Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Bu prosedürün genel amacı, reseptör benzeri ve bağlanmayı aynı anda ölçmek ve tek bir hücre üzerinde bağlanmaya bağlı kalsiyum sinyalini gözlemlemektir. Bu, önce biyotinin izole edilmesi ve insan kırmızı kan hücrelerinin veya RBC'lerin ozmolaritesinin ultra hassas bir kuvvet dönüştürücü olarak kullanılması için ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, temizleme, dilatasyon ve ligand kaplamayı içeren mikro ölçekli cam boncukları işlevselleştirmektir.

Daha sonra, T hücreleri izole edilir ve daha az 2:00 kalsiyum boyası ile inkübe edilir, bu da hücre içi kalsiyum iyon konsantrasyonunun gözlemlenmesini sağlar. Son aşama ise, deney düzeneği için özel olarak gerekli olan mikro pipetlerin deney odasında hazırlanmasıdır. Sonuç olarak, floresan biyo membran kuvvet probu veya BFP tekniği, bir hücrenin ligand kaplı bir boncuğa yapışmasını göstermek, reseptör ligand bağlanma kinetiğini ölçmek ve bu arada hücre içi kalsiyum seviyesini izlemek için kullanılır.

Bu teknik, mekanik kuvvetin androjen tanıma yoluyla T hücreleri tarafından nasıl algılandığını anlamada yararlıdır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre önemli bir avantajı, FBIP'nin reseptör ligand bağlanma kinetiğini ve hücre içi sinyalleşmeyi aynı anda ölçebilmesidir. Bu protokolün zorlu kısımları arasında doğru çaplarda mikro pep yollarının manuel olarak üretilmesi, mikro PEP'lerle hücrelerin ve arıların toplanması ve ilk başta başarısız olabilen kuvvet probunun montajı yer alıyor, ancak bu videonun gösterimi için burada olamasa da.

Laboratuvarımda doktorasını yakın zamanda tamamlamış olan ortak yazar Arnold G, FBAP protokolünün ilk üretim doğrulamasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Bir parmak deliğinden sekiz ila 10 mikrolitre kan elde edin ve bir mililitre karbonat bikarbonat ekleyin, tampon jet yaprağı girdabını bırakın veya karışımı pipetleyin ve 900 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Bir kez daha yıkayın.

Daha sonra, elde edilen RBC paketinin 10 mikrolitresini 171 mikrolitre karbonat bikarbonat tamponu ve 1049 mikrolitre biotini karıştırın. PEG NHS bağlayıcı çözeltisini ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Elde edilen RBC karışımını daha önce aynı yıkama prosedürlerini kullanarak, bir kez karbonat bikarbonat tamponu ile ve daha sonra iki kez% 5'lik N ile yıkayın.

Daha sonra Nystatin'i N iki% 5'lik tampon halinde seyreltin. Mililitre başına 40 mikrolitrelik bir nihai konsantrasyon elde etmek için, biyotinile edilmiş RBC'nin beş mikrolitresini 71.4 mikrolitre Nystatin çözeltisi ile karıştırın ve sıfır santigrat derecede bir saat inkübe edin. Son olarak, numuneleri N iki adet %5'lik tampon ile iki kez yıkayın ve biyotinile edilmiş RBC'yi N iki %5 tampon artı %0,5 BSA ile buzdolabında saklayın, bir parça üç inçlik mikro pipeti mikro pipet çekicisine monte edin.

Kılcal damarın ortası makine tarafından ısıtılacak ve kılcal damar iki uçtan çekilerek ham pipetler olan keskin uçlu iki kılcal damar yapılacak şekilde çekme düğmesine tıklayın. Ardından, mikro pipetin pipet tutucusuna ham bir pipet monte edin: Forge üzerindeki cam küreyi eritmek için ısıyı dövün. Ham pipetin ucunu cam kürenin içine sokun.

Cam küreyi soğutun ve ham pipeti dışarıdan kırmak için çekin ve ucunu kürenin içinde bırakın. Hücre odasını oluşturmak için istenen uç deliği elde edilene kadar bu işlemi tekrarlayın: önce 40 milimetreye 22 milimetreye 0,2 milimetre kapak kayması olacak şekilde kesin, bir cam kesici kullanarak iki adet 40 milimetre x 11 milimetre x 0,2 milimetre parça halinde kesin. Hücre odası, iki parça metal kareden ve bunları birbirine bağlayan bir tutamaktan oluşan ev yapımı bir oda tutucusunun temeli üzerine inşa edilmiştir.

Grace yapıştırıcısı kullanarak, iki metal kareyi köprüleyecek şekilde hazne tutucunun alt tarafına bir kapak kayması. Benzer şekilde, diğer kapak kızağını üst tarafa yapıştırın, bu da paralel bir kapak kayma hücresi odası oluşturacaktır. Ardından, iki kapak fişi arasına 200 mikrolitre deneysel tampon enjekte etmek için pipeti kullanın.

Tamponun her iki kapak kızağına da takıldığından emin olun. Tamponun haznenin her iki ucuna da temas etmesini sağlamak için hazneyi hafifçe döndürün ve sallayın. Daha sonra, deneysel tampon bölgesini çevreleyen, haznenin her iki tarafına dikkatlice mineral yağ enjekte edin, böylece tamponu açık havadan kapatın.

Prob süspansiyonlarını enjekte edin. Boncuklar, sırasıyla tampon bölgenin üst, orta ve alt bölgelerindeki bc'ler ve hedeflerdir. BFP deneyine başlamak için mikroskobu ve ışık kaynağını açın.

Odayı ana mikroskop tablasına yerleştirin. Bir sonraki adım, BFP'nin üç mikro pipetini de takmaktır. Soldaki sonda bir RBC kapmak içindir.

Sağdaki hedef hücreyi tutmaktır ve sağ alttaki yardımcı, takmak için bir boncuk tutmaya yarar, bir mikro pipeti deneysel tamponla doldurmak için bir mikro enjektör kullanır. Mikro pipeti pipet tutucusundan çıkarın ve sıvının ucundan damlamasını sağlamak için daha düşük bir yerde tutun. Mikro pipeti hızlı bir şekilde tutucu uca yerleştirin ve mikro pipetin içine hava kabarcığı girmediğinden emin olun.

Yerleştirme sırasında tutucu vidayı sıkın, ardından her bir pipet tutucuyu ilgili mikro manipülatöre monte edin. Mikro pipeti, uçları hazne tampon alanına girecek şekilde hazneye doğru itin. Mikro pipetin konumunu ayarlayın ve bunları mikroskop görüş alanı altında bulun.

Üç elementin kolonilerini bulmak için oda tutucu aşamasında hareket edin. Mikro pipetin ucunun bir hücreye veya boncuğa yaklaşmasına izin vermek için manipülatörlerin düğmelerini çevirerek ilgili mikro pipetin konumunu tek tek ayarlayın, hücreyi veya boncuğu aspire edin. İlgili mikro pipetin içindeki basıncı ayarlayarak, üç mikro pipet de karşılık gelen elemanlarını yakalayacaktır.

Deneyin gerçekleştirileceği enjekte edilen elementlerin kolonilerinden uzakta açık bir alan bulmak için oda tutucu aşamasının etrafında hareket edin. Görüntüyü bilgisayar programında görselleştirmek için mikroskop görsel modunu değiştirin. Pipet uçlarındaki üç öğeyi de programın görüş alanına taşıyın.

Ardından, prob boncuğunu ve RBC'yi hizalayın ve prob boncuğunu RBC'nin tepesine kadar dikkatlice manevra yapın. Şimdi boncuğu RBC'ye kısa bir süre çarpın ve yavaşça geri çekin, boncuğu RBC tepesine yapıştırılmış halde kalacak şekilde nazikçe üflemek için yardımcı mikropipetin basıncını ayarlayın. Yardımcı pipeti uzaklaştırın ve hedef ile prob boncuğunu program üzerinde hizalayın.

Görüş alanı penceresinde, prob mikro pipetinin, RBC'nin ve RBC ile prob boncuğu arasındaki dairesel temas alanının ilgili yarıçaplarını ölçmek için program araçlarını kullanın. Bu değerler, metin protokolünde listelenen denklem ile RBC'nin yay sabitinin tahmin edilmesine izin verir. İstenen RBC yay sabitini programa girdikten sonra, RBC tepesi boyunca yatay bir çizgi çizin, bu da bitişik pencerede her pikselin parlaklığını gösteren bir eğri verecektir.

Bu çizgi boyunca, eğrinin derinliğinin yaklaşık yarısı kadar olacak şekilde eşik çizgisini sürükleyin. Ardından, istenen deney modunu, termal dalgalanma testini, yapışma frekansı testini veya kuvvet kelepçesi testini seçin. Parametreleri istediğiniz gibi ayarlayın.

Programın hedef pipeti hareket ettirmesine ve hedefi prob ile temas halinde ve dışarı çıkarmasına izin veren başlat düğmesine tıklayın, veri toplama gerçekleştirilecek ve pro boncuğun konumunu gerçek zamanlı olarak kaydeden paralel olacaktır. Bir pencere açılacak olan deneyi durdur düğmesine tıklayarak programı durdurun. Elde edilen verilerin BFP sisteminin floresan işlevini kullanmak üzere kaydedilmesine izin vermek için, ayrı bir program tarafından kontrol edilen uyarma ışık kaynağını ve floresan kamerayı açın.

Ardından, kazanç pozlama ve uyarma kanalları dahil olmak üzere floresan görüntüleme için parametreleri seçin. 340 nanometre veya 380 nanometre uyarma ışığı tarafından uyarılan hedef hücre canlı floresan görüntüsünün görselleştirilmesine izin vermek için probun ve hedefin hizalanması da dahil olmak üzere BFP deney protokolündeki tüm hazırlıkları izleyin. Tüm kayıt süresi boyunca hücrenin içinde kalacağı alanı kabaca bölümlere ayırmak için bölümleme aracını kullanın.

Ardından, aynı anda kayda tıklayın ve tıklamaya başlayın. Kayıt, 340 nanometre ve 380 nanometre ışığın, hücre içi floresan kalıbını dönüşümlü olarak uyarmasına izin verir. Bir çift karşılık gelen floresan görüntüsü dönüşümlü olarak her saniye yaklaşık bir tane kaydedilecektir.

Başlat'a tıklamak, moleküler etkileşimin analizi için BFP deneyini başlatır ve hücre içi kalsiyum sinyalini izlemek için floresan görüntüleme deneyi, metin protokolünde açıklandığı gibi verileri analiz etmeye devam eder. Zaman kuvveti ham veri eğrilerinde, kuvvet, pro boncuğun konum değişikliğinin izlenmesinden türetilir. Yapışma olmaması durumunda, hedef hücre boncuk yüzeyinden geri çekildikten sonra kuvvet ters zaman sinyalinde kuvvet sıfıra dönecektir.

Tersine, bir kopma kuvveti olayında, yapışma, geri çekme sırasında kuvvetin pozitif bir seviyeye hızlı bir şekilde yükselmesi ve ardından sıfıra hızlı bir düşüş ile kendini gösterecektir. Ömür boyu sürecek bir olayda, bir plato gerçekleştirmek için pozitif kuvvet kenetlenecektir. Yaylanın uzunluğu bir ömürdür.

Tekrarlanan VFP deney döngüleri yürütülerek, bir kuvvete karşı zaman eğrisi türetilecektir. Burada, 340 nanometre ve 380 nanometre ışık kanalları tarafından uyarıldığında birkaç veya iki yüklü T hücresinin floresan görüntüleri gösterilmektedir. Her iki görüntü de hücrenin net konturlarını gösterir, bu da hücrenin iyi boyandığını gösterir Bağlanma kinetik verileri ve floresan verileri bir T hücresinden türetildikten sonra, aralarındaki korelasyonu bulmak için hem kümülatif yaşam süresi eğrisi hem de kalsiyum seviyesi eğrisi aynı şekilde sunulur.

Artık A-F-B-I-P deneyinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedür sırasında. Kuvvet probasında mikro pipetin çapı, kauçuk hücre çıkıntısının uzunluğu ve boncuğun konumu gibi herhangi bir kusur olup olmadığını kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.

Bütün bunlar kuvvet ölçümünün doğruluğunu etkileyecektir. Bu teknik, moleküler mekanik biyoloji alanındaki araştırmacıların olası tüm biyolojik sistemlerde mekanik iletim mekanizmasını incelemelerinin yolunu açmaktadır.