Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek
September 18th, 2015
Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek.
Bu prosedürün genel amacı, Calot Thal kortikal dilimini dört ana işitsel yapı, inferior kolus, işitsel talamus, talamik retiküler çekirdeğin işitsel kısmı ve işitsel korteks ile hazırlamaktır. Bu, önce beynin fareden çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, dilimleme hazırlığında beyni bloke etmektir.
Daha sonra, Calot thal kortikal bağlantısını içeren dilimler elde etmek için beyni kesin. Son adım, bağlantıyı değerlendirmek için flavoprotein görüntülemeyi kullanmaktır. Sonuç olarak, karotal kortikal bağlantıyı içeren beyin dilimi, orta ve dört beynin işitsel bölgelerinde bilgi işlemeyi daha iyi anlamak için çeşitli deneyler için kullanılabilir Bu yöntemin görsel gösterimi, dilimlemeden önce beyni bloke etme adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için kritik öneme sahiptir, çünkü karmaşık bir çift açılı kesim gerektirir, Bu, sağlam projeksiyonlar elde etmenin anahtarıdır.
Tekniği göstermek, laboratuvarımda bir yüksek lisans öğrencisi olan BJ Slater olacak, Kesme aşamasını dilimleme için hazırlamak için, beyin için bir dayanak noktası olarak kullanılmak üzere yaklaşık bir santimetreküp büyüklüğünde% 3'lük küçük bir parça kesin ve alt kollikulusu desteklemek için bir yumru olarak kullanılmak üzere 1,5 santimetre x 1,5 milimetre x üç milimetrelik başka bir parça kesin. Daha sonra, backstop'u siyanoakrilat yapıştırıcı ile sahneye yapıştırın ve ardından backstop'un sağ tarafındaki çıkıntıyı, 90 derecede iki çizgi ve 17 derecede çapraz bir çizgi ile işaretlenmiş bir slayt üzerinde 80 derecelik bir açı oluşturacak şekilde yapıştırın. sol üstten sağ alta beyin sırt tarafı yukarı gelecek şekilde iki çizginin kesişme noktasına yerleştirin. Bir tıraş bıçağı kullanarak, düz bir yüzey oluşturmak için beynin rostral ucunun iki ila dört milimetresini çıkarın.
Ardından, beyin tokacını yeni oluşturulan düz yüzeye yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Beynin sırt yüzeyini yatay bir çizgi ile ve beynin orta hattını slayt üzerinde işaretlenmiş dikey bir çizgi ile hizalayın. Ardından tıraş bıçağını 17 derecelik bir çizgiyle hizalayın.
Tıraş makinesini 30 derecelik bir açıyla eğin ve beyni vibrato sahnesine monte etmek için çift çapraz bir kesimle sağ korteksin yaklaşık üç milimetresini çıkarın. Beynin ventral tarafına küçük bir parça filtre kağıdı yerleştirin, böylece uzun boyut orta hatta dik olur. Arka durdurucunun önündeki ve çıkıntının solundaki alana az miktarda siyanoakrilat yapıştırıcı dikkatlice uygulayın.
Daha sonra, çift çapraz olarak kesilmiş beyin tarafını yapıştırıcının üzerine yerleştirin, böylece beynin alt kısmı ve arka beyin tümseğe dayanır ve beynin sağ tarafı geri tepmeye karşı olur. Bu prosedürde, kesme aşamasını hızlı bir şekilde vibratoya yerleştirin, kesme çözeltisi ile bir aşama oluşturun. Ardından, bıçağı beynin üst kısmı ile hizalayın.
Beynin üst kısmından bir ila 1,5 milimetre çıkarın. Daha sonra daha derine inerken 300 ila 500 mikrometre arasında daha fazla dilim dilimleyin ve çıkarın. İnferior kollikulus, medial atlı cisim ve lateral ICT çekirdeğinin tümü görünür olduğunda, dentat girus C şeklinde görünmeli ve yapı aynı hizada olmalıdır.
Yaklaşık iki dilim 600 mikrometre elde edin. Bunlar karotal kortikal dilimlerdir. Bundan sonra, onları 32 santigrat derece tutma odasına aktarın.
Flavoprotein Otofloresan görüntüsünü elde etmek için, görüntüleri 105 saniye boyunca dört hertz'de toplayın. Dokuyu 470 ila 490 nanometre mavi ışıkla aydınlatın ve 515 nanometrenin üzerinde çekim yapın, görüntünün ne çok karanlık ne de dışarı fırlamış olmasını sağlayın. Daha sonra bir kalsiyum görüntüsü elde etmek için dokuyu aktive etmek için elektrik stimülasyonu kullanın.
Görüntüleri 25 saniye boyunca 10 hertz'de toplayın. Dokuyu 365 nanometre ışıkla aydınlatın ve 510 nanometrenin üzerindeki floresan yakalayın. Yine, görüntünün ne çok karanlık ne de patlamış olduğundan emin olun.
Daha sonra hücreleri aktive etmek için elektrik stimülasyonu kullanın. Bu görüntü, Flavoprotein Otofloresan ile beyin dilimindeki karotal kortikal bağlantının doğrulanmasını göstermektedir. İnferior kolusa 0.05 hertz'de verilen elektriksel stimülasyon, bu stimülasyondaki gücü göstermek için dört hertz ve dört a'da işlendi.
Frekans, işitsel talamus, talamik, retiküler, çekirdek ve işitsel korteks sinaptik olarak aktive edilir. İşte bağlantısız bir dilim. İnferior kolusun aktivasyon ile elektriksel stimülasyonu sadece işitsel talamusta görüldü.
Muhtemelen kesiklerden birinin düzlemden biraz çıkması nedeniyle yolun tamamı yakalanmadı. Alam kortikal projeksiyonları ile. Bu görüntü, işitsel korteksin atipik aktivasyonunu göstermektedir.
İnferior kolusun elektriksel stimülasyonu, görünür bir sinyal olmadan işitsel korteksi aktive etti. İşitsel talamusta, talamusun hala aktive edilmiş olması muhtemeldir, ancak görüntü yüzeyinde değildi. Bu videoyu izledikten sonra, AAL talamik kortikal dilimin nasıl elde edileceğini ve bağlantısını nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, fare beynindeki ana işitsel yapılara odaklanan Calot Thal kortikal diliminin hazırlanması için bir yöntem sunar. Teknik, işitsel bölgelerdeki bağlantıların anlaşılmasını artırır.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- İşitsel İşleme
- Beyin Dilimleme Teknikleri
Arka Plan
- Çalışma, fare beynindeki işitsel işlemeyi araştırmayı amaçlamaktadır.
- Dört ana işitsel yapıya odaklanır: inferior kollikülüs, işitsel talamus, talamik retiküler çekirdek ve işitsel korteks.
- Bu bağlantıları anlamak, işitsel bölgelerdeki bilgi işlemeyi araştırmak için önemlidir.
- Yöntem, beyin yapısını korumak için karmaşık dilimleme tekniklerini içerir.
Çalışmanın Amacı
- İşitsel bağlantıların bütünlüğünü koruyan beyin dilimlerini hazırlamak.
- İşitsel bilgi işlemeyi anlamak için deneyleri kolaylaştırmak.
- Beyin dilimi hazırlamada hassas kesme tekniklerinin önemini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Dilimleme için fare beyninin çıkarılması.
- Dilimleme için beyni hazırlamak.
- Dilimler elde etmek için çift açılı kesim yapmak.
- Dilimlerdeki bağlantıları değerlendirmek için flavoprotein görüntülemesinin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, ana işitsel yapıların bağlantılarını başarılı bir şekilde yakalar.
- Flavoprotein görüntüleme, işitsel yolakların bütünlüğünü ortaya çıkarır.
- Çift açılı kesmenin projeksiyonları korumadaki etkinliğini göstermiştir.
- Gelecekteki işitsel işleme deneyleri için güvenilir bir teknik sağlamıştır.
Sonuçlar
- Çalışma, işitsel beyin dilimlerini hazırlamak için geliştirilmiş bir yöntem sunar.
- Nörobilim araştırmalarında hassas kesme tekniklerinin önemini vurgular.
- Bulgular, işitsel bilgi işlemeyi daha iyi anlamaya katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Preserving colliculo-thalamocortical connectivity in mouse brain slices enables rigorous interrogation of auditory information processing across multiple brain regions. This approach supports predictive confidence in mechanistic studies by maintaining both ascending and descending pathways, critical for target validation and pathway de-risking in early discovery. The integration of 3-D printed chamber components and multi-scale optical imaging enhances reproducibility and cross-study comparability, strengthening portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional mapping of auditory circuits for mechanistic de-risking.
- Supports validation of synaptic connectivity across midbrain and forebrain structures.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of sensory information flow.
- Provides a platform for assessing the impact of cortical modulation on subcortical processing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized brain slice preparations for reproducible functional assays.
- Allows rapid assessment of connectivity using flavoprotein autofluorescence imaging.
- Supports quantitative evaluation of network activation in response to electrical stimulation.
- Enables scalable preparation of slices for compound screening or perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo auditory processing for translational continuity.
- Permits investigation of disease-relevant disruptions in auditory pathways.
- Supports biomarker discovery by linking functional activation patterns to molecular readouts.
- Facilitates risk-adjusted advancement of targets with validated circuit-level effects.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling multi-scale analysis of auditory circuits from single-slice preparations. It supports workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Provides a robust platform for testing circuit-level hypotheses and clarifying pathway function.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts of network activation for assay development.
- Analytics: Delivers optical and electrophysiological measurements to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro circuit function to in vivo sensory processing models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable preparation for diverse mechanistic and screening studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes slice preparation and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets with validated circuit engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in complex brain slicing and alignment techniques.
- Needs access to 3-D printing for custom chamber components and advanced optical imaging systems.
- Demands rigorous cross-team standardization of slicing and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or species.
- Connectivity assessment is limited by slice quality and imaging depth.
