Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

Bu prosedürün genel amacı, çoklu miyelom primer hücrelerinin bir dizi kemoterapötik ajana karşı kemo-duyarlılığını nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle taze kemik iliği aspiratından izole edilen çoklu miyelom hücrelerinin; ön kültür yapılmış, hastadan türetilmiş stroma ve kolajen ile karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, CEL karışımı çok kuyucuklu bir plakaya ekilir.

Hücreler daha sonra ilgili kemoterapötik ajanlarla muamele edilir ve plaka, hücrelerin 96 saatlik inkübasyon süresi boyunca ardışık olarak görüntülenmesi için motorlu tabla mikroskobunun inkübatörüne aktarılır. Nihayetinde, her bir ilaç ve konsantrasyon için canlılık eğrileri oluşturmak amacıyla dijital bir görüntü analiz algoritması kullanılabilir. Bu tekniğin mevcut son nokta canlılık analizlerine göre temel avantajları, tek bir hasta örneğine karşı birden fazla kemoterapötik ajanın test edilebilmesi ve hasta hücrelerinin canlılığının, hücreleri stromadan veya matriksten ayırmaya gerek kalmadan birkaç gün boyunca boylamsal olarak ölçilebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, teorik olarak belirli kemoterapi rejimlerine verilen klinik yanıtı öngörmek için kullanılabileceği için hematopoetik tümörlerin tedavisine kadar uzanmaktadır. Orijinal mikroakışkan lamlarımızı çok kuyucuklu plakalarla değiştirmenin, deneyi tamamlamak için gereken maliyeti ve süreyi büyük ölçüde azaltacağını fark ettiğimizde bu protokol fikri ilk kez ortaya çıktı. Çok kanallı bir pipetleyici ile primer multipl miyelom ve kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre ko-kültürlerini hazırlamak için, işlemlere hücreleri RPMI 1640 içerisinde final konsantrasyonun altı katı olacak şekilde süspanse ederek başlayın.

Ardından, her bir hücre tipinin 50 µL'sini, toplam hacim 300 µL olacak şekilde taze hazırlanmış tip bir kolajen ile karıştırın. Daha sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak hücre matrisi karışımının 8 µL'sini 384 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğun merkezine manuel olarak dağıtın ve tüm hücreleri aynı odak düzleminde toplamak için plakayı santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra, jelin polimerize olması için plakları bir saat boyunca hücre kültürü koşullarında inkübe edin. Ardından her kuyucuğa 80 µL desteklenmiş büyüme medyumu ekleyin ve stromanın plağın tabanına yapışması için plağı gece boyunca inkübe edin. Robotik bir pipetleyici ile multipl miyelom stroma ko-kültürleri hazırlamak için, az önce gösterildiği gibi 300 µL CD 1 38 pozitif multipl miyelom hücresini ve 300 µL stromal hücreyi, RPMI 1640 medyumunda nihai istenen yoğunluğun altı katı olacak şekilde süspande ederek başlayın.

Ardından, her iki hücre tipini "CD 1 38 positive" olarak etiketlenmiş 1,5 mililitre bir tüp içerisinde karıştırın ve tüpü hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Sonrasında, uygun multipl miyelom hücre hattından 60 mikrolitre ve stromal hücrelerden 60 mikrolitreyi, nihai istenen yoğunluğun altı katı konsantrasyondaki RPMI 1640 besiyerinde süspande edin ve her iki hücre tipini "cell line" olarak etiketlenmiş ikinci bir 1,5 mililitre tüpte karıştırıp bunu da 37 santigrat derecede inkübe edin. Robotik pipetleyiciye hücre ekim betik dosyasını yükleyin.

Ardından, robotun A istasyonuna 200 µL pipet ucu kutusunu, B istasyonuna bir mikrotiter plakayı ve E istasyonuna steril bir 3 84 kuyucuklu plakayı yerleştirin. Daha sonra, CD 1 38 pozitif hücre karışımını taze hazırlanmış CD 1 38 ön karışımlı besiyeri tüpüyle karıştırın ve elde edilen hücre solüsyonundan 1,5 mL'sini mikrotiter plakanın bir numaralı kuyucuğuna aktarın.

Hücrelerin geri kalanını buz üzerinde bekletin ve programı başlatın. Robot, 384 kuyucuklu plakanın ilk 176 kuyucuğuna ekleme yapacak ve ardından duraklayacaktır. Bu süreyi, geri kalan CD 1 38 pozitif hücreleri mikrotitre plakasının iki numaralı kuyucuğuna aktarmak için kullanın ve programı yeniden başlatın.

Robot, plakanın geri kalan 144 kuyusunu görecek ve tekrar duraklayacaktır. Şimdi, hücre hattı tüpündeki hücreleri, taze hazırlanmış bir hücre hattı ön karışım tüpüyle karıştırın ve içeriği mikrotitre plakasının üç numaralı kuyusuna aktarın. Ardından programı yeniden başlatarak robotun 384 kuyulu plakanın geri kalan 64 kuyusuna ekim yapmasını sağlayın.

Son kuyucuğa ekim yapıldıktan sonra, hücreleri merkezkaçla çöktürün ve ko-kültürleri kolajen polimerizasyonu için hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Bir saat sonra, robot üzerine medya katmanı betiğini yükleyin ve A istasyonuna 120 µL pipet ucu kutusunu, B istasyonuna fetal bovine serum, hasta plazması ve antibiyotiklerle desteklenmiş 31 mL RPMI 1640 medyumu içeren bir reaktif rezervuarını ve E istasyonuna CED 3 84 kuyucuklu plakayı yerleştirin. Ardından programı çalıştırın. Robot, her bir kuyucuğa 81 µL desteklenmiş medyum transfer edecektir.

Robot işlemi tamamladığında, stromanın gece boyunca substrata tutunmasını sağlamak için hücreleri inkübatöre geri yerleştirin. Ekilen hücreleri ilgili ilaçla tedavi etmek için, öncelikle robotik pipetleyici kullanıcı arayüzüne medya katmanı ilaç plakası betiğini yükleyin. Ardından, A istasyonuna 120 microliter pipet ucu kutusu, B istasyonuna FPS hasta plazması ve antibiyotiklerle desteklenmiş 21 milliliters RPMI 1640 içeren bir rezervuar ve E istasyonuna boş bir 3 84 kuyucuklu plaka yerleştirip programı çalıştırın; robotik pipetleyici tüm kuyucuklara 30 microliters besiyeri ekleyecektir.

3 adet 84 kuyucuklu plaka. Ardından şablona uygun olarak, kontrol kuyucuğu hariç mikrotitre plağının her kuyucuğuna, maksimum konsantrasyonun 20 katı yoğunlukta 200 µL ilaç ekleyin. Kontrol kuyucuğuna FBS, hasta plazması ve antibiyotikler ile desteklenmiş besiyeri ekleyin.

Ardından, istasyon A'ya 120 µL pipet ucu kutusunu, istasyon B'ye ilaçların bulunduğu mikrotiter plakayı ve istasyon C'ye besiyeri içeren 384 kuyucuklu plakayı yerleştirin ve ilaç plakası programını yükleyin. Robotik pipetleyici, bu şekilde gösterildiği gibi 1'e 3'lük seri dilüsyonlar oluşturacaktır. Şimdi, istasyon A'ya yeni bir 120 µL pipet ucu kutusunu, istasyon B'ye seyreltilmiş ilaçların bulunduğu 384 kuyucuklu plakayı ve istasyon C'ye ekilmiş hücrelerin bulunduğu 384 kuyucuklu plakayı yerleştirin ve ilaç ekleme programını çalıştırın.

Robotik pipetleyici, ilaç plakasının her bir kuyucuğundan sekiz mikrolitre ilacı, hücre plakasındaki karşılık gelen kuyucuğa aktaracaktır. Son kuyucuk işleme alındıktan sonra, hücre plakasını hemen dijital mikroskobun inkübatörüne yerleştirin. Ardından hücreleri görüntülemek için, masaüstü inkübatörün iç kısmını etil alkol içeren ıslak bir mendille temizleyin ve plaka kapağını inkübatör kapağıyla dikkatlice değiştirin.

Ardından, deney sırasında sırasıyla görüntülecek olan ilgi bölgeleri için işaret noktalarını eklemeye yönelik yazılım adımlarını takip edin. Son olarak, 5x veya 10x büyütmeli bir objektif kullanarak, multipl miyelom hücreleri koyu bir halka ile çevrelenmiş parlak diskler şeklinde görünene ve stromal hücreler zar zor seçilene kadar hücreleri odaklayın. Bu deneyde, canlı multipl miyelom hücreleri yeşil renge boyanmış olup; tüm multipl miyelom hücrelerinin öldüğü en yüksek ilaç konsantrasyonunda, deney sonunda stromal ve insan göbek ven endotel hücrelerinde çok az yeşil sinyal gözlemlenmiş veya hiç gözlemlenmemiştir.

Ardından, farklı ilaç konsantrasyonlarına zamanla maruz kalmanın yol açtığı kademeli canlılık kaybını başlatmak için robot yazılımı kullanılmıştır. Görüntüleme işlemine başlamadan önce, artefaktlar görüntü analiz yazılımını yanıltabileceği ve yanlış sonuçlara yol açabileceği için ekilmiş tüm kuyucukların dikkatlice gözlemlenmesi önemlidir. Örneğin, burada stromal hücrelerin aşırı yoğunluğunun veya tripsinizasyon ile ekim arasında çok fazla zaman geçmesinin sonucunda, bu görüntüde görüldüğü üzere hücre kümelenmelerinin oluştuğu gösterilmektedir.

Hücre hatları iki yüksek yoğunlukta ekilirse, replikasyon sırasında koloniler oluşturacaklardır; bu durum, hücrelerin birbirinden ayırt edilmesini giderek zorlaştıracağı için dijital görüntü analiz algoritmasının doğruluğunu azaltacaktır. Kemik iliği aspiratından elde edilen multipel miyelom hücresi sayısı 500.000'in altında olduğunda, çok az sayıda multipel miyelom hücresi ekilmiştir. Hücreleri ekmeden önce kullanılan tüp için ölü hacmin belirlenmesi ve bu hacmin dilüsyon hesaplamalarına dahil edilmesi gereklidir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik iki ila üç saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedür uygulanırken, hücreler hazır olana kadar polimerizasyonu önlemek için kollajen içeren önceden karıştırılmış medyumun buz üzerinde tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu çalışma ayrıca, tümör yükündeki kemoterapi duyarlılığının heterojenliğinin, hastanın yanıtının derinliğini ve süresini nasıl belirleyebileceğinin araştırılmasına da yardımcı olmuştur.