine takın.Ardından, kenetleme tamponunda süspande edilmiş iki ila dört mililitre proteini kolona ekleyin. Kenetleme verimliliğini değerlendirmek için protein çözeltisinden bir alikot ayırın. Daha sonra kolonu kapatın ve uçtan uca karıştırın.Homojen bir çözelti hazırlamak için, reçine hacmini göz önünde bulundurarak reaksiyonun toplam hacmini ölçün ve reaksiyonun her mililitresi başına 10 µL beş molar sodyum sano borohidrür ekleyin. Kolonun kapağını kapatın ve altüst ederek karıştırın. Kolonu bir tüp rotatörüne sabitleyin ve reaksiyonun gece boyunca devam etmesini sağlayın.Ertesi sabah, dört °C'de kolonu kimyasal çeker ocak altına alın ve bazı gazlar oluşmuş olabileceği için kapağı dikkatlice çıkarın. Kolonu temiz bir tüpe boşaltın ve elüatı saklayın. Elüatın protein konsantrasyonu ölçülecek ve başlangıç protein konsantrasyonu ile karşılaştırılacaktır.Kenetleme verimliliğini değerlendirmek için rezinle dört mililitre kenetleme tamponu ile yıkayın ve kolonun süzülmesine izin verin. Ligand bağlanma alanı veya LBD rezinle kenetlendikten sonra, bir sonraki adım kalan bölgeleri bloke etmektir. Bu prosedüre başlamak için rezini dört mililitre söndürme tamponu ile yıkayın, süzün ve alt kapağı yerine takın.İki mililitre sönümleme tamponu ekleyin ve reçineyi süspande edin. Reçine hacmini ve sönümleme tamponu hacmini ölçerek toplam reaksiyon hacmini belirleyin. Reaksiyon hacminin her bir mililitresi için 10 mikrolitre beş molar sodyum siyanoborohidrür ekleyin.Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nazikçe karıştırın. Uçtan uca karıştırın. 30 dakika sonra kolonu çeker ocak altına alın. Üst kapağı dikkatlice çıkarın, ardından alt kapağı çıkararak kolonun bir atık tüpüne süzülmesini sağlayın.Kolonu beş reçine hacmi yıkama solüsyonu ile yıkayın. Artık proteinlerin varlığını 280 nanometredeki çıkış absorbansını ölçerek takip edin; bağlanmamış proteinler yüksek tuz konsantrasyonu ile yıkanarak uzaklaştırılır. Son olarak, reçineyi %0,02 Sodyum azide içeren altı mililitre DGAs PBS ile yıkayın ve kolonu ihtiyaç duyulana kadar dört derece santigrat sıcaklıkta muhafaza edin.NORE 77 LBD bağlı kolonunu 10 milliliters PBS ile durulayıp kolonun süzülmesini sağlayarak nore tek spesifik antikorların saflaştırma prosedürüne başlayın; kolonun altını kapatın ve süzülmüş neuro 77 LBD bağlı kolonu yeni bir 15 milliliter toplama tüpüne yerleştirin. Kolona beş milliliters protein A saflaştırılmış anti neuro tek antikor ekleyin ve kapağını kapatın. Kolonu dört degrees celsius sıcaklıkta bir saat boyunca bir rotatör üzerine yerleştirin.Ardından, üst ve alt kapakları çıkarın ve akışla birlikte gelen sıvıyı toplayın. Bu sıvıyı, bir LBD bağlı kolona ekleme zamanı gelene kadar buz üzerinde bekletin.LBD bağlı sütunu 10 mililitre PBS ile durulayın ve sütunun süzülmesine izin verin; ardından sütunun altını kapatın ve LBD bağlı sütunu 15 mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirin. LBD bağlı sütundan gelen akış içeriğini ekleyin. Sütunu kapatın ve bir saat boyunca dört °C'de bir rotora yerleştirin.Bir saat sonra, üst ve alt kapakları çıkarın ve akış hattından geçen sıvıyı toplayın. 280 nanometredeki absorbansı ölçerek antikor konsantrasyonunu belirleyin.Saflaştırılmış anti nore one antikoru daha sonra Eliza ile analiz edilir. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 100 µL protein ekleyin. Üç farklı protein test ediliyorsa; kuyucuklar A1-H4'e 100 µL protein bir, kuyucuklar A5-H8'e 100 µL protein iki ve kuyucuklar A9-H12'ye 100 µL protein üç ekleyin.Plakayı kapatın ve ertesi sabah dört derece Celsius'te gece boyunca inkübe edin. Kaplanmış kuyucukları, kuyucuk başına 300 µL PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, antijenle kaplanmış tüm kuyucuklara 300 µL ELISA bloklama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.İki saatlik bloklamanın ardından, her kuyucuktaki ELISA bloklama tamponunu 100 µL taze ELISA bloklama tamponu ile değiştirin. Sıradaki tüm kuyucuklara 100 µL seyreltilmiş saflaştırılmış anti-EU 1 antikoru ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Plakayı üç kez %0,05 tween 20 ile yıkayın; üçüncü yıkamadan sonra, fazla yıkama tamponunu uzaklaştırmak için plağı kurulayın. Her kuyuya, Eliza bloklama tamponunda seyreltilmiş, horseradish peroksidaz konjugeli keçi anti-rabid IgG'den 100 microliters ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, plakayı daha önce gösterildiği gibi üç kez %0,05 tween 20 ile yıkayın; üçüncü yıkamadan sonra işlemi tamamlayın.Tüm kuyucukları 300 µL deiyonize su ile doldurarak durulayın, plakayı emici bir kağıt üzerine ters çevirerek fazla suyu temizleyin. Tüm kuyucuklara oda sıcaklığına getirilmiş 100 µL 3',5',5'-tetraetilbenzin ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 15 ila 30 dakika inkübe edin. Her kuyucuğa 50 µL 2 N S-ürid asidi ekleyerek reaksiyonu durdurun.Son olarak, 450 nanometredeki absorbansı okuyun. 650 nanometredeki arka plan değerini çıkarın. Protein karşılaştırması. Spesifik antikor içermeyen saflaştırılmış protein.Saflaştırılmış anti Noro 1 antikorlarının no 77 LBD ve no 1 LBD kolonlarından geçirilmesi, saflaştırılmış anti Noro 1'in no 1 LBD'ye güçlü bağlanma gösterdiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, no 77 LBD'ye ve no 1 LBD'ye de önemli düzeyde bağlanma göstermiştir. Anti Noro 1'in no 77 LBD ve no 1 LBD'ye karşı daha ileri düzeyde saflaştırılması, bu çapraz reaksiyonu tamamen ortadan kaldırmıştır. Bu özgünlük, Myc etiketli tam uzunluktaki nor 1, nor 1 ve nor 77 taşıyan ekspresyon vektörleri ile transfekte edilmiş hücrelerden alınan ekstraktların Western blot analizi ile daha ileri düzeyde gösterilmiştir; anti-Myc antikorları, her bir tam uzunluktaki proteinin beklenen moleküler ağırlıkta eksprese edildiğini ortaya çıkarmıştır. Saflaştırılmış anti Noro 1 proteini, tam uzunluktaki Noro 1'i güçlü bir şekilde tespit etmiş, ancak Noro 1 ve Noro 77'yi de daha az verimli olmakla birlikte tespit etmiştir.Buna karşılık, tam olarak saflaştırılmış nor one antikoru, nor one ve nor 77 ile tespit edilebilir herhangi bir çapraz reaktivasyon göstermemiştir. Tam saflaştırılmış nor one antikoru ile orta beyin dopamin nöronlarının immünohistokimyasal analizi, nor one immünohistokimyasının belirgin ekspresyonunu doğrulamıştır. Tirozin hidroksilaz kullanımı, neuro one'ın aynı zamanda substantia nigra bölgesindeki orta beyin dopamin nöronlarının çekirdeğinde de özel olarak eksprese edildiğini ortaya çıkarmıştır. Bu teknikten ustalık kazanıldıktan sonra, prosedür uygun şekilde yürütülürse iki günde tamamlanabilir. Sodyum iyonu veya hidrür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken her zaman kimyasal çeker ocak altında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

production-nurr-1-specific-polyclonal-antibodies-free-cross

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, metallopeptidaza karşı rekombinant antikorların üretimi için bir prosedürü göstermektedir. Antikor, yeşil floresan proteini ve antibiyotik direnci genlerini taşıyan rekombinant plazmitler, lipofektamin ile epitel hücrelerine transfekte edilir. Transfekte edilen hücreler, rekombinant antikorlar oluşturmak için seçilir ve yetiştirilir.

Metallopeptidaza Karşı Rekombinant Antikorlar Üretmek İçin Bir Yöntem

Son yıllarda, canlı hücre bazlı deneyler, yüzey ve şekilsel antijenlere karşı antikorlar tespit etmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada, hastaların büyük kuşaklarının analiz sağlayarak sitometri yüksek verimli akışını kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Yeni antikorların tespiti immün aracılı bozuklukların tanı ve tedavi artıracaktır.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Burada, ifade ve E. (P) etki çıkıntılı yüksek kaliteli Norovirus arındırmak için bir yöntem tarif E. coli X-ışını kristalografisi çalışmalarında kullanılmak üzere. Bu yöntem, diğer calicivirüs P etki, hem de yapısal olmayan proteinleri de uygulanabilir, yani., Virüs protein genom bağlı (VPg), proteaz ve RNA bağımlı RNA polimeraz (RdRp).

İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde<em&gt; E. E. coli</em&gt;, X ışını Kristallografi için

Burada yazarlar, saflaştırılmış bir monoklonal antikor ve nokta-leke hibridizasyonulama yoluyla peptit taraması kullanarak doğrusal bir antijenik epitop tanımlamak için basit ve verimli bir protokol sunmaktadır. Tanımlanan epitop daha sonra terapötik ve tanısal uygulamalarda kullanılabilir.

Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

NR1 alt birim NMDA reseptör karşı otoantikorlar ile otoimmün ensefalit şüphesi hastaların kan algılamak için antijen olarak insan embriyonik hücreleri (HEK293) yeşil flüoresan protein tagged NMDA reseptör ectopically dile getirdi. Bu basit yöntem klinik ayarları, amacıyla filtreleme için uygun olabilir.

N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil

Bu makale hazırlanması ve doğal ürünler kullanmak üzere çeşitli uzun karşı Monoklonal antikor değerlendirilmesi için detaylı bir protokol sağlar. Bu yordam bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA olumlu klon eleme ve monoklonal Hibridoma hazırlık için içerir. Antikor karakterizasyonu MALDI-TOF-MS ve ELISA analizleri kullanarak spesifikasyonları da temin edilmektedir.

Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi

Burada nötralize antikorlar veya enzim replasman terapiler beyin omurilik sıvısı (BOS) veya insan serumu gibi insan bir matris hücresel alımını müdahale diğer faktörler tespit etmek için bir hücre tabanlı akış sitometresi Yöntem mevcut.

Enzim replasman terapileri ile hücre tabanlı tahlil hücresel alımını nötralize antikorların tespiti

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen rekombinant antikor proteini ve geleneksel hibridoma teknolojisi kullanılarak üretilen monoklonal antikorlar, domuz aminopeptidaz N (APN) proteinini tanıyabilir ve bağlanabilir.

Domuz Bağırsak Mukozal Epitelinde Aminopeptidaz N'yi Hedef Alan Monoklonal Antikorların Üretimi

Yaw tork tork metre ile gergin Drosophila Ölçüm deneysel hayvan uyaran durumun sinirbilimci nefis kontrol sağlar. Meyve sineği benzersiz bir genetik araçları ile birlikte, bu paradigma nörobiyolojik araştırma geniş bir yelpazede kullanılmaktadır.

Tork Metre Drosophila Edimsel Öğrenme

Keşfedin, homolog proteinlere karşı antikor spesifitesini artırmak için çapraz-reaktif antikorları kaldırma yöntemini. Bu teknik, Nurr-1 spesifik poliklonal antikor üretimi için immünoloji ve protein kimyasında uygulanır.

Bu yakın homologları, Nor1 ve Nur77 karşı çapraz-reaktivite Nurr-1 spesifik olan poliklonal antikorlar Free üretimi

Daha fazla video keşfet