Name: Enzimatik Biyosensörlerin Kullanımı Endojen ATP veya H belirlememize 2 O 2 Böbrek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin enzimatik mikroelektrot biyosensörleri kullanarak böbrek dokusunda ATP ve hidrojen peroksit konsantrasyonlarını gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu protokoller ekz vivo ve in vivo uygulamalar için sensör kalibrasyonu ve cerrahi kurulum adımlarını içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu yazıda kullanılan sensörlerin geliştirilmesi onların çalışmaları için Sarissa Biyomedikal teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Kalp, Akciğer tarafından desteklenen ve Kan Enstitüsü HL108880 (A. Staruschenko) verir, HL 116.264 (A. Cowley) ve HL 122.662 (A. Staruschenko ve A. Cowley), Tıp Koleji tarafından finanse edilen bir proje Wisconsin Araştırma İşleri Komisyonu # 9306830 (O. Palygin) ve Sağlıklı Wisconsin Araştırma ve Eğitim Programı # 9520217 ilerlemek ve Ulusal Böbrek Vakfı Genç Araştırmacı Grant (O. Palygin).

Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu&#39;na uyulması aşağıdaki hayvan prosedürleri. Ön onay Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) elde edilmiştir. NOT: Sensör üreticisi talimatları Deneme tasarımı ve önce kendi kullanımına sırasında yapılmalıdır. Sensörler kullanırken bu talimatları sonrasında optimal sonuçlar üretecektir. 1. Sensör Kalibrasyonu <ol><li> Deneyin başlamasından önce taze stok çözümleri hazırlayın. </li><li> 10 mM NaPi tamponu, 100 mM NaCI, 1 mM MgCI2, ve 2 mM gliserol içeren tampon A oluşturur. NaOH kullanılarak 7.4&#39;e pH ayarlayın. 2-8 ° C&#39;de saklayın. </li><li> -20 ° C&#39;de saklandı stok ATP konsantrasyonu (100 mM) kullanılarak, Tampon A, 90 ul 10 ul stok eklenerek taze 10 mM ATP çözeltisi oluşturmak kalibrasyon </li><li> T içine ucu (Şekil 2) koyarak ATP sensörü rehydrate2-8 ° C&#39;de en az 10 dakika süre ile tampon A içeren da rehidrasyon odası. Not: rehidrasyon sonra, sensörler fazla 20 saniye boyunca havaya maruz kalmamalıdır veya sensör hassasiyeti azaltılabilir. Havaya uzun pozlama beklenen ise, bir gliserol çözeltisi içine kısa bir süre sensörü daldırma. Sensörler birden deneyler için kullanılabilir ancak bu sensör rehidrasyon ile aynı günde gerçekleşmelidir. Sensörler 24 saat için tampon A ile rehidrasyon odası içinde saklanabilir. </li><li> Çift kanallı potentiyostat (Şekil 3) açın ve kayıt sistemi yazılımını başlatmak. </li><li> Tampon A. Place 3 ml kalibrasyon odasına referans elektrodu ile bir kalibrasyon odasını hazırlayın. Daha sonra, rehidrasyon odasından her sensörü alın manipülatör ekleyin ve kalibrasyon odası çözüm içine yerleştirin. NOT: Bir kalibrasyon odası gibi standart silikon kaplı petri kullanın. Tüm kalibrasyonları ve st yürütmekyüksek performanslı laboratuar hava masaya bir Faraday kafesi içinde udies amperometri kayıtları (Şekil 4) sırasında sinyal gürültüsünü azaltmak için. Kalibrasyon mümkün olan en iyi şekilde veri toplama başlangıç ​​yakın yapılır. In vivo uygulamalar için kalibrasyon için en uygun zaman hayvan ameliyat sonrası iyileşme döneminde olduğunu. </li><li> Ex vivo kalibrasyon <ol><li> 10 döngü için 100 mV / sn bir hızda 500 mV -500 mV ile sensörler devirli kalibrasyon odası içinde voltametri gerçekleştirin. Bu büyük ölçüde sensör duyarlılığını arttırır. 10 döngüleri gözlenen izleri Şekil 5&#39;e bakınız. </li><li> Son döngüden sonra 600 mV sensörleri polarize. Sensör akımı bir asimptotuna bozulacaktır. Sabit bir okuma 5 dakikalık bir minimum sonra elde edilir. Sıfır okuma kaydedin. </li></ol></li><li> In vivo sensör kalibrasyonu <ol><li> In vivo senso üzerinde voltametri yapmayınrs. Bunun yerine, mV ila +500 30 saniye için kalibrasyon odasında sensörü polarize. Sonra 0 mV potansiyostatı ayarlamak ve sensör akımı bir asimptotuna yükselmesine izin verin. Sensör akımı asimptotuna en az 2 dakika sürecektir. Sıfır okuma kaydedin. </li></ol></li><li> Ardışık istenen algılama aralığı kapsayan bir kalibrasyon hattı üretmek için odasına ATP çözeltisi set miktarda ekleyebilirsiniz. ATP odasına boyunca eşit dağılır olarak ATP çözüm çürüme tarafından takip başlangıçta sensör sinyali keskin bir tepe üretir. Tutanak sinyal değerleri sinyal seviyesi bir kez. Her ATP ilavesinden sonra Şekil 6A ve 7 izlerini stabilize ve sırasıyla vivo çalışmalar hem ex vivo ve ATP konsantrasyonlarını önerdi. NOT: Bu Analitlerin temizleyiciler kullanılarak elektrotların seçiciliğini onaylamak için önemlidir. Mevcut protokol H &lt;ATP sensör ve katalaz özgünlüğünü test etmek için kullanılır apirazsub&gt; 2 O 2 sinyali (Şekil 6B). Ilaçların tatbik edilecek ise, sensör ile reaktiviteleri ölçümleri çalışma öncesi belirlenmelidir. </li><li> ATP sensörü (sıfır seviyesinin (Şekil 7) azaltmalıdır ATP uygulama tarafından üretilen akım spesifıkliğini test etmede 2 mg / ml (89 BM / mg) olan bir stok apiraz 3 ul ekle. </li><li> (2 O 2 uygulama sıfır okuma azaltmak gerekir H tarafından üretilen akım) null sensörü özgünlüğünü test etmek için 2mg / ml stok (100 UN / mg) katalaz 3 ul ekleyin. </li></ol> Sensör Araştırmalar 2. Hayvan Cerrahisi <ol><li> Ex vivo Cerrahisi <ol><li> Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakım) / tıbbi sınıf O 2 ya da başka bir onaylanmış yöntemle deneysel hayvan anestezisi. 12 Hayvanlar sürekli olarak anestezi yeterli düzeyde sağlanması için izlenmesi gerekir 15 &#39;. Stmümkün solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır. Onaylı IACUC protokollerine göre hayvan Euthanize: Not. Tüm hayatta olmayan prosedürlerin tamamlanmasıyla hayvanın 12 insani ölümünü sağlamak için pnömotoraks uyaran torakotomi ile derinden anestezi hayvanlar euthanize. </li><li> Sırtüstü pozisyonda sıcaklık kontrollü cerrahi masaya sıçan yerleştirin. Uygun bir anestezi derinliği muhafaza edilirken, sol böbrek doğrultusunda yaklaşık 5 sm bir orta hat kesi yapmak ve merkezden uzak karın aortu maruz kalmaktadır. </li><li> Çölyak ve superior mezenterik arterler ve bu arterlerin üzerinde abdominal aorta etrafında bitişik harfleri sarın ama Arter yok. Renal arterlerin altında abdominal aorta etrafında iki bitişik harfler sarın. </li><li> Bitişik harfler üzerinde abdominal aorta Kelepçe. Alt bitişik harfleri bağlayın. Polietilen boru (PE50) ile abdominal aorta kateter. İkinci aort ligature ile kateter sabitleyin. </li><li> Kelepçesini çıkartın ve mezenterik ve çölyak arterler Arter. Böbrek tamamen beyazlatılmış kadar 2-3 dakika süresince oda sıcaklığında Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi ile 6 ml / dk böbrek serpmek. </li><li> Aort kısmını bağlı böbrek ve kateter, tüketim. Banyo çözeltisi ile dolu bir 3 mi Petri kabı içine böbrek yerleştirin. Not: Deney protokolü, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, pH NaOH ile ayarlanmış 7,35: banyo çözeltisi mM içerir. </li></ol></li><li> In vivo cerrahi <ol><li> Onaylı IACUC protokolleri kullanarak sıçan anestezisi. In vivo analiz için ketamin sıçanlar (20 mg / kg im), Inactin (50 mg / kg ip) anestezi. Hayvanlar sürekli olarak anestezi yeterli düzeyde sağlanması için izlenmesi gerekir. Kararlı bir solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır. </li><li> Uygun anestezi derinliği elde sonraed, hava tablo üzerinde bulunan sıcaklık kontrollü bir topraklanmış bir yüzey üzerine sırt üstü yatırıldı sıçan yerleştirin. Yüzey önceden ısıtılmış ve 36 ° C &#39;de muhafaza edilmesi gerekir. </li><li> Uygun anestezi derinliği korurken, böbrek doğrultusunda ensizyon yaklaşık 5 cm olun. </li><li> Saptırmak ve tüm böbrek görünür şekilde deri ve deri altı doku demirlemek bir sütür kullanın. Herhangi bir hareket eserler en aza indirmek için bir böbrek fincan böbrek yerleştirin. </li><li> Kan hacmi muhafaza etmek için, jugularis damarından 1 ml / 100 g / saatlik bir% 0.9 NaCl,% 2 BSA, bir IV infüzyonu kullanın. İdrar toplama hem üreterler cannulate. Yer superior mezenterik ve çölyak arterler etrafında bağlar ve böbrek perfüzyon basıncı (Şekil 10A) manipülasyonu için uzak aortal. </li><li> Farmakolojik ajanların uygulanması in vivo deneyler sırasında gerekli ise, bir geçiş kateter yerleştirilmesi (Şekil 10B önerilir </strong&gt;). </li></ol></li></ol> 3. Veri Toplama Ayarları <ol><li> Veri toplama programını açın ve her iki ex vivo ve Anodik Pozitif in vivo deneylerde kendi polarite ayarlayın. ASCII kodu olarak verileri kaydetmek için programı ayarlayabilirsiniz. </li><li> Böbreklerin sensörler hızlı yerleştirilmesi için mikromanipülatörler yerleştirin. NOT: Alternatif olarak, sensörlerin istenen yerleşim ulaşmanıza yardımcı olmak için mikromanipülatör bağlı bir kukla prob kullanın. </li><li> Ex vivo veri toplama <ol><li> / Dakika 650 ul sabit bir oranda kanül yoluyla aort (2.1.6) banyo çözeltisi ile böbrek serpmek. Cerrahi makas kullanarak dikkatlice sensör yerleştirilmesi için gerekli olan böbrek kapsülü, kaldırın. </li><li> Lastik bantlar böbrek üzerinde sarılı ve iğnelerle silikon kaplı çanak bağlı olan böbrek sabitleyin. </li><li> Ucu batık ile petri böbrek yakın referans elektrot yerleştirintampon çözeltisi. </li></ol></li><li> In vivo veri toplama <ol><li> Bir böbrek fincan böbrek yerleştirin. Hayvanın soyu ve yaşına bağlı olarak. Gevşek böbreği tutan bardak bir boyutunu kullanmak 8 görünen programları böbrek bardak iki boyutları Şekil. Benzer bardak gibi micropuncture vs 16 böbrek işlevinin analiz odaklı farklı fizyolojik yaklaşımlar kullanılmaktadır. Böbrek fincan pozisyon hayvan nefes tarafından üretilen mekanik gürültü çıkarmak için çok önemlidir, ancak müdahale veya böbrek perfüzyon veya idrar akışını engellemeyin olmalıdır: Not. </li><li> Veri toplama gerçekleştirmeden önce iyileşme süresi 45 dakika bekleyin. </li><li> Bir 26-30G iğne kullanarak, böbrek sensörün istenen konuma ve derinlikte bir delik delme. Dönen kanı temizlemek için yüzey delik kurulayın. Böbrek yüzeyine bir gliserol çözeltisini ekleyin. Bu deney sırasında kurumasını böbrek yüzeyini önleyecektir. </li&gt; <li> Rehidrasyon odasından, ilk sensörünü çıkarın ve mikromanipülatör eklemek. Çabuk, 20 saniye içinde, böbrekte taze oluşturulan deliğe elektrot yerleştirin. Yineleyin boş sensör için 3,5-3,9 adımları. </li><li> Sensörlerden gelen gelen böbrek içine yaklaşık 1 cm referans elektrot yerleştirin. </li></ol></li><li> Potentiyostat açın ve bilgisayara kayıt programı etkinleştirin. 9 ex vivo böbrek veri toplama son kurulumunu göstermektedir. 10 eklenen bir kateter ile in vivo böbrek veri toplama son kurulumunu göstermektedir. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Menşe veya başka bir benzer yazılım içine ASCII veri dosyasını içe aktarın. </li><li> Konsantrasyon geçerli ilişki <ol><li> Geçerli bir lineer konsantrasyon (x- ekseni) oluşturmak için ATP veya H 2 (y -Axis) ilişki lineer uyum / tahmin etmek işlevini kullanın </sub&gt; O 2 kalibrasyon noktası (Şekil 6 ve 7). doğrusal fit satır: y = mx + b </li></ol></li><li> Konsantrasyona akımı Equate </li><li> Hücre içi ATP tarafından üretilen gerçek akımı elde etmek için ATP sensörünün olanlardan boş sensörünün ölçülen izleri çıkarın. </li><li> 4.2.1 detaylı kalibrasyon denklem kullanılarak nM&#39;ye amperometri ile elde edilen pA ATP değerleri dönüştürür. &quot;X&quot; değeri her bir düzeltilmiş akımı ithal ve y (analitin konsantrasyonu) için çözerek ATP sensörünün çıkarılır veri izi konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> Gerekirse Benzer şekilde, kalibrasyon denklemi H 2 O 2 konsantrasyonu hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>Palygin, O., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+substances+with+enzymatic+microelectrode+biosensors+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).</li>
<li>Clark, L. C., Lyons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+systems+for+continuous+monitoring+in+cardiovascular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.</a> Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).</li>
<li>Haruyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+nanobiotechnology+for+biosensing+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).</li>
<li>Huckstepp, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+hemichannel-mediated+CO2-dependent+release+of+ATP+in+the+medulla+oblongata+contributes+to+central+respiratory+chemosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity.</a> J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).</li>
<li>Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+contribution+of+ATP+P2+receptors+to+electrically-evoked+electrographic+seizure+activity+in+hippocampal+slices%3A+Evidence+from+purine+biosensors+and+P2+receptor+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists.</a> Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).</li>
<li>Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-dependent+inhibition+of+dopamine+release+in+striatum+is+mediated+by+a+new+diffusible+messenger%2C+H2O2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2.</a> J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).</li>
<li>Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+mechanistic+dissociation+of+ATP+and+adenosine+release+during+ischaemia+in+the+mammalian+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus.</a> J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).</li>
<li>Lalo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+ATP+from+astrocytes+modulates+phasic+and+tonic+inhibition+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex.</a> PLoS Biol. 12, e1001747(2014).</li>
<li>Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+depolarization+evokes+ATP%2C+adenosine+and+glutamate+release+from+glia+in+rat+hippocampus%3A+a+microelectrode+biosensor+study%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study.</a> Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).</li>
<li>Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signaling+in+hypothalamic+tanycytes%3A+potential+roles+in+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).</li>
<li>Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+ATP+in+the+ventral+medulla+during+hypoxia+in+rats%3A+role+in+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response.</a> J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).</li>
<li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H2O2+release+in+freshly+isolated+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).</li>
<li>Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+sensitivity+of+glucose+sensor+implanted+into+subcutaneous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue.</a> Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).</li>
<li>Wilson, G. S., Gifford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+for+real-time+in+vivo+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors for real-time in vivo measurements.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).</li>
<li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Channel+Analysis+of+TRPC+Channels+in+the+Podocytes+of+Freshly+Isolated+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li>
<li>Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+analysis+of+tubule+function%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo analysis of tubule function.</a> Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+Fundamentals+and+applications+-+Historic+book+now+open+access%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access.</a> Biosens. Bioelectron. 65C, A1(2014).</li>
<li>Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+electrode+biosensors%3A+theory+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biochem+Anal%22%5BJournal%5D)">Enzyme electrode biosensors: theory and applications.</a> Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).</li>
<li>Barlett, P. N., Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+immobilization+of+enzymes+in+electropolymerized+films%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electroanal+Chem%22%5BJournal%5D)">A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films.</a> J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).</li>
<li>Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+microelectrodes+for+choline+and+acetylcholine+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications.</a> Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).</li>
<li>Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+biosensor+for+real-time+measurement+of+ATP+in+biological+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue.</a> Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).</li>
<li>Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-enzyme+microelectrode+sensor+for+detecting+purine+release+from+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system.</a> Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).</li>
<li>Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+biosensor+sensitivity+in+aqueous+and+organic+solvents+using+a+combination+of+poly%28pyrrole-ammonium%29+and+poly%28pyrrole-lactobionamide%29+films+as+host+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electroanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices.</a> J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li>
<li>Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+overflow+in+skeletal+muscle+1A+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles.</a> J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).</li>
<li>Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+interstitial+fluid+ATP+responses+to+arterial+pressure+and+tubuloglomerular+feedback+activation+during+calcium+channel+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).</li>
<li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+renal+perfusion+pressure+on+renal+medullary+hydrogen+peroxide+and+nitric+oxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production.</a> Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).</li>
<li>Khan, A. S., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li>
</ol>

Bu yazının video kaydı için Sensörler Sarissa Biyomedikal Limited (Coventry, İngiltere) tarafından sağlandı.

Mevcut protokoller ATP gelişmiş zamansal ve uzaysal çözünürlüğü sağlamak için geliştirilmiştir ve ex vivo perfüze izole ve in vivo kan perfüze böbrekler için H 2 O 2 sinyal. Protokolleri ve burada kullanılan sensörler arasındaki farklar farmakolojik ajanlar ve fizyolojik çalışmalar biri için uygun veri toplama sağlar. Protokoller 1) sensör kalibrasyonu, 2) cerrahi prosedür, 3) veri toplama kurulumu ve 4) veri analizi oluşmaktadır. Onlar çok deneysel koşullar için analitlerin gerçek zamanlı ö...

(Aynı zamanda mevcut el yazması sensörleri olarak başvurulan) Enzimatik mikroelektrot biyosensör hücre ve dokuları, canlı, dinamik sinyal süreçleri incelemek için değerli bir araç olmuştur. Sensörler biyolojik ilgili konsantrasyonlarda hücre sinyal molekülleri zamansal ve uzaysal çözünürlüğü artmış sağlarlar. Bunun yerine örnekleme ve uzun süre boyunca aralıklarla alınan hücre dışı sıvıların analiz enzimleri analit tepki olarak, bu sensörler, böylece gerçek zamanlı ölçümleri 1,2 üreten, hızlı yanıt verir. Pürin ya da hidrojen peroksit ve bunların serbest bırakılması dinamikleri gibi otokrin ve parakrin faktörler, interstisyel konsantrasyonları hızlı tespiti, normal ve patolojik koşullarda 3 ilaçların etkileri için bir profil oluşturmak için de kullanılabilir. Şu anda, sensörler kullanılarak uygulamalar çoğunluğu beyin dokusu dilimleri ve hücre kültürlerinde 4-10 olmuştur. Bu yazının amacı ayrıntılı protokollerdoğru bütün böbreklerde analitlerin gerçek zamanlı konsantrasyonlarını ölçmek için araçlar kurar. Aşağıdaki protokoller interstisyel ATP ve H böbrekte 2 O 2 sinyal incelemek için geliştirilmiştir. Böbreğin yerli ortamında, hücre dışı ATP hızla türevleri (ADP, AMP ve adenozin) içine endojen ectonucleotidases tarafından katabolize edilir. Burada kullanılan sensör diğer pürin ATP bozunma ürünleri üzerinde 11 ATP&#39;ye son derece seçicidirler. ATP serbest bırakılması ve sinyal fonksiyonu sürekli ve dinamik konsantrasyonlarının doğru izlenmesini sağlayan bu büyük bir avantaj sunuyor. İnterstisyel ATP konsantrasyonu iki Mikroelektronlar kombinasyonu, bir ATP sensörü ve null sensörü kullanılarak ölçülür. Katalaz uygulamaları ile birlikte boş sensör interstisyel H 2 O 2 konsantrasyonu 12 tespit edebiliyor. Aşağıdaki protokoller senso iki farklı tasarımlar kullanınYa ex vivo veya in vivo uygulamalarda optimum özelliklere sahip rs. Her iki tasarım bir sensör enzimatik katmanın içerdiği gliserol kinaz ve gliserol-3-fosfat oksidaz sıralı katalitik reaksiyon dayanır ve ATP mevcudiyetinde tarafından tahrik edilir. Ex vivo çalışmalarda kullanılan sensörlerin grubu, H2O 2, son enzimatik reaksiyon ürünü olarak bir platin / iridyum (Pt-Ir) telidir ilgili oksidasyonu ile tespit edilir. In vivo çalışmalar için sensörler yerine, kan ile perfüze doku için tasarlanmış bir mediatör kaplı altın elektrot üzerinde 2 O 2 redüksiyon H dayanmaktadır. Bu yazıda anlatılan her iki protokol şeması Şekil 1&#39;de gösterilmektedir. Bu bağlanmış enzimler yoksun hariç boş sensör karşılık gelen ATP sensörü ile aynıdır. Bu nedenle, katalaz enzimi ile H2O 2 saptanmasına ek olarak, sıfır sensör meaSures nonspesifik müdahaleler. ATP konsantrasyonları Boş nonspesifik müdahaleler ve ATP sensörü sinyali arka plan H 2 O 2 algılandı çıkarılmasıyla hesaplanır. Çeşitli sensörleri ayrıca karşılık gelen Null ile eşleştirilmiş in vivo adenozin ionosine, hipoksantin, asetilkolin, kolin, glutamat, glikoz, laktat, ex vivo uygulamalar ya da adenozin ionosine d-serin ve hipoksantin gibi diğer analitler tespit etmek için ticari olarak temin edilebilir sensörü. Doğru analitlerin tespit sensörün yeteneği düzgün öncesi ve sonrası kalibrasyon 13 bağlıdır. Bu analiz, biyolojik dokularda kullanım sırasında meydana sensör hassasiyeti sürüklenme hesapları sağlar. Sensör sensör enzimatik reaksiyonlarda reaktif madde olarak kullanılan bir gliserol depo tutar. Sensör gliserol içeren banyo çözümlerinde kullanılan değilse, zamanla yıkayın olacaktır. Shorter rayıt kez o zaman sensör kayması en aza indirmek için gereklidir. Ayrıca büyük sensörlerin 14 duyarlılığını azaltabilir endojen proteazlar ve protein parçaları ile kirlenme sensör. Mevcut elyazması ex vivo ve in vivo böbrek hazırlıklarında enzimatik mikroelektrot biyosensörler kullanımını kurar. Gerçek zamanlı analit ölçümü böbrek hastalıkları ve farmakolojik ajanların mekanizmalarına yeni bakış açıları ortaya çıkarabilir hücresel sinyal görülmemiş ayrıntı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Sensör Kiti</td><td>Sarissa Biyomedikal</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>Kit, saklama şişesi, rehidrasyon odası, elektrot uçları ve referans elektrotları içerir. Kite ayrıca kullanıcının sensör seçimi de dahildir.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biyosensör 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biyomedikal</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>, kullanmadan önce 2-8 oC'de saklayın</td>,</tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &mu; m</td><td>Sarissa</td><td>Biyomedikal SGS-ATP-10-50</td>, Sarissaprobe boş sensörü 125 <td>&>yu kullanmadan önce 2-8 o</supC'de saklayın</td></tr><tr><td>; m</td><td>Sarissa Biyomedikal</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>, kullanmadan önce 2-8 oC'de saklayın</td></tr>, <tr><td>Sarissagold boş sensör 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biyomedikal</td><td>SGS-NUL-10-50</td>, <td>kullanmadan önce 2-8 oC'de saklayın</td></tr>, <tr><td>Sarissaprobe ATP Kılavuzu</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td></tr><tr><td>Faraday kafesi&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift kanallı potansiyostat</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Tip II Faraday kafesi</td></tr><tr><td>Veri toplama programı</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon pompası</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Model R99E</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optik aydınlatıcı</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipülatör</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipülatör manyetik stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>hava tablası</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>izofluran ventilatör</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>iğnesi</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>pimler</td><td></td><td></td><td>Standart diseksiyon pimleri</td></tr><tr><td>kateter</td><td></td><td></td><td>Polietilen boru (PE50)</td></tr> <tr><td>kateter doku yapıştırıcısı</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>sütür</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>lastik bantlar</td><td></td><td></td><td>herhangi bir 2-4 mm genişliğinde lastik bantlar</td></tr><tr><td>silikon</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Şeffaf 1 #</td><td></td></tr> <tr><td>kelepçe</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>standart diseksiyon kiti</td><td></td><td></td><td>kiti neşter ve diseksiyon sissorlarını içermelidir&nbsp;</td></tr><tr><td>Böbrek Kupası</td><td></td><td></td><td>Kendi tasarım</td></tr><tr><td>standart kimyasalları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP çözeltisi</td></tr><tr><td>hidrojen peroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inaktin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>ketamin</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

enzimatik biyosensörlerin kullanımı endojen atp veya h belirlememize<sub&gt; 2</sub&gt; o<sub&gt; 2</sub&gt; böbrek

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzimatik mikroelektrot biyosensörler yaygın gerçek zamanlı olarak hücre dışı sinyal ölçmek için kullanılmıştır. Bunların kullanımı çoğu Beyin dilimleri ve nöronal hücre kültürleri ile sınırlı olmuştur. Son zamanlarda, bu teknoloji, bütün organlara uygulanmıştır. Sensör tasarımı gelişmeler kan ile perfüze vivo böbreklerde hücre sinyallemesinin ölçüm mümkün kılmıştır. Mevcut protokoller sıçan böbrek interstisyumda ATP ve H 2 O 2 sinyalizasyon ölçmek için gereken adımları listeler. İki ayrı bir sensör tasarımları ex vivo ve in vivo protokoller kullanılır. Sensörün Her iki tür de hızlı bir yanıt, duyarlı ve seçici biyosensörler vermek üzere bir seçici geçirgenliğe tabakanın üzerine ince bir enzimatik biolayer ile kaplanır. Seçici geçirgenliğe tabakası biyolojik dokuda interferents sinyal korur ve enzimatik tabakanın gliserol kinaz ve gliserol-3-Phos sıralı katalitik reaksiyon kullanırATP varlığında phate oksidaz H2O 2 üretmek. Ex vivo çalışmalar için kullanılan sensörler grubu ayrıca bir platin / iridyum (Pt-Ir) telidir ilgili H2O 2 oksidasyonu ile analiti tespit edildi. In vivo çalışmalar için sensörler yerine, kan ile perfüze doku için tasarlanmış bir mediatör kaplı altın elektrot üzerinde H2O 2 indirgenmesi dayanmaktadır. Nihai konsantrasyon değişiklikleri analit bilinen konsantrasyonlarına kalibrasyon ardından gerçek zamanlı amperometri ile tespit edilir. Buna ek olarak, amperometrik sinyalin spesifıkliği O 2 ve ATP buna H2 parçalayan örneğin katalaz gibi enzimler ve apiraz ilavesiyle kontrol edilebilir. Bu sensörler ayrıca önce ve her bir deney sonrasında doğru kalibrasyon temeline dayanmaktadır. Aşağıdaki iki protokol ATP ve H2 Gerçek zamanlı saptama çalışma oluşturulmasıBöbrek dokularında O 2, ve daha fazla başka biyolojik karışımların veya bütün organlarda kullanım için tarif edilen yöntem genişletmek için değiştirilebilir.

Enzimatik mikroelektrot biyosensör tasarımı bütün böbreklerde analitlerin gerçek zamanlı algılanmasını sağlar. Her iki ex vivo veya in vivo çalışmalar genel deney tasarımı kullanılan Şekil 1 hayranlarıyla sensörleri gösterilmiştir ve cerrahi işlemler çalışmaya bağlı olarak farklılık ex vivo veya in vivo olduğu. Tekrarlanabilir sonuçlar, doğru öncesi ve sonrası kalibrasyon elde etmek olan kritik. Şekil 6A kalibrasyonları sı...

Enzimatik mikroelektrot biyosensörleri, biyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda hücre dışı hücre sinyalizasyonunun gerçek zamanlı ölçümlerini sağlar. Aşağıdaki protokoller, biyosensörlerin uygulamalarını böbrekte ATP ve H2O2'nin ex vivo ve in vivo tespitine kadar genişletir.

Enzimatik Biyosensörlerin Kullanımı Endojen ATP veya H belirlememize<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; Böbrek

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Bu prosedürlerin genel amacı, bütün böbreklerde bir TP ve hidrojen peroksitin gerçek zamanlı endojen interstisyel konsantrasyonlarını ölçmektir. Bu, öncelikle sensörlerin ex vivo ve in vivo uygulamalar için bilinen TP ve hidrojen peroksit konsantrasyonlarına göre yeniden hidratasyonu ve kalibrasyonu ile gerçekleştirilir. Ex vivo sensör yerleşimi için böbrek, cerrahi olarak instrumente edilmiş ve kandan temizlenmiştir.Bu işlem, böbreğin aorta üzerinden yıkanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından sıçan böbreği cerrahi olarak izole edilir, bir kayıt odasına yerleştirilir ve salin ile perfüze edilir. İn vivo prosedür için ex vivo sensörler kullanılarak TP ve hidrojen peroksit ölçümleri yapılır.Kanla perfüze edilen böbreğin görüntülenmesini sağlamak için bir insizyon yapılır. Böbrek, staleness still kapağına yerleştirilir ve ilaç uygulamaları için bir interstisyel kateter takılabilir. Ayrıca, in vivo sensörler kullanılarak renal interstisyel ATP ve hidrojen peroksit konsantrasyonları ölçülür.Nihayetinde, bu protokoller böbrek interstisyumunda gerçek zamanlı TP ve hidrojen peroksit ölçümleri için enzimatik mikro elektrot biyosensörlerin kullanımını kolaylaştırır. Enzimatik biyosensörlerin temel avantajı, biyolojik dokulardaki endojen interstisyel konsantrasyonları doğrudan ölçebilme yetenekleridir. Burada bu teknoloji, izole selin perfüze böbreğin interstisyumunda veya in vivo ortamda TP ve hidrojen peroksit konsantrasyonlarını tespit etmek için kullanılır.Enzimatik biyosensörlerin hassasiyeti, hücre dışı ATP veya hidrojen peroksit konsantrasyonlarının bazal ve dinamik düzenlemelerinin gerçek zamanlı ölçümlerine olanak tanır. Bu ölçümler, fonksiyonel olarak farklı böbrek bölgeleri için ilaç uygulaması veya hastalık profilleri oluşturabilir. Hem ATP hem de null sensörlerin uçlarını, iki ila sekiz derece santigrat sıcaklıkta, en az 10 dakika boyunca tampon A içeren ayrı rehidrasyon odalarına yerleştirerek rehidrate edin.Çift kanallı POTENTIA stat cihazını açın ve kayıt sistemi yazılımını başlatın. Programı verileri A-S-C-I-I kodu olarak kaydedecek şekilde ve sensör polaritesini anodik pozitif olarak ayarlayın. Üç mililitre tampon çözelti ile bir kalibrasyon hücresi hazırlayın ve referans elektrodu hücrenin içine daldırın.Her bir sensörü rehidrasyon işleminden çıkarın. Sensörleri mikro manipülatörlere bağlayın ve kalibrasyon odası çözeltisine yerleştirin. Sinyal gürültüsünü azaltmak için tüm kalibrasyonları ve çalışmaları, yüksek performanslı bir laboratuvar hava tablası üzerinde, bir Faraday kafesi içinde gerçekleştirin.Pirometri kayıtları sırasında, kalibrasyon odasındaki ex vivo sensörler için döngüsel voltaj telemetrisi gerçekleştirin. Sensörleri saniyede 100 milivolt hızla -500 milivolttan +500 milivolta 10 döngü boyunca getirerek, sensörlerin hassasiyetini büyük ölçüde artırın ve sensörleri +600 milivoltta polarize edin.Son döngüden sonra, sensör akımı bir bazal seviyeye düşecektir. Beş dakikalık minimum bir sürenin ardından çalışma okuması elde edilir. Sıfır okumasını kaydedin ve ATP sensörünün istenen tespit aralığını kapsayan bir kalibrasyon hattı oluşturmak için hazneye art arda belirlenmiş miktarlarda ATP çözeltisi ekleyin.A TP çözeltisi, başlangıçta sensör sinyalinde keskin bir pik oluşturacak, ardından A TP oda boyunca eşit şekilde difüze oldukça bir azalma meydana gelecektir. Sinyal değerleri, sinyal seviyesi stabilize olduktan sonra kaydedilmelidir. A TP sensörünün özgüllüğünü test etmek için, her A TP ilavesinde, 2 mg/mL'lik bir stoktan 3 µL ekleyin.Bir TP uygulamasının ürettiği akım sıfır seviyesine düşmelidir; tespit aralığını kapsayan bir kalibrasyon çizgisi oluşturmak için hazneye ardışık olarak belirlenmiş miktarlarda hidrojen peroksit çözeltisi eklenmeli ve sinyal seviyesi stabilize olduğunda null sensör sinyal değerleri kaydedilmelidir. Null sensörün özgünlüğünü test etmek için her hidrojen peroksit eklemesinde, 2 mg/mL'lik bir stoktan üç µL sığır laktoferrin ekleyin. Ex vivo çalışmalar için hidrojen peroksit uygulamasının ürettiği akım sıfır okumasına düşmelidir.Çölyak ve superior mezenterik arterler ile bu arterlerin üzerindeki abdominal aort çevresine ligatür uygulayın. Ancak renal arterin altındaki abdominal aorta kısmına iki ligatür bağlamayın. Abdominal aortu, renal arterin distalinden, alt kısımdan bağlayın.Aortayı, ligatürün en az bir santimetre üzerinden ve renal arterin altından klempleyin. Abdominal aortayı, en alttaki ligatür ile klemp arasından polietilen tüp ile kateterize edin. Kateteri ikinci aorta ligatürü ile sabitleyin.Klempi çıkarın ve mezenterik arterleri, çölyak arteri ve bu arterlerin üzerindeki aortu ligasyonla bağlayın. Böbrek, oda sıcaklığında Hank dengeli tuz çözeltisi ile tamamen beyazlaşana kadar iki ila üç dakika boyunca dakikada altı mililitre hızla perfüze edilir. Ayrıca, çıkış sıvısının toplanması için renal ven kateterize edilebilir.Sensör yerleşimi için gerekli olan böbrek kapsülünü cerrahi pensler kullanarak dikkatlice çıkarın. Aortanın katetere bağlı kısmı da dahil olmak üzere böbreği eksize edin. Böbreği, banyo solüsyonu ile doldurulmuş üç mililitrelik bir Petri kabına yerleştirin.Böbreği, kanüle edilmiş aorta üzerinden dakikada 650 microliters sabit hızda banyo çözeltisi ile perfüze edin. Böbreği, üzerinden lastikler geçirip silikon kaplı kaba raptiyelerle sabitleyerek yerleştirin. Referans elektrodu, uçları banyo çözeltisine batık olacak şekilde Petri kabı içinde böbreğe yakın bir yere yerleştirin.Sensörlerin böbreğe hızlıca yerleştirilmesi için mikro manipülatörleri konumlandırın. Alternatif olarak, her bir sensör için istenen yerleşimi sağlamak amacıyla her mikro manipülatöre bağlı bir sahte prob kullanın ve bu işlemi 20 saniyeden fazla sürdürmeyin. Sensörü rehidrasyon odasından çıkarın, mikro manipülatöre takın ve sensörü kap banyo solüsyonuna daldırın.Havanın daha uzun süreyle temas etmesi öngörülüyorsa, her maruziyet öncesinde sensörü kısa süreliğine gliserol çözeltisine batırın. Sensörleri potansiyostat ile +600 milivolt değerinde polarize edin ve akımın stabilize olmasını bekleyin. Her bir sensörü böbreğin aynı derinliğine ilerletin.Veri analizini metin protokolüne uygun olarak gerçekleştirin. Enzimatik mikro elektrot biyosensörün tasarımı, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için analitlerin ve bütün böbreklerin gerçek zamanlı tespitine olanak tanır. Hassas ön ve son kalibrasyonlar kritik öneme sahiptir.Bu şekil, bir TP sensörü kalibrasyonu sırasında X pvo, bir TP ve null sensörleri tarafından üretilen sinyalin temsilci bir izini göstermektedir. Kalibrasyon prosedürü, bir TP'nin dinamik değişimlerini hesaplamak için kullanılan doğrusal bir uyum üretir. Null sensörü, banyo çözeltisine bilinen hidrojen peroksit konsantrasyonlarının eklenmesiyle kalibre edilir ve asim ile am parametrik değerleri kaydedilir. Banyo çözeltisine katalizörlerin eklenmesi, akımın hızla azalmasıyla sonuçlanır.In vivo sensör benzer bir iz üretir ancak oksidatif akımlar yerine redüktif akımları tespit eder, bu nedenle akım negatiftir. Kalibrasyon da 0.3 ile 80 micromolar aralığında doğrusal bir uyum sağlar. In vivo sensörün diğer purin ürünlerine kıyasla TP'ye olan özgüllüğü burada gösterilmiştir. Bu şekilde, tuza dirençli ve tuza duyarlı sıçanlardan taze olarak izole edilen böbreklerde anjiyotensin iki ile indüklenen interstisyel endojen hidrojen peroksit konsantrasyon değişiklikleri gösterilmiştir.Anjiyotensin iki, her iki böbrekten de hidrojen peroksitin akut salınımını tetikler. Bununla birlikte, maksimum amplitüdler tuz duyarlı sıçanların böbreklerinde, özellikle yüksek tuzlu diyetle beslendiklerinde önemli ölçüde artmıştır. Bu prosedür uygulanırken, sensör ucunun ve renal korteks yüzeyinin hassas olduğunu ve bu nedenle her ikisine de zarar verilmesinin doğru kayıtları engelleyeceğini unutmamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, endojen maddelerin ve böbrek gibi tüm organların nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, başarılı kayıtlar için gerekli olan kalibrasyonları ve cerrahi prosedürleri doğru bir şekilde gerçekleştirebileceksiniz. Biz bu yöntemi, böbrekteki bazal TP ve hidrojen peroksit seviyelerini ve bunların salınımını incelemek için uyguladık.Buna karşın, uygun sensörler uygulandığında aynı yaklaşım adenozin glutamat, glikoz ve diğer bazı maddelerin konsantrasyonlarını belirlemek için de kullanılabilir.

use-enzymatic-biosensors-to-quantify-endogenous-atp-or-h2o2

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

Xenopus oositlerindeki enzimlerin heterolog ekspresyonu ve atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile tek tek hücrelere Rb+ veya Li+ alımını ölçerek K+-karşı taşıyıcı P-tipi ATPazların aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, karmaşık kinetik çalışmaları kolaylaştıran radyoizotop akı deneylerine hassas ve güvenli bir alternatiftir.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Burada, ATP'ye bağımlı nükleozom kaymasını katalize etme, 2) nükleozom substratlarıyla etkileşime girme ve 3) ATP'yi nükleozom veya DNA'ya bağımlı bir şekilde hidrolize etme yetenekleri için ATP'ye bağımlı kromatin yeniden modelleme enzimlerini karakterize etmek için kullanılabilecek biyokimyasal tahlilleri açıklıyoruz.

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, belirli bir saflaştırılmış ATPaz için aktivite düzeyine ve gereksinimlere göre optimize edilebilir.

ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Proteaz sıkıca düzenlenmiş temel biyolojik süreçlerin ve dysregulated proteaz aktivitesi sürücüler ilerleme kanser gibi karmaşık hastalıkların katılan enzimlerdir. Bu yöntemin hedef ana bilgisayar idrardan algılanabilir ve hastalık ayrımcılık bir bölünme sinyal üreterek proteaz aktivitesi in vivo ölçmek nanosensors oluşturmaktır.

Nanosensors için noninvaziv tanı koyma proteaz aktivitesi Vivo tespit

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz tsay küçük molekül miyozin inhibitörleri yarı yüksek iş lenme taraması için adapte edilmiştir. Bu kinetik teşbit, kuyu başına sadece 20 μL toplam reaksiyon hacmine sahip 384 kuyulu bir mikroplaka formatında çalıştırılır. Platform hemen hemen tüm ADP üreten enzimler için geçerli olmalıdır.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

Fare ön beyninin organotipik dilim kültürlerinde genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör ATeam1.03YEMK'ın hücre tipi spesifik ekspresyonu için bir protokol tanımladık. Ayrıca, nöronlar ve astrositlerde hücresel ATP düzeylerinin dinamik görüntülemeiçin bu sensörünasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

FRET tabanlı Sensör ATeam1.03YEMK kullanılarak Fare Beyninin Organotipik Doku Dilimlerinde Hücre İçi ATP'nin Görüntülenmesi

Proteaz Floresan Algılama Kit Florimetri kullanarak proteaz aktivitesi ölçümü için tasarlanmıştır. Ayrıca eser miktarda proteaz kontaminasyon tespiti için uygundur. Yöntem FITC etiketli kazein substrat özel bir formülasyon proteolitik hydroysis dayanmaktadır.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

Öğrenin enzimatik mikroelektrot biyosensörleri kullanarak böbrek dokusunda ATP ve hidrojen peroksit konsantrasyonlarını gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu protokoller ekz vivo ve in vivo uygulamalar için sensör kalibrasyonu ve cerrahi kurulum adımlarını içerir.

Enzimatik Biyosensörlerin Kullanımı Endojen ATP veya H belirlememize

Daha fazla video keşfet