Name: Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Öğrenin, tek bir T lenfositinde reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalini eşzamanlı olarak ölçmek için floresan biyomembran kuvvet probu tekniğini. Bu yöntem, T hücre aktivasyon mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu makaleyle ilgili araştırmalar ve Zhu laboratuvarında fBFP teknolojisinin geliştirilmesi, NIH hibeleri AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 ve TW008753. tarafından desteklenmiştir. Bu güçlendirici deneysel aracı icat ettiği için Evan Evans'a ve BFP'yi oluşturmamıza yardımcı oldukları için Evans laboratuvarı üyeleri Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong ve Ken Halvorsen'e teşekkür ederiz. Ayrıca diğer Zhu laboratuvar üyeleri Fang Kong, Chenghao Ge ve Kaitao Li'ye enstrümantasyon geliştirmedeki yardımları için teşekkür ederiz.

<ol><li>Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+signal+modulation+by+cell+adhesion+receptors%3A+the+role+of+integrins%2C+cadherins%2C+immunoglobulin-cell+adhesion+molecules%2C+and+selectins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins.</a> Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of stem cell differentiation.</a> Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).</li>
<li>Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+T+cell+recognition+of+antigen%3A+significance+of+two-dimensional+kinetic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters.</a> Frontiers in immunology. 3, 86(2012).</li>
<li>Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+in+situ+analysis+of+TCR-pMHC+recognition%3A+response+of+an+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network.</a> Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).</li>
<li>Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+recognition+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen recognition at the cell membrane.</a> Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).</li>
<li>Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+triggering%3A+insights+from+2D+kinetics+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+biology%22%5BJournal%5D)">T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions.</a> Physical biology. 9, 045005(2012).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Marshall, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423, 190-193 (2003).</li>
<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).</li>
<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).</li>
<li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+glycoprotein+Ib%2FV%2FIX+and+integrin+alpha+IIbbeta+3-dependent+calcium+signals+cooperatively+regulate+platelet+adhesion+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).</li>
<li>Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cytoplasmic+calcium+signals+in+a+2-stage+platelet+activation+process+induced+by+the+glycoprotein+Ibalpha+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor.</a> Blood. 100, 2793-2800 (2002).</li>
<li>Lefort, C. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+arrest+by+LFA-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil arrest by LFA-1 activation.</a> Frontiers in immunology. 3, 157(2012).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
<li>Lou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+history+dependence+of+receptor-ligand+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Force history dependence of receptor-ligand dissociation.</a> Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Başarılı bir fBFP deneyi birkaç kritik hususlar gerektirir. Kuvvet hesaplama güvenilir olması için Birincisi, mikropipet, RBC ve prob boncuk mümkün olduğunca eş eksenli yakın olarak aynı hizada olmalıdır. RBC ve pipet arasındaki sürtünme ihmal edilebilir, böylece pipet içine RBC izdüşümü yaklaşık bir prob pipet çapı olması gerekir. Tipik bir insan RBC için en uygun pipet çapı Denklem 1 17,30 bir en uygun verimleri 2.0-2.4 mikron olduğunu. İkincisi, kuvvet kelepçe tahlil ve termal dalgalanma deneyinde ölçümler...

Hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris (ECM) yapışma, hücre yüzeyi reseptörleri, ECM proteinleri ve / veya lipidler 1 arasındaki bağlanma aracılık etmektedir. Bağlanma hücreler fonksiyonel yapıları 1 oluşturmak, hem de tanır iletişim ve çevre 1-3 tepki verir. Çözünür proteinler (örneğin, sitokinler ve büyüme faktörleri), bir üç boyutlu (3D) için bağlanan hücre yüzeyi reseptörleri üzerine sıvı faz farklı olarak, hücre yapışma reseptörlerinin moleküler sınırlamak iki karşıt yüzey arasında köprü dar bir kavşak boşluk boyunca kendi ligandları ile bağlar oluşturabilir iki boyutlu (2D) arayüzü 4-7 difüzyon. Genel olarak, geleneksel bağlanma deneyleri (örneğin, yüzey plasmon rezonans ya da SPR) ile ölçülür 3D kinetiği aksine, bölme 11,12 akış, atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 8-10 gibi özel teknikler ile ölçülebilir 2D kinetiği adres Mikropipet 13,14 optikcımbız 15 ve biyomembran kuvveti prob (BFP) 16-21. Sadece hücresel uyum için fiziksel bağlantı sağlayarak daha fazla, yapışma molekülleri çevresi ile iletişim kurmak için hücre için sinyal makine önemli bir bileşenidir. Yapışma moleküllerinin ligand birleşmesi hücre içi sinyalizasyon ve nasıl ilk sinyal hücrenin içinde transdüse olduğunu başlatır nasıl anlayış giderek artan ilgi olmuştur. Sezgisel olarak, reseptör-ligand özellikleri bu indükler sinyalleri etkileyebilir bağlanması. Ancak, bunun nedeni, örneğin onların birçok sınırlamalar, yoksul bir zamansal çözünürlük ve uzaysal çözünürlüğü eksikliği tamamlamak biyokimyasal tahlillerin geleneksel topluluk kullanılarak hücre dışı etkileşim ve hücre içi sinyal olaylar arasındaki ilişkileri incelemek mekanik güçtür. Canlı hem biyofizik (kinetik bağlayıcı 2B reseptör ligand) izin yöntemleri ve biyokimyasal (sinyalizasyon) gözlem MevcutHücreler floresan özelliği 24-26 ile dahil ayarlanabilir sertlik 22 substratlar, 23 elastomer ayağı dizileri ve akış odası / mikroakışkan cihazları bulunmaktadır. Ancak, sinyalizasyon ve bağlayıcı reseptör-ligand Okunan zor sinyal olayları ile bağ özelliklerinin zamansal ve mekansal ilişkilerin incelemek için yapım (farklı yöntemler en sık) ayrı ayrı elde edilmelidir. Konvansiyonel BFP yüksek uzaysal çözünürlüğü 17 ile ultrasensitif kuvvet spektroskopisi olduğunu. Tek moleküllü 2D kinetiği, mekanik özellikler ve yapısal değişikliklerin 14,16,19-21,27-29 ölçümünü sağlayan bir kuvvet sensörü gibi esnek bir kırmızı kan hücresi (RBC) kullanır. Bir flüoresan görüntüleme göre BFP (fBFP) tek bir molekül ölçeğinde bağlama tetiklenen hücre sinyal reseptör-ligandı bağlanma kinetiklerini ilişkilendirir. Yüzey mekanik işlemlerden bağlamında in situ hücre sinyal faaliyetlerinde Böyle bir düzenle,CAL uyarımı T-hücrelerinin 27 gözlendi. fBFP çok yönlüdür ve diğer hücrelere başka moleküller aracılık ettiği hücre yapışması ve sinyali çalışmaları için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Sodyum Fosfat Monobazik Monohidrat (NaH2PO4 & boğa; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Fosfat tamponu hazırlama</td></tr><tr><td>Anhy. Sodyum Fosfat Dibazik (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Fosfat tamponu hazırlama</td></tr><tr><td>Sodyum Karbonat (Na2CO<>sub3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Karbonat / bikarbonat tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat (NaHCO3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Karbonat / bikarbonat tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>N2-5% tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>N2-5% tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik (KH2PO 4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>N2-5% tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>N2-5% tampon hazırlama</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Boncuk işlevselleştirme</td></tr><tr><td>Biotin-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>RBC biyotinilasyon</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6261</td><td>RBC ozmolarite ayarı</td></tr><tr><td>Amonyum Hidroksit (NH < alt > 4< / alt >OH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6899</td><td>Cam boncuk silanizasyon</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>Cam boncuk silanizasyon</td></tr><tr><td>%30 Hidrojen Peroksit (H2O2)</td><td>JT Barker</td><td>Jan-86</td><td>Cam boncuk silanizasyonu</td></tr><tr><td>Asetik Asit (Buzul)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Cam boncuk silanizasyonu</td></tr><tr><td>3-Merkaptopropiltrimetoksisilan (MPTMS)</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Cam boncuk işlevselleştirme</td></tr><tr><td>Borosilikat Cam boncuklar</td><td>Distrilab Parçacık Teknolojisi</td><td>9002</td><td>Cam boncuk işlevselleştirme</td></tr><tr><td>Streptavidin ve eksi; Maleimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Cam boncuk işlevselleştirme</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Ligand işlevselleştirici</td></tr><tr><td>Fura2-</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>F-1201</td><td>Hücre içi kalsiyum floresan boya yükleme</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hücre içi kalsiyum floresan boya yükleme</td></tr><tr><td>Kuantibrite PE Boncuklar</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>Yoğunluk kantitasyonu</td></tr><tr><td>Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSR II</td><td>Yoğunluk kantitasyonu</td></tr><tr><td>Kılcal Boru 0.7-1.0 mm x 30 inç</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>Mikropipet yapımı</td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>sutter aleti</td><td>P-97</td><td>Mikropipet yapımı</td></tr><tr><td>Pipet mikrokuvvet</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Mikropipet yapımı</td></tr><tr><td>Mineral Yağ</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>Oda montajı</td></tr><tr><td>Mikroskop Kapağı Cam</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Oda montajı</td></tr><tr><td>Mikro enjektör</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>MF34G-5</td><td>Oda montajı</td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>BD&nbsp;</td><td>309602</td><td>odası montajı</td></tr><tr><td>Mikropipet tutucu</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>Oda montajı</td></tr><tr><td>CNC işleme kullanılarak ev tasarımı mekanik parça ve adaptör imalatları.</td><td>Biyofizik Enstrümanı</td><td>Tüm parçalar CAD tasarımlarına göre özelleştirilmiştir.</td><td>BFP sistemi</td></tr><tr><td>Mikroskop (TiE ters çevrilmiş)</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>BFP sistemi</td></tr><tr><td>Objektif CFI Plan Fluor 40x (NA 0,75, WD 0,72 mm, Spg)</td><td>Nikon</td><td>MRH00401</td><td>BFP sistemi</td></tr><tr><td>Fotoğraf Makinesi, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono</td><td>Graftek Görüntüleme</td><td>02-2020C</td><td>BFP sistemi</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Montajlı, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC</td><td>Graftek Görüntüleme</td><td>02-2185A</td><td>BFP sistem</td></tr><tr><td>: Yüksek çözünürlüklü uzaktan kumandalı manuel mikron altı prob kafası</td><td>Karl Suss</td><td>PH400</td><td>BFP sistemi</td></tr><tr><td>Titreşim önleyici masa (5' x 3')</td><td>TMC</td><td>77049089</td><td>BFP sistemi</td></tr><tr><td>3D manuel çeviri aşaması</td><td>Newport</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks 3D CAD yazılımı</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Sürüm 2012 SP5</td><td>BFP sistemi</td></tr><tr><td>LabVIEW yazılımı</td><td>Ulusal Enstrümanlar</td><td>Sürüm 2009</td><td>BFP sistemi, BFP programı</td></tr><tr><td>3D piezo çeviri aşaması</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>BFP sistemi</td></tr><tr><td>Doğrusal piezo aktratör</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>BFP sistemi</td></tr><tr><td>Micromanager yazılımı</td><td></td><td>Sürüm 1.4</td><td>fBFP sistemi, floresan görüntüleme programı</td></tr><tr><td>Çift Kamera (DC-2)</td><td>Fotometri</td><td>77054724</td><td>fBFP sistemi</td></tr><tr><td>Çift Kam emisyon filtresi (T565LPXR)</td><td>Fotometri</td><td>77054725</td><td>fBFP sistemi</td></tr><tr><td>Floresan Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>fBFP sistemi</td></tr><tr><td>Plastik parafin filmi (Parafilm)</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>PM996</td><td>şişe sızdırmazlığı</td></tr><tr><td>Karbonat / bikarbonat tamponu (pH 8.5)</td><td></td><td></td><td>8.4 g/L sodyum karbonat (Na<alt>2</alt>CO<>alt3</alt>), 10.6 g/L sodyum bikarbonat (NaHCO<alt>3</alt>)</td></tr><tr><td>Fosfat tamponu (pH 6.5-6.8)</td><td></td><td></td><td>27.6 g/L NaFosfat monobazik (NaH<alt>2</alt>PO<alt>4</alt> boğa; H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfat dibazik (Na2HPO4)</td></tr><tr><td>N2-5% tampon (pH 7.2)</td><td></td><td></td><td>20.77 g/L potasyum klorür (KCl), 2.38 g/L sodyum klorür (NaCl), 0.13 g/L potasyum fosfat monobazik (KH2PO4), 0.71 g/L anhy. sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4), 9.70 g/L sükroz</td></tr></tbody></table>

floresan biyomembran kuvvet probe: tek hücre üzerinde reseptör-ligand kinetiklerinin eşzamanlı kantitasyonu ve bağlama kaynaklı hücre içi sinyal

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membran reseptör-ligand etkileşimleri, birçok hücresel fonksiyona aracılık eder. Bağlama kinetik ve bu moleküler etkileşimler tarafından tetiklenen aşağı sinyal muhtemelen mekanik ortamda bağlayıcı ve sinyal almak yeri etkilenir. Yeni bir çalışmada, mekanik kuvvet ile, antijen tanıma düzenleyen ve T-hücre reseptör (TCR) tetiklenmesi göstermiştir. Bu floresan mikroskobu ile tek-molekül kuvvet spektroskopisi birleştiren yeni geliştirdiğimiz teknoloji ve Vadeli floresan biyomembran kuvvet probu (fBFP), ile mümkün olmuştur. Hassas kuvvet sensörü gibi yüksek hızlı kamera ve gerçek zamanlı görüntüleme izleme teknikleri ultra yumuşak insan kırmızı kan hücresi kullanılarak, fBFP ~ 1 pN (10 -12 N), ~ 3 nm ve ~ 0.5 milisaniye içinde kuvvet, uzaysal ve zamansal çözünürlük. FBFP ile bir tam kuvvet yönetmelik kapsamında tek reseptör-ligand bağlanma kinetiği ve aynı zamanda görüntü tetiklenen bağlayıcı hücre içi cal ölçebilirsinizkalsiyum içeren tek bir canlı hücre sinyal. Bu yeni teknoloji, mekanik düzenleme altında, diğer hücrelerde diğer membran reseptörü-ligand etkileşimini ve sinyal incelemek için kullanılabilir.

BFP tekniği 1995 17 Evans laboratuarı tarafından öncüleridir. Bu picoforce aracı yoğun, bağlayıcıları 16,19,20 ile etkileşen adhezyon molekülleri arasında iki boyutlu kinetiği analiz şekilde, yüzeyler üzerinde hareketsiz protein etkileşimlerini ölçmek için kullanılmıştır 30 moleküler esneklik 21,29 ölçmek ve protein şekilsel 21 değişiklikleri belirlemek için. Için, bir fBFP ilave edilir, karşılık gelen yazılım sistemi (Tablo 1) epi-flores...

Tek bir T lenfositinde kuvvet regülasyonlu tek reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalinin gerçek zamanlı görüntülemesini aynı anda ölçmek için bir teknik açıklıyoruz.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Bu prosedürün genel amacı, reseptör benzeri bağlanmayı eş zamanlı olarak ölçmek ve tek bir hücre üzerindeki bağlanma kaynaklı kalsiyum sinyallemesini gözlemlemektir. Bu işlem, öncelikle biotinlerin izole edilmesi ve insan kırmızı kan hücrelerinin (RBC'lerin) ultra hassas bir kuvvet dönüştürücü olarak kullanılabilmesi için ozmolaritelerinin ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise temizleme, genişletme ve ligand kaplamasını içeren mikro ölçekli cam boncukların fonksiyonelleştirilmesidir.Ardından, hücre içi kalsiyum iyon konsantrasyonunun gözlemlenmesini sağlayan kalsiyum boyası ile T hücreleri izole edilir ve inkübe edilir. Son adım, deney düzeneği için özel olarak gerekli olan deneysel oda içindeki mikro pipetlerin hazırlanmasıdır. Son olarak, bir hücrenin ligand kaplı bir boncuğa adezyonunu göstermek, reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ölçmek ve aynı zamanda hücre içi kalsiyum seviyesini izlemek için floresan biyomembran kuvvet probu veya BFP tekniği kullanılır.Bu teknik, T hücrelerinin mekanik kuvveti androjen tanıma yoluyla nasıl algıladığını anlamak için faydalıdır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, FBIP'in reseptör ligand bağlanma kinetiğini ve hücre içi sinyalleşmeyi eş zamanlı olarak ölçebilmesidir. Bu protokolün zorlayıcı kısımları arasında, doğru çaplarda mikro pep yollarının manuel olarak üretilmesi, mikro PEP'ler ile hücrelerin ve boncukların toplanması ve başlangıçta başarısız olunabilecek kuvvet probunun monte edilmesi yer almaktadır; her ne kadar bu videodaki gösterim için burada bulunamasalar da.Laboratuvarımda yakın zamanda doktora çalışmalarını tamamlayan ortak yazar Arnold G, FBAP protokolünün başlangıç fabrikasyon doğrulamasına önemli katkılarda bulunmuştur. Bir parmak deliğinden 8 ila 10 µL kan alın ve bir mL karbonat bikarbonat tamponuna ekleyin; karışımı vorteksleyin veya pipetleyin ve 900 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Karbonat bikarbonat tamponu ile işlemi gerçekleştirmeden önce süpernatantı atın. Bir kez daha yıkayın.Ardından, elde edilen RBC paketinden 10 µL, 171 µL karbonat bikarbonat tamponu ve 1049 µL biotin PEG NHS bağlayıcı çözeltisini karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha önceki yıkama prosedürlerini kullanarak, elde edilen RBC karışımını önce bir kez karbonat bikarbonat tamponuyla, ardından iki kez %5 N two tamponuyla yıkayın.Ardından Nystatin'i N two 5%buffer içerisinde dilüe edin. Mililitre başına 40 microliters nihai konsantrasyon elde etmek için, beş microliters biotinillenmiş RBC'yi 71.4 microliters Nystatin çözeltisi ile karıştırın ve sıfır degrees Celsius'ta bir saat boyunca inkübe edin. Son olarak, örnekleri iki kez N two 5%buffer ile yıkayın ve biotinillenmiş RBC'leri N two 5%buffer artı 0.5%BSA içerisinde buzdolabında saklayın; mikro pipet çekicisine bir adet üç inch mikro pipet yerleştirin.Makine tarafından kılcal borunun ortasının ısıtılması ve iki ucundan çekilerek keskin uçlu iki kılcal borunun, yani ham pipetlerin oluşturulması için çekme düğmesine tıklayın. Ardından, ham bir pipeti mikro pipet dövme cihazının pipet tutucusuna yerleştirin; cam küreyi eritmek için dövme cihazını ısıtın. Ham pipetin ucunu cam kürenin içine yerleştirin.Cam küreyi soğutun ve ham pipeti dışarıdan kırarak çekin, ucunun kürenin içinde kalmasını sağlayın. Hücre haznesini oluşturmak için istenen uç açıklığı elde edilene kadar bu işlemi tekrarlayın; önce bir cam kesici kullanarak 40 mm x 22 mm x 0,2 mm boyutlarındaki lamel camı, 40 mm x 11 mm x 0,2 mm boyutlarında iki parçaya kesin. Hücre haznesi, iki adet metal kare parça ve bunları birbirine bağlayan bir tutmacı içeren el yapımı bir hazne tutucu temeli üzerine kurulur.Bir lameli, iki metal kareyi köprüleyecek şekilde, uygun bir yapıştırıcı ile hazne tutucunun alt tarafına yapıştırın. Benzer şekilde, diğer lameli de üst tarafa yapıştırarak paralel bir lamel hücre haznesi oluşturun. Ardından, pipet kullanarak iki lamel arasına 200 µL deney tamponu enjekte edin.Tampon çözeltinin her iki lam üzerine yapıştığından emin olun. Tamponun haznenin her iki ucuna temas etmesi için hazneyi hafifçe döndürün ve sallayın. Ardından, deneysel tampon bölgesinin her iki yanına, tamponu açık havadan izole ederek sızdırmazlığı sağlayacak şekilde dikkatlice mineral yağ enjekte edin.Prob. Beads süspansiyonlarını, tampon bölgesinin üst, orta ve alt bölgelerine sırasıyla bcs ve hedefleri enjekte edin. BFP deneyine başlamak için mikroskobu ve ışık kaynağını açın.Hazneyi ana mikroskop tablasına yerleştirin. Bir sonraki adım, BFP'nin üç mikro pipetini de kurmaktır. Soldaki prob, bir RBC yakalamak içindir.Sağdaki hedef hücreyi yakalamak içindir ve sağ alttaki yardımcı ise yerleştirilecek bir boncuğu yakalamaya yarar; deneysel tamponla bir mikro pipeti doldurmak için bir mikro enjektör kullanın. Mikro pipeti pipet tutucudan çıkarın ve sıvının uçtan damlamasına izin vermek için onu daha alt bir konumda tutun. Mikro pipete hava kabarcığı girmediğinden emin olarak, mikro pipeti hızla tutucu uca yerleştirin.Yerleştirme sırasında tutucu vidayı sıkın, ardından her bir pipet tutucuyu ilgili mikro manipülatörüne monte edin. Mikro pipetleri, uçları oda tampon bölgesine girecek şekilde odaya doğru itin. Mikro pipetlerin konumunu ayarlayın ve onları mikroskop görüş alanı altında bulun.Üç elementin kolonilerini bulmak için hazne tutucu tablasını hareket ettirin. Manipülatörlerin düğmelerini çevirerek her bir mikro pipetin konumunu sırayla ayarlayın, mikro pipet ucunun bir hücreye veya boncuğa yaklaşmasını sağlayın ve ardından hücreyi veya boncuğu aspire edin. İlgili mikro pipetlerin içindeki basıncı ayarlayarak, üç mikro pipetin de ilgili elementleri yakalamasını sağlayın.Deneyin gerçekleştirileceği, enjekte edilen element kolonilerinin uzağında açık bir alan bulmak için hazne tutucu sahnesini hareket ettirin. Bilgisayar programındaki görüntüyü görselleştirmek için mikroskobun görsel moduna geçin. Pipet uçlarındaki üç elementin tamamını programın görüş alanına getirin.Ardından, prob boncuğunu ve RBC'yi hizalayın ve prob boncuğunu dikkatlice RBC'nin apeksine doğru yönlendirin. Şimdi boncuğu kısaca RBC'ye değdirin ve nazikçe geri çekin, boncuğun RBC apeksine yapışık kalması için yardımcı mikropipetin basıncını boncuğu hafifçe üfleyip uzaklaştıracak şekilde ayarlayın. Yardımcı pipeti uzaklaştırın ve hedef ile prob boncuğunu program üzerinde hizalayın.Görüntü alanı penceresinde, prob mikro pipetinin, RBC'nin ve RBC ile prob boncuğu arasındaki dairesel temas alanının ilgili yarıçaplarını ölçmek için program araçlarını kullanın. Bu değerler, metin protokolünde listelenen denklem aracılığıyla RBC'nin yay sabitinin tahmin edilmesine olanak tanır. İstenen RBC yay sabitini programa girdikten sonra, RBC tepe noktası boyunca yatay bir çizgi çizin; bu işlem, yan pencerede her bir pikselin parlaklığını belirten bir eğri oluşturacaktır.Bu hat boyunca, eşik hattını eğrinin derinliğinin yaklaşık yarısına gelecek şekilde sürükleyin. Ardından; termal fluktuasyon analizi, adhezyon frekansı analizi veya kuvvet klemp analizi arasından istenen deney modunu seçin. Parametreleri isteğinize göre ayarlayın.Programın hedef pipeti hareket ettirmesine ve hedefi prob ile temas ettirip ayırmasına olanak tanıyan başlat düğmesine tıklayın; bu sırada prob boncuğunun konumunu gerçek zamanlı olarak kaydeden paralel veri toplama işlemi gerçekleştirilecektir. Deneyi durdur düğmesine tıklayarak programı durdurun, bu işlemle birlikte bir pencere açılacaktır. Elde edilen verilerin kaydedilebilmesi için, ayrı bir program tarafından kontrol edilen BFP sisteminin floresan fonksiyonunu kullanmak üzere eksitasyon ışık kaynağını ve floresan kamerayı açın.Ardından, kazanç pozlaması ve eksitasyon kanalları dahil olmak üzere floresan görüntüleme için parametreleri seçin. Probu ve hedefi, 340 nanometre veya 380 nanometre eksitasyon ışığı ile uyarılan hedef hücrenin canlı floresan görüntüsünün görselleştirilmesine olanak sağlayacak şekilde hizalamak da dahil olmak üzere, BFP deney protokolündeki tüm hazırlıkları takip edin. Hücrenin tüm kayıt süresi boyunca kalacağı alanı yaklaşık olarak belirlemek için kesitleme aracını kullanın.Ardından, aynı anda kayıt ve tıklamaya başlama düğmelerine tıklayın. Kayıt işlemi, 340 nanometre ve 380 nanometre ışığın hücre içi floresan boyasını sırayla uyarmasını sağlar. Birbiriyle eşleşen bir çift floresan görüntü, yaklaşık her saniyede bir olacak şekilde sırayla kaydedilecektir.Başlat'a tıklandığında, moleküler etkileşim analizi için BFP deneyi ile hücre içi kalsiyum sinyalizasyonunu izlemek için floresan görüntüleme deneyi başlar; verileri analiz etmek için metin protokolünde açıklanan adımları takip edin. Zaman-kuvvet ham veri eğrilerinde kuvvet, prob boncuğunun konumundaki değişikliğin izlenmesinden elde edilir. Adezyon gerçekleşmeyen bir olayda, hedef hücre boncuk yüzeyinden uzaklaştırıldıktan sonra, kuvvet ters zaman sinyalinde kuvvet sıfıra dönecektir.Aksine, bir kopma kuvveti olayında adezyon, geri çekilme sırasında kuvvetin pozitif bir seviyeye hızla yükselmesi ve ardından hızla sıfıra düşmesiyle kendini gösterir. Bir ömür olayıda, pozitif kuvvet bir plato oluşturacak şekilde sabitlenir. Platonun uzunluğu, ömür süresini ifade eder.Tekrarlanan VFP deney döngüleri ile bir kuvvet-zaman eğrisi elde edilecektir. Burada, 340 nanometre ve 380 nanometre ışık kanalları ile uyarılmış, yüklenmiş birkaç veya iki T-hücresinin floresan görüntüleri gösterilmektedir. Her iki görüntü de hücrenin net konturlarını göstermekte ve bu da hücrenin iyi boyandığını belirtmektedir. Bağlanma kinetiği verileri ve floresan verileri bir T hücresinden elde edildikten sonra, aralarındaki korelasyonu bulmak için hem kümülatif yaşam süresi eğrisi hem de kalsiyum seviyesi eğrisi aynı şekilde sunulmuştur.Artık A-F-B-I-P deneyinin nasıl gerçekleştirileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedür sırasında; mikro pipetin çapı, kauçuk hücre projeksiyonunun uzunluğu ve boncuğun konumu gibi kuvvet probunda herhangi bir kusur olup olmadığını kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.Tüm bunlar kuvvet ölçümünün doğruluğunu etkileyecektir. Bu teknik, moleküler mekanik biyoloji alanındaki araştırmacıların, olası tüm biyolojik sistemlerde mekanik transdüksiyon mekanizmasını incelemelerinin önünü açmaktadır.

fluorescence-biomembrane-force-probe-concurrent-quantitation-receptor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Bu video, hücre-hücre temaslarında hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi tespit etmek için floresan dalgalanma spektroskopisinin kullanımını göstermektedir. Bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgilenilen transmembran yapışma reseptörünü eksprese ederek ve spektral olarak ayrılmış iki floresan etiketi barındıran iki farklı hücre popülasyonunu karıştırarak, farklı renkli floresan ile iki komşu hücrenin reseptörleri arasındaki trans-etkileşim, floresan yoğunluğundaki dalgalanmalardaki...

Hücre Temaslarında Protein Etkileşimini İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Bu videoda, reseptörler ve ligandlar arasındaki kuvvetleri ölçmek için biyomembran kuvvet probları (BFP'ler) kullanılmıştır. Bu teknik, prob boncukları üzerinde konjuge edilen pMHC ile hedef hücreler üzerindeki TCR'ler arasındaki bağları kırmak için gereken basıncı izleyerek etkileşimleri tespit edebilir.

Reseptör-ligand etkileşimlerini ölçmek için biyomembran kuvvet probu

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Burada, proteinlerin hücre zarları veya mikro-parçacıklarla etkileşimini karakterize etmek için bir dizi yöntem açıklıyoruz.

Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi

Öğrenin, tek bir T lenfositinde reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalini eşzamanlı olarak ölçmek için floresan biyomembran kuvvet probu tekniğini. Bu yöntem, T hücre aktivasyon mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araç sunar.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal (Video) | JoVE Journal

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Daha fazla video keşfet