Name: İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Öğrenin fare aortasından endotel hücre izolasyonu ve kültürü için basit bir yöntemi. Bu protokol yüksek hücre canlılığı sağlar ve kardiyovasküler hastalık araştırmalarında özel ekipman gerektirmeden kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi 13SDG16930098 ve Çin Ulusal Bilim Vakfı Gençlik Ödülü 81300240 (PI: Wang) tarafından desteklenmektedir. Makalenin hazırlanmasına yardımcı olduğu için Wayne State Üniversitesi'nden Roberto Mendez'e teşekkür ederiz.

Fareler ile Aort 1. İzolasyonu Burada anlatılan tüm işlemler Wayne State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. <ol><li> anestezi makinesinin indüksiyon odasına fare koyun. % 25 taze hava ve% 75 O 2 ile birlikte% 4 izofluran akışını ayarlayın. Özel bir burun konisi tarafından takip indüksiyon odasına aracılığıyla% 25 taze hava ve% 75 O 2 ile birlikte izofluran (indüksiyon için% 4, bakım için 1.0 ±%) solunmasıyla fare anestezisi. NOT: izofluran ile Anestezi% 75 oksijen /% 25 hava veya% 100 oksijen teslim edilebilir. </li><li> Uygun anestezi düzeyi (ayak tutam çekilmesi eksikliği) ulaşılana kadar fareye her 5 dakikada kontrol edin. </li><li> indüksiyon odasının dışında fare alın ve anestezi makinesine bağlı olan özel burun konisi olsa izofluran inhalasyon devam ediyor. Anahtarıizofluran anestezi korumak için% 1 akar. </li><li> o anestezi altında iken, kendi arka yüzünde konumlandırılmış bir ameliyat ped, üzerine fare koymak. bacaklarda sabitlemek için laboratuvar bant kullanın. </li><li> Fare sıcak tutmak için bir ısıtma lambası kullanın. Fare olmaz aşırı ısı böylece fare uygun bir mesafe lamba tutun. </li><li> % 70 etanol ile göğüs püskürtün. </li><li> orta hattan karın açın ve abdominal aorta göstermek için diseksiyon makas kullanın. göğüs boşluğu açın ve kalp ve akciğerler maruz kalmaktadır. </li><li> kan serbest bırakmak için diseksiyon makas ile ortasında bulunan abdominal aorta kesin. </li><li> Heparin 1000 U / mL ihtiva eden 1 mL PBS (25 G iğne ile) 1 ml şırınga doldurun. sol ventrikül heparin 1,000 U / mL içeren PBS enjekte edilir ve aorta serpmek. aorta maruz farelerin sağ tarafına büyük arterlerde forseps ile kalp ve akciğer itin. </li><li> Hızla mikro-di kullanılarak aorta kaldırmakssection forseps ve buz gibi soğuk 1x PBS (steril) koymak, sonra bir laminer hava akımı kaputun içine kabı taşıma. </li><li> Aort bir ucuna 25 G iğne ile donatılmış bir 1 ml şırınga yerleştirin, yavaşça kan çıkarmak için buz soğukluğunda PBS ile aort yıkayın. </li><li> Mümkün olduğunca ekli yağ dokusunun çok küçük ve yan damarları kaldırmak için mikro diseksiyon forseps kullanabilir. </li><li> Hemen büyüme ortamı endotel aort aktarın. </li><li> steril bir neşter bıçak kullanarak 1 mm halkalar şeklinde aorta kesin. Hasat yaklaşık 8 - aort başına 10 yüzük. </li><li> Mikro-diseksiyon makas kullanarak her aort halka açın. </li></ol> 2. Tohum Matrix Aort Bölümleri <ol><li> Kullanılmadığı, katılaşma önlemek için -20 ° C büyüme faktörü azaltılmış matris tutmak zaman. Tam çözülme izin vermek için en az bir gece süreyle 4 ° C&#39;de büyüme faktörü azaltılmış matris koyun. </li><li> en az -20 ° C&#39;de bir 6-yuvalı plaka ve pipet uçları ön soğutma10 dk. Herhangi bir hava baloncuklarının oluşumunu olmayan matris 1 mL plakanın buz ve kat üzerindeki bir 6 yuvalı plaka koyun. 20 dakika matris katılaşmaya izin için bir 37 ° C inkübatör plaka koyun. </li><li> Steril mikro diseksiyon forseps kullanılarak katılaşmış matris üzerine aort parçaları implante edin. endotel dokunmadan lümen tarafı aşağı matris üzerinde parçalarını yerleştirin. matris üzerinde birbirine yakın 4 aort segmentleri - 3 koyun. </li><li> (~ 200 uL), ıslak segmentleri tutmak için yeterli endotelyal hücre büyüme ortamı ilave edin. </li><li> 4 ila 6 saat boyunca% 5 CO2 altında 37 ° C&#39;de inkübe plakası. Günün sonunda, aort segmentleri kaplamak için yeterli miktarda ortam ilave edin. </li><li> Bir faz-kontrast mikroskop altında periyodik olarak çimlenme aort segmenti gözlemleyin. orta düzeyde ve hücre büyümesini her gün kontrol edin. örtülü aort segmentleri tutmak için gerekirse orta ekleyin. </li><li> 4. gününde, yavaşça orta kaldırmak ve aort segmentleri f kaldırmakbüyüyen endotel hücrelerini kesmeden steril iğne kullanılarak matrisi rom. </li><li> Yeni endotel hücre büyüme ortamı 2 ml ilave edilir ve endotel hücreleri 2 matris üzerinde çoğalmaya devam etmesini - 3 gün. </li></ol> Fare Aort Endotel Hücreleri 3. İlk Pasajlanması <ol><li> Kat jelatin (% 0.1) ile birlikte, yeni bir T12.5 şişeye, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Steril 37 ° C PBS ile dikkatlice matris plakaları yıkayın. </li><li> Matris plakalarına nötr proteinazı (50 U / mL) 2 ml ilave edilir ve ara sıra çalkalanarak platform rocker oda sıcaklığında inkübe edin. Hücrelerin büyük çoğunluğu müstakil emin olmak için bir faz-kontrast mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. </li><li> Nötr proteinaz inaktif D-Val 2 mL ekleyin. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne dikkatli bir şekilde supernatant toplamak. 2 mL D-Val ile plaka yıkayın ve süpernatant toplamak. </li><li> roo 5 dakika boyunca 900 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüjm sıcaklığı. </li><li> jelatin ile kaplanmış T12.5 şişede endotelyal hücre büyüme ortamı ve plakanın 4 mL hücre pelletini yeniden askıya. 2 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. </li><li> orta yerine. % 90 konfluent - bunlar% 85 kadar, 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. </li></ol> Fare aort endotel hücreleri 4. pasaj <ol><li> Kat iki yeni T12.5 şişeler jelatin (% 0.1) ile birlikte, 30 dakika süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. yaklaşık 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de ön ısıtma Tripsin-EDTA (% 0.25 tripsin, PBS içinde 0.02 EDTA) ve steril PBS ile yıkandı. </li><li> Steril 37 ° C PBS ile dikkatlice hücreleri yıkayın. </li><li> Tripsin-EDTA (% 0.25 tripsin, PBS içinde 0.02 EDTA), 0.5 ml ilave edilir ve yaklaşık 1 dakika ya da hücrelerin çoğunluğu boyunca edecek kadar 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> sindirim durdurmak için endotelyal hücre büyüme ortamı 2 mL ekleyin. yukarı ve aşağı şişesi birkaç kez içinde hücre süspansiyonu pipetle. Gerekirse, bir hücre kullanabilirhücreleri toplamak için kazıyıcı. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu toplanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 900 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> jelatin ile kaplı 2 T12.5 şişelerinde endotelyal hücre büyüme ortamı ve plakanın 4 mL hücre pelletini yeniden askıya. 2 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. </li><li> orta yerine. % 90 konfluent - bunlar% 85 kadar, 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. </li><li> 3 geçişleri - 2 sonra fare aort endotel hücreleri kullanır. </li></ol> Fare aort endotel hücreleri 5. Karakterizasyonu <ol><li> Yeniden plaka hücreleri. <ol><li> Kat jelatin (% 0.1) ile birlikte, 6 gözlü bir levha, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. PBS ile plaka durulayın. </li><li> Ön-ısıtma, yaklaşık 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;ye kadar Tripsin-EDTA ve steril PBS. </li><li> Steril PBS ile 3 kez hücreleri yıkayın. hücrelere 0.5 tripsin mL / EDTA ekle, 37 ° C o de ~ 1 dakika boyunca inkübeHücrelerin çoğunda kadar r yuvarlak açın. </li><li> sindirim durdurmak için endotelyal hücre büyüme ortamı 2 mL ekleyin. yukarı ve aşağı şişesi birkaç kez içinde hücre süspansiyonu pipetle. Gerekirse, hücreleri toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu toplanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 900 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> endotelyal hücre büyüme ortamı içinde hücrelerin yeniden askıya, süpernatant atılır. De, 3 x 10 5 / yoğunluğunda jelatin ile kaplanmış 6-çukurlu plaka içindeki hücreleri tohumu. </li><li> Hücreler, kültür yüzey eklemek için bir gece 37 ° C,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. </li></ol></li><li> Dil-ac-LDL bağlama -lectin Alınan ve Ulex. <ol><li> , 1,1-dioktadesil-3,3,3 &#39;deposu 3&#39;- tetramethylindo-karbosiyanin perklorat etiketli -20 ° C&#39;de asetile LDL (Dil-Ac-LDL). boyama önce, buz üzerinde Dil-ac-LDL Çözülme. Stokta Dil-ac-LDL soluma / ml 1 mg&#39;dır. 4 ° C&#39;de FITC işaretli Ulex europaeus agglutinin (Ulex -Lectin, 1 ug / mL) saklayın. Hazır Ulex -Lectin Çözelti 1 mg / mL&#39;dir. Mağaza 4 ° C&#39;de Hoechst 33342. Hazır Hoechst 33342 çözeltisi, 100 ug / mL&#39;dir. </li><li> 10 ug / ml bir nihai konsantrasyon yapmak için kültür ortamı, 1 ml inceltilmiş-Ac-LDL stok solüsyonu 10 uL ekleyin. </li><li> boyama öncesinde, eski orta çıkarın ve yeni ortam ile her bir hücrelerin yıkayın. </li><li> Yeni orta çıkarın ve Dil-ac-LDL boyama orta ekleyin. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. </li><li> Steril 1x PBS ile 3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> hücrelerin tespit edilmeleri için% 10 formalin 1 ml. yaklaşık 30 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka koyun. </li><li> Steril 1x PBS ile 3 kez hücreleri yıkayın. Işığı kaçının. </li><li> Ulex -Lectin 10 uL içeren 1 ml steril 1 x PBS ekleyin. </li><li> Oda temperatu hücreleri inkübe1 saat boyunca karanlıkta yeniden. </li><li> Steril 1x PBS ile 3 kez hücreleri yıkayarak Ulex-lektin çıkarın. </li><li> , 1 ug / ml nihai konsantrasyona kadar Hoechst 33342 ekleme karanlıkta 10 dakika inkübe edilir. </li><li> Dil-Ac-LDL (kırmızı, 576 nm emisyon dalga boyu), Ulex -Lectin (yeşil, 519 nm emisyon dalga boyu) ve Hoechst floresan görüntüleme (mavi, 361 nm emisyon dalga boyu) bir ters flüoresan mikroskop ile. </li></ol></li><li> CD31, VEGFR2&#39;sinin, eNOS için Floresan boyama, VE-kaderin ve calponin. <ol><li> Mağaza FITC-konjüge anti-fare CD31 antikoru, eNOS antikoru, VE-cadherin 4 ° C&#39;de antikoru FITC-konjuge anti-tavşan IgG karanlıkta. -20 ° C&#39;de saklayın VEGFR2 antikoru. </li><li> Steril 1x PBS ile 3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> hücrelerin tespit edilmeleri için% 10 formalin 1 ml. yaklaşık 30 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka koyun. </li><li> Steril 1x PBS ile 3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> CD31 leke için, 1 ml steril 1x ekleyinCD31-FITC antikoru 10 uL içeren PBS ile yıkandı. sırasıyla-VE Cadherin veya primer antikor calponin, leke ya VEGFR2, eNOS,-VE Cadherin veya calponin, VEGFR2&#39;sinin, eNOS 4 mcL içeren steril 1x PBS 1 ml ekleyin. </li><li> Karanlıkta 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri. </li><li> Steril PBS ile 3 kez hücreler yıkanarak antikor çıkarın. </li><li> VEGFR2 boyanması için, eNOS, VE-cadherin ya calponin FITC-konjuge anti-tavşan IgG, 10 uL içeren steril 1 x 1 mL PBS ilave edin. Karanlıkta 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri. Steril PBS ile 3 kez hücreler yıkanarak IgG çıkarın. </li><li> , 1 ug / ml nihai konsantrasyona kadar Hoechst 33342 ekleme karanlıkta 10 dakika inkübe edilir. </li><li> CD31, VEGFR2, eNOS floresan görüntüleme VE-cadherin bir ters flüoresan mikroskop ile, calponin (yeşil, 518-535 nm emisyon dalga boyu) ve Hoechst (mavi, 361 nm emisyon dalga boyu). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+early+structural-functional+changes+in+the+endothelium+for+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).</li>
<li>Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells%2C+antineutrophil+cytoplasmic+antibodies%2C+and+cytokines+in+the+pathogenesis+of+systemic+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+rheumatology+reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis.</a> Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).</li>
<li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Reactive+protein-induced+endothelial+microparticle+generation+in+HUVECs+is+related+to+BH4-dependent+NO+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+vascular+research%22%5BJournal%5D)">C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation.</a> Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).</li>
<li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+circulating+CD31%2B%2FCD42-+microparticles+are+associated+with+impaired+systemic+artery+elasticity+in+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+hypertension%22%5BJournal%5D)">Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects.</a> American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).</li>
<li>Mackay, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells+from+patients+with+severe+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema.</a> Respiratory research. 14, 23(2013).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).</li>
<li>Bowden, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+alpha4+integrin+and+VCAM-1+in+CD18-independent+neutrophil+migration+across+mouse+cardiac+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium.</a> Circulation research. 90, 562-569 (2002).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+induces+apoptosis+in+mouse+aortic+endothelial+cells+and+endothelial+dysfunction+in+mice+fed+high-calorie+and+high-cholesterol+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets.</a> Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).</li>
<li>Atkins, G. B., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+differentiation%3A+molecular+mechanisms+of+specification+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).</li>
<li>Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brothers+and+sisters%3A+molecular+insights+into+arterial-venous+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity.</a> Circulation research. 108, 929-939 (2008).</li>
<li>Shimamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+and+foods+on+contraction+of+endothelial+cells+as+a+key+mechanism+in+atherogenesis+and+treatment+of+atherosclerosis+with+endothelial-cell+relaxants+%28cyclic+AMP+phosphodiesterase+inhibitors%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors).</a> Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).</li>
<li>Chiu, J. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium%3A+pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).</li>
<li>Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%2C+hemodynamic+forces%2C+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).</li>
<li>Rostgaard, J., Qvortrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+demonstrations+of+filamentous+molecular+sieve+plugs+in+capillary+fenestrae%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae.</a> Microvascular research. 53, 1-13 (1997).</li>
<li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+endothelial-myocardial+signaling%3A+its+role+in+cardiac+growth%2C+contractile+performance%2C+and+rhythmicity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu çalışma, herhangi bir özel ekipman olmadan bir fare aort hücreleri izole ve kültür endotel için basit bir yöntemi gösterir. immünofloresan boyama hücrelerin çoğunluğu, ikinci geçiş sonra endotel hücreleri olduğunu göstermiştir. Üçüncü geçişine saniyede hücreleri, in vitro ve endotelyal biyolojisi okumak için in vivo deneyler uygun olduğu ileri sürülmektedir. Mevcut Protokolü Önemli Notlar prosedüründe beş kritik noktaları var...

Vasküler endotelyum, sadece kan ve doku ayıran bir bariyer tabakası, bir 400 metre kare 1 kadar bir yüzey alanı ile damar ağacı boyunca uzanır geniş bir endokrin bezi olarak kabul edilir. endotel refahını damar homeostazının için gereklidir. Disfonksiyonel endotel ateroskleroz, vaskülit ve iskemi / reperfüzyon yaralanması gibi 2-4 dahil olmak üzere çeşitli kardiyovasküler bozuklukların, katılır. Bugüne kadar, bu hastalık ayarlarında yer alan spesifik hücresel ve moleküler mekanizmalar iyi sonucu endotel dağınık anatomik yapısına anlaşılamamıştır. Genetik manipülasyon teknikleri, diğer herhangi bir memeli türlerde daha farelerde geliştirilmektedir, çünkü, fare araştırmaları için önemli bir modeldir. Aort küçük boyutlu enzymat yapar çünkü Ancak, birincil fare aort endotel hücreleri izolasyonu özellikle zor olarak kabul edilirpratik endotel ic sindirimi. Bazı izole ve EC 5-7 gerektirir arındırmak için prosedürler bildirdi. Bu protokolün amacı, herhangi bir özel ekipman kullanmadan fare aorta endotel hücreleri izole ve genişletmek için basit bir yöntem kullanmaktır. Bu protokol, yeni izole edilmiş aort küçük parçalar halinde kesilir ve endotel filizlenmesi için izin vermek için aşağı doğru dönük endotel ile bir matris üzerine tohumlandı. segmentler kaldırıldıktan sonra endotel hücreleri endotel tercih ortamda genişletildi ve iki ya da üç geçişten sonra deneyler için hazırdır. tarif edilen metodun avantajları: 1), tek bir aort hasat endotel hücrelerinin oldukça yüksek sayılar; 2) hücre canlılığı iyi korunmuştur; ve 3) hiçbir özel ekipman veya teknik gereklidir. Bu endotel hücre patofizyolojisinde spesifik hücresel ve moleküler mekanizmaların tanımlanması için etkili bir araç sağlar. pr okuyan ilgilenen olanlar içinHer iki gen knock-out farelerinden alınan imary kültürlenmiş endotel hücreleri, gen knock-fareler ya da bir fare hastalık modeli, bu protokol, çok kullanışlı ve pratik kolaydır.

<table><tbody><tr><td>4 veya 6 haftalık fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>#10010-023</td><td></td></tr><tr><td>1.000 U/mL heparin içeren steril 1x PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Endotel hücre büyüme ortamı (Dulbeccos' Değiştirilmiş Kartal' s Orta [DMEM] ile 25&nbsp; mM HEPES [Gibco, #12320-032], 100&nbsp; ile desteklenmiş; &mu; sığır sinir dokusundan g/mL endotel hücre büyüme takviyesi [EKGS, Sigma, #2759], %10 fetal sığır serumu [FBS, Gibco, #10082-147], 1.000&nbsp; U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10.000&nbsp; U/mL penisilin ve 10&nbsp; mg / mL streptomisin [Gibco, # 15140-122])</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Büyüme faktörü azaltılmış matris</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Nötr proteinaz (Dispas, 1&nbsp; U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) ve D-Val ortamı (D-Valin, 0.034&nbsp; g/L, Sigma, #1255), Dulbeccos'ta Değiştirilmiş Kartal' s Orta, düşük glikoz (Gibco, #12320-032)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1'-dioktadesil-3,3,3',3',3'- tetrametilindo-karbosiyanin perklorat etiketli asetillenmiş LDL (Dil-ac-LDL)</td><td>Life Technologies</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>FITC etiketli Ulex europaeus aglütinin (Ulex-Lektin)</td><td>Sigma</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD31-FITC konjuge antikor</td><td>BD Biosciences</td><td>553372</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2 antikor</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>9698</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare endotelyal nitrik oksit sentaz</td><td>Abcam</td><td>ab5589</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare vasküler endotel-kaderin</td><td>Abcam</td><td>33168</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare calponin</td><td>Abcam</td><td>700</td><td></td></tr><tr><td>FITC konjuge anti-tavşan IgG</td><td>Sigma</td><td>F6005</td><td></td></tr><tr><td>25-G iğne ile donatılmış 1 mL şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-900-04222</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Peri yemekleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-516</td><td></td></tr><tr><td>Altı kuyulu hücre kültürü plakaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>T12.5 kültür şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-076</td><td></td></tr><tr><td>Makas, forseps, mikrodiseksiyon makası ve forseps, Neşter bıçağı</td><td>Güzel Bilim Araçları, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzofluran ile anestezi makinesi</td><td>Webster Veteriner Kaynağı</td><td>07-806-3204</td><td></td></tr><tr><td>ısıtma lambası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj makinesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters faz kontrast mikroskobu</td> ters floresan mikroskobu <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İzolasyon ve fare aort endotel hücreleri İlköğretim kültür

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Vasküler endotel normal vasküler homeostaz için gereklidir. Disfonksiyonu çeşitli kardiyovasküler bozukluklara katılır. Fare, kardiyovasküler hastalık araştırmaları için önemli bir modeldir. Bu çalışma, herhangi bir özel ekipman olmadan fare aortundan endotel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için basit bir yöntem göstermektedir. Endotel hücrelerini izole etmek için, torasik aort fare vücudundan hızlı bir şekilde çıkarılır ve bağlı yağ dokusu ve bağ dokusu aorttan çıkarılır. Aort 1 mm'lik halkalar halinde kesilir. Her aort halkası açılır ve endotel aşağı bakacak şekilde büyüme faktörü azaltılmış bir matris üzerine ekilir. Segmentler, yaklaşık 4 gün boyunca endotel hücre büyüme ortamında kültürlenir. Endotel filizlenmesi 2. gün kadar erken başlar. Segmentler daha sonra çıkarılır ve hücreler birleşene kadar sürekli olarak kültürlenir. Endotel hücreleri, nötr proteinaz kullanılarak hasat edilir ve deneyler için kullanılmadan önce iki geçiş daha için endotel hücresi büyüme ortamında kültürlenir. İmmünofloresan boyama, ikinci pasajdan sonra hücrelerin çoğunun, endotel hücrelerinin tipik özellikleri olan Dil-ac-LDL alımı, Lektin bağlanması ve CD31 boyaması için çift pozitif olduğunu gösterdi. İkinci ila üçüncü pasajlardaki hücrelerin, endotel biyolojisini incelemek için in vitro ve in vivo deneyler için uygun olduğu öne sürülmektedir. Protokolümüz, endotel hücre fizyopatolojisinde spesifik hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için etkili bir yol sağlar.

Endotel Hücre Çimlenme Spontan endotel hücre, bir fare aort segmentine başladı filizlenme. Fare aortu kademeli bir 4 gün boyunca endotelyal hücre büyüme ortamı içinde daha sonra bir büyüme faktörü azaltılmış matrisi üzerinde büyümeye bırakılmıştır. 4 gün - endotel hücre filizlenmekte genellikle 2 görünür. Fotomikrograflar, 4. günde (Şekil 1) üzerine çekildi. resimlerde gösterildiği gibi, çok sayıda endotel hücreleri uzak segmentten göç ederler. Yeni oluşan f...

Vasküler endotel hücreleri birçok önemli kardiyovasküler hastalıkta önemli rol oynamaktadır. Bu makale, herhangi bir özel ekipman kullanmadan fare aortundan endotel hücrelerini izole etmek ve genişletmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Protokolümüz, endotel hücre fizyopatolojisindeki mekanizmaları tanımlamak için etkili bir yol sağlar.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Bu prosedürün genel amacı, herhangi bir özel ekipman kullanmadan fare aortundan endotel hücrelerini izole etmek ve çoğaltmak için basit bir yöntem kullanmaktır. Endotel hücrelerini izole etmek için kullanılan diğer yöntemler çoğunlukla aorta değil, kalp veya akciğerlere uygulanmaktadır. Aorta için geliştirilen bu teknik, önemli ölçüde daha yüksek verim ve yüksek hücre canlılığı sağlar; ayrıca özel bir ekipman veya teknik gerektirmez.Bunlar, knockout veya murine farelerden elde edilen primer endotel hücrelerin çalışılmasına uygulandığında, çoğu hastalık modeli için geçerlidir. Bu protokol oldukça kullanışlıdır ve uygulanması kolaydır. Bu protokole günün başlangıcında başlayın.Bir fare anestezi edildikten ve refleks yoksunluğu onaylandıktan sonra, fareyi bir cerrahi ped üzerine sırtüstü yerleştirin ve vücut sıcaklığını korumak için üzerine bir ısıtıcı lamba konumlandırın. Ardından, abdomen bölgesini %70 ethanol püskürterek sterilize edin. Sonrasında, abdominal aortayı açığa çıkarmak için diseksiyon makasıyla abdomeni orta hat boyunca açın.Ardından, kalp ve akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs boşluğunu açın. Şimdi, aortanın orta hattı boyunca diseksiyon yaparak farenin kanını boşalt

isolation-and-primary-culture-of-mouse-aortic-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC), kan-beyin bariyeri (BBB) olarak adlandırılan, kanı ve merkezi sinir sistemini (CNS) ayıran yüksek düzeyde düzenlenmiş bir bariyer oluşturan spesifik bağlantı proteinleri ile birbirine bağlanır. Bu protokolde tartışıldığı gibi primer murin beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin izolasyonu, BBB'nin ayrıntılı in vitro çalışmalarını mümkün kılar.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Bu protokolün amacı, koroner dolaşımdan fare primer vasküler düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültür teknikleri (VSMC) göstermektir. VSMC'Ier izole edildikten sonra, pek çok standart kültür teknikleri için kullanılabilir.

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

Bu protokol, fare koroner endotel hücrelerini görüntüleme veya moleküler biyolojik deneyler yapmak amacıyla izole etme yöntemimizi paylaşmak için hazırlanmıştır.

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Mikrovasküler endotel hücreleri iskelet kas (MMEC) kas kılcal iç duvar şekil ve her ikisi de, düzenleyen sıvıları/molekülleri ve geçiş (bağışıklık) hücre arasında kas doku ve kan değişimi. Birincil fare MMEC, yalıtım burada açıklandığı gibi kapsamlı tüp bebek araştırmalar "myovascular birimi" sağlar.

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

Primer domuz aort endotel hücrelerinin (pAECs) minyatür domuzlardan izolasyonu için etkili bir enzimatik yöntem tanımlanmıştır. İzole primer pAEC'ler ksenotransplantasyonda immün ve koagülasyon yanıtını araştırmak için kullanılabilir.

Minyatür Domuzlardan Birincil Aort Endotel Hücrelerinin İzolasyon ve Kültürü

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Tek hücreli omik deneyler yapmak için stabil veya rahatsız edici akış koşullarına maruz kalan fare karotis arterlerinin lümeninden endotel hücrelerini ve çekirdeklerini izole etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Tek Hücreli Multi-Omik Deneyler için Fare Karotis Arterlerinin Lümeninden Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu makalede, primer akciğer endotel hücreleri yenidoğan farelerden izole edilmiş ve kültürlenmiştir.

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (BMEC) neonatal fare beyin dokusundan izole edilmesi ve birincil kültürü için bir protokol sunulur; bu protokol kan-beyin bariyer fonksiyonunu fizyolojik ve patolojik koşullarda incelemek için sağlam bir in vitro model oluşturulur.

Fare Bin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin fare aortasından endotel hücre izolasyonu ve kültürü için basit bir yöntemi. Bu protokol yüksek hücre canlılığı sağlar ve kardiyovasküler hastalık araştırmalarında özel ekipman gerektirmeden kullanılabilir.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

Daha fazla video keşfet