Name: Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Keşfedin maya kromozomlarının yüzey yayma ve immün boyama yöntemlerini, kromozom bağlı proteinleri floresan mikroskopi ile görüntülemek için. Bu teknik genetik ve hücre biyolojisi araştırmalarında değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NIH hibe GM50936 tarafından DKB'ye desteklenmiştir.

NOT: Protokol bazı adımlar aşağıda temiz bir davlumbaz çalışma gerektirir. Buna ek olarak, yöntem spheroplasting izlemek için bir 10X uzun çalışma mesafesi hedefi ile donatılmış bir maya tetrad diseksiyon mikroskobu gerektirir. mikroskop vaktinden kaputu kurulmalıdır. Kapsamından mikromanipülatör kol ve plaka tutucu çıkarın ve çalışma alanından uzakta güvenli bir yerde bu öğeleri koyun. Spheroplastlar hazırlanması 1. <ol><li> İstenen şartlar altında mayayı büyütün. OD600 1.4 = 5 x 10 7 hücre / ml&#39;de her bir örnek için yaklaşık 2 x 10 8 hücreleri, örneğin, bir kültürün 4 ml kullanın. Numunelerin anında işlem, bazı durumlarda tercih edilebilir olsa da, bir çok uygulama için, hücre alikotları işlemden önce en fazla 8 saat süre ile buz üzerinde saklanabilir. </li><li> Pelet hücreleri 3 dakika boyunca 5 (2345 rpm / 857,5 xg) ayarlayarak bir klinik santrifüj cihazında bir 15 ml santrifüj tüpüne ve spin hücre süspansiyonu aktarın. </li&gt; <li> Pelet hücreleri kaybetmek değil orta alarak dikkat Durusu. Yavaşça 1 mi ZK tampon içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve daha sonra 40 ul 1 M ditiyotreitol (DTT) ilave edin. Yumuşak bir karıştırma ile 2 dakika kuluçkalayın. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2). </li><li> 1 mi ZK tamponu içinde yeniden süspanse peletler. İyice karıştırıldıktan zymolyase 100T taze hazırlanmış bir çözeltisine 5 ul ekle. Hücre duvarı çıkarın ve sferoplastlar üretilmesi için 30 ° C sıcaklıkta 20-30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Spheroplasting tam olup olmadığını belirlemek için bir mikroskop lamı üzerine hücre süspansiyonu, 10 ul damlacık testi. Bir lamel olmadan diseksiyon mikroskobu altında incelendi hücreler. Hücreler, şişirilmiş ve yuvarlak yerine hafif dikdörtgen görünür ve su 20 ul ilave edildikten sonra lize gerekir. Hücreler lize başarısız olursa, su kaynaklı lizis kolaylıkla gözlenene kadar her 10 dakikada bir, 30 ° C örnek dönmek ve yeniden deney. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2). </li><li> Yavaşça tekrar süspansiyon ve hücre pelet i yıkayınn, 2.5 ml soğuk MES / sorbit tamponu. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2). Yavaşça 300-400 ul soğuk MES / sorbitol tampon içinde hücre pelletini. Hücreler, bir kaç saat için bu aşamada buz üzerinde tutulmalıdır. </li></ol> Yayılma 2. Kromozom NOT: kromozomlar-yayılmış ya slayt veya edilecek bunun üzerine cam yüzeyler lamelleri-gerekir vaktinden önce hazırlanacak. Her slayt veya lamel suya edilmelidir ardından EtOH, sonra kurumaya bırakılır ve objektif kağıdı ile parlatılır. Kromozomlar lamelleri üzerine yayılır edilecek ise, lamel Scotch bant veya kauçuk çimento ile slayt yapıştırılmış olmalıdır. Aksi belirtilmedikçe, protokolün geri kalanı ya bir slayt veya lamel yayılmasını anlatacağız <ol><li> Temiz bir slayt yüzeyi üzerine bir P20 pipet, pipet hücre süspansiyonu 20 ul kullanılması. </li><li> P200 pipet kullanarak,% 3 PFA / sukroz çözeltisi 40 ul ve hafifçe Solutio karıştırınSchlieren hatları kayboluncaya kadar elle slayt &quot;dönen&quot; ile n. Mikroskop altında slayt yerleştirin ve hücreler odakta olduğunu onaylayın. PFA çözeltisi kullanım gününde davlumbaz taze hazırlanmış olmalıdır. NOT: İlgili protein önceden yöntemiyle incelenmiş değilse, bu proteinin tutma sabitleme koşullarına duyarlı olup olmadığını belirlemek için 2 ve% 4 PFA içeren solüsyonlar kullanarak ek slaytlar hazırlamak için tavsiye edilir. % 4 PFA / sukroz çözümü ilişkili tübülin mikrotübül görselleştirmek için arzulanır olduğu durumlarda kullanılmaktadır. yüksek sabitleyici konsantrasyon dezavantajı kromozom olacağıdır &quot;underspread,&quot;% 2 PFA aynı zamanda &quot;underspread&quot; kromozom elde etmek eğilimindedir. </li><li> P200 pipet kullanarak, tamamen mümkün olduğunca çözüm karıştırmak için önce girdap, bir zamanlayıcı başlatmak,% 1 Lipsol 80 ul ekleyin. Lipsol mevcut değilse, 80 ul% 1 NP40 ve 80 ul dH 2 O olabilir(Şekil 2 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) ikame. </li><li> Kayıcı her 15 saniyede girdap dikkatlice ve yavaşça hücrelerin izleyin. Hücrelerin kabaca% 80&#39;i parçalanmış zaman, hemen mikroskop slaytı kaldırmak, Sayacı durdurmak PFA / sakaroz çözeltisi 80 ul ekleyin ve girdap karıştırmak için (kayboldu). Lizis zamanlayıcı başladıktan sonra 30 ila 90 sn gerçekleşmelidir. NOT: Birkaç slaytlar yaklaşık aynı zamanda lizizini göstermek ise, bir sonuçta slaytlar kalanı için mikroskobik izleme ihmal ve sadece dikkatle lipsol ve fiksatif son kısım ilave eklenmesi arasındaki süreyi zaman olabilir. Aynı örnekten birden slayt hazırlarken Ancak, bu kısa yol, sadece güvenilir. Farklı slaytlar farklı zamanlarda alınmış örneklerden veya farklı kültürlerden hazırlanır zaman mikroskobik her numunenin lizizine izlemek için en iyisidir. </li><li> Temiz, düz bir yüzey üzerine slayt yerleştirin ve tüm çözülmesi sağlandığında Surfac boyunca sıvı yaymak&quot;su birikintisi&quot; menisküs altında ama yani slayt kendisi yüzeyi üzerinde düzenlenen bir temiz, tek Mera pipet tarafı kullanarak slayt e. pipetle slayt yüzeyini &quot;komisyon&quot; yoktur. Numunelerin kirlenmesini önlemek için farklı slaytlar üzerinde pipetlemeyin tekrar kullanmayın. </li><li> Davlumbaz gece kurumaya bırakın slaytlar. Çözülmeyen nükleer bileşenler slayt yüzeyine yerleşmek ve ona bağlanacaktır. Büyük deneyler için, kurutma aşaması için alanı kullanımını planlama çok önemlidir. </li><li> Bir kez kurutulduktan sonra, en iyi sonuçlar aynı gün immün aşamasına ilerlemektedir ile elde edilir. Ancak, kurutulmuş sakaroz çözüm örneklerinin donmasını sağlayan bir &quot;bal&quot; in yayılması kromozomları gömer: slaytlar plastik slayt kutusuna aktarılır ve yıllarca -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 3. immün <ol><li> 30 sn% 0.2 Fotoğraf-Flo Dip slaytlar. bal kaldırmak için. Yalın slaytlarBir kenar, kenar bir kağıt havlu üzerine dayayarak, rezidüel Foto-Flo kaldırın. </li><li> 5 dakika boyunca 1x TBS Dip slaytlar yıkayın. Bir kenarda slaytlar yaslanarak fazla sıvıyı çıkarın, ama onları kurumaya izin vermeyin. </li><li> Yan yukarı, pipet 300 ul TBS / BSA slayt çözülmesi sağlandığında kısmı boyunca slayt üzerine buzlu slaytlar yatırın. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bir nem odasında inkübe edilir. (Doymuş kağıt havlu ile bir delikli metal plaka veya plastik slayt kutusunun altında suya doygun kağıt havlu ile kaplı büyük plastik kap). </li><li> Bir kağıt havlu üzerine slayt bir kısa kenarı dinlenme ve (örneğin bir test tüpü raf gibi) uygun bir destek karşısında slayt eğilerek slaytlar boşaltın. Yüzey kurumasına izin vermeyin. </li><li> Hemen birincil antikor, uygun bir seyreltme içeren TBS / BSA tamponu 80 ul uygulanır. Antikor sınırlayıcı ise, 40 ul ve 22 x 22 mm&#39;lik bir örtücü cam kullanılır. Ham tavşan serumu için, bu tipik olarak, bir 1/50 ve 1/500 seyreltme arasındadır. NOT:Yeni antikor hazırlıkları için titrasyonları gerçekleştirin. arka plan üzerinde yüksek sinyal verir en inceltilmiş hazırlık seçilir. Bağışıklık-öncesi serumu ile boyanmış olmalıdır arka plan boyama düzeyi kontrol etmek için, çekirdekler, uygun silme mutant ve / veya çift slaytlar hazırlanmalıdır. </li><li> Kabarcıklar kaçınarak slayt üzerinde cilalı 22 x 50 mm lamel yerleştirin. Kısa bir kenarına yakın pozisyonlarda uzun kenarından başparmak ve işaret parmağı arasında lamel tutarak bunu yapın. 30 ° açıyla lamel Holding sadece &quot;su birikintisi&quot; slayt buzlu bölgeye yakın kenarına iç slayt üzerinde oturana kadar parmakları kısa kenar uzak düşer, slayt. Sonra yavaş yavaş slayt dokunmatik tezgah tutan parmakları kadar pürüzsüz bir hareket lamel düşürmek ve sonra bırakın. O topraklarda bir zamanlar lamel konumunu ayarlamak için çalışmayın. NOT: kromozom yayılır hazırlanmış olsaydıyapıştırılmış lamelleri (ziyade direkt olarak slaytlar yüzey), bu örnek lamel boyama ve yıkama aşamaları boyunca slayt yapıştırılmış kalır. Ek bir lamel boyama ve daha sonra atılır boyunca eşit bir şekilde antikor çözüm dağıtmak için örnek lamel üzerine yerleştirilecektir. </li><li> Sızdırmaz şekilde kapalı bir nemli oda içinde yer slaytlar ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Bir cam slayt boyama rafa buzlu kenar aktarım işlemlerinin slaytları Holding ve TBS içeren bir boyama kavanoz daldırın. </li><li> Yavaşça lamel kaldırmak için yukarı ve aşağı slayt batırın. Bunu yapmak için çok fazla kuvvet kullanmaya çalışıyorum. TBS daldırarak 10 dakika 2x slaytlar yıkayın. Raftan slaytları çıkarın ve kağıt havlu kenarı dokunarak fazla sıvıyı boşaltın. Yüzey kuru izin vermeyin. </li><li> Işık altında altında çalışan hemen 80 ul TBS / BSA florokrom konjuge sekonder antikor (ya da 22 x 22 mm&#39;lik bir örtücü cam, 40 ul) içindeki bir 1 / 1,000 kat seyreltme içeren ekleyin. Ilanve daha önce olduğu gibi D lamel karanlıkta nemli oda içinde 2 saat süre ile 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> , Daha önce olduğu gibi lamelleri çıkarın slaytlar drenaj ve karanlıkta 1 ila 2 saat boyunca havada kurumaya yüzey sağlar. Daha önce olduğu gibi kağıt havlu üzerinde Yalın kayar. NOT: yayılan monte lamel gerçekleştirildi ise, kurumadan slayt lamel ayırın. Önceki adımda slaytlar için tarif edildiği gibi lameller daha sonra kurutulur. </li><li> Bastırılmış ışık altında çalışan, DAPI (üç 10 ul damlacıkları) içeren orta montaj yaklaşık 30 ul ekleyin ve sonra dikkatli bir şekilde lamel indirin. Formalar lamelleri üzerinde ise, temiz bir slayt üzerinde montaj orta damlacıkları yerleştirin ve slayt üzerine aşağı lamel, kromozom tarafını indirin. </li><li> Hala bastırılmış ışık altında, yerleşmek ve net oje ile lamel kenarları mühür için lamel için 2 dakika bekleyin. Düz slayt kutusunda slaytlar yerleştirin. NOT: STED mikroskopi için, uzatmak Gold ile monte edilir. Uzatmak Altın 30 ul kullanınve DAPI olmadan gecede tedavi için izin verir. Oje ile sızdırmazlık gereksizdir. </li><li> 40 veya 100X amacı DAPI odaklanmak için uygun ayarlanmış bir filtre kullanarak widefield Epifloresans mikroskobu ile Görünüm slaytlar. İsteğe bağlı olarak, birkaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de karanlıkta slayt saklayın. Donma yok. </li></ol>

<ol><li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li>
<li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li>
<li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li>
<li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+identifies+Monopolin%3A+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li>
<li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+RecA-like+recombinases%3A+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li>
<li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1%2FAurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li>
<li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li>
<li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li>
<li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Yayılmış çekirdeklerin görünümü kritik olarak fiksasyon ve lizis/deterjan işlemi arasındaki dengeye bağlıdır. Yukarıda tartışıldığı gibi, değişen hücresel yapıların korunması, farklı PFA konsantrasyonlarının kullanılmasını gerektirir. Çoğu protein için %3 PFA optimaldir. Bununla birlikte, iğlerin korunması %4 PFA kullanımını gerektirir. Tek bir reaktif seti ile bile, fiksasyona göre lizis zamanlaması da yayılan çekirdeklerin kalitesini etkileyebilir. En tutarlı sonuçlar için, lizisin bir ışık mikroskobu ile doğrudan g...

tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae kromozom fonksiyonunu kontrol eden proteinlerin çalışmaya dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin moleküler mekanizmaları, çalışmaları için birçok avantaj sunuyor. , Moleküler genetik ve biyokimyasal çalışmalar için maya tomurcuklanan iyi bilinen avantajları olmasına rağmen, hücre çekirdeğinde bulunan protein dağılımının sitolojik çalışmalar küçük boyutu karmaşıktır. Tipik bir maya çekirdeği görünür ışığın sadece yaklaşık 5 katı çözünürlük sınırı olan en az bir mikron bir çapa sahiptir. Bu nedenle, geleneksel bir immün ya da, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi floresan proteini etiketleri kullanılarak elde edilebilir, nükleer proteinlerin dağılımı hakkında bilgi miktarı sınırlıdır. Proteinlerin çekirdek içi dağılımı karakterize için yararlı bir yaklaşım, yayılma kromozom yüzeyidir. Bu yaklaşım, hücre duvarını kaldırarak hücre ve nükleer membranlar ve a kesintiye içerirllowing çekirdeğin çözünmeyen içeriğinin bir mikroskop lamı yüzeyi üzerine yerleştirmek. Çözünmeyen bileşenler, nükleer matris ve kromozom bulunmaktadır. Kromatin bağlı proteinleri tespit etmek için yeteneğini geliştirir çözülebilen çekirdek içindeki uzaklaştırılmasını sağlayan ek olarak, bu tür yayılmış çekirdek yaklaşık 3 um ila 5 arasında çaplara sahip (diploid mayoz çekirdekleri) kromozom önemli dekompresyonu yöntem sonucu yayılan kromozom ve 2 diploid mitotik çekirdekleri ila 3 um. Bu dekompresyon sağlam çekirdekleri gidermek için nispeten zor veya imkansız nükleer alt algılanmasını sağlar. Yayılma kromozoma bariz bir eksiklik yayma işlemi ilgi yapısını bozan kısmen veya tamamen ihtimalidir. Özellikle endişe, belirli bir kromozom bağlı protein yayılan prosedürünün bir sonucu olarak kaybedilebilir olmasıdır. Bu potansiyel komplikasyon shouveri yorumlanırken ld akılda tutulmalıdır. Yayılma prosedüre karşı duyarlı olan bir proteinin bir örneği, beta-tubulin olup. Bazı koşullar altında, esas olarak tübülin oluşan mili, 3 yayılması sırasında korunur. Milin Görselleştirme genellikle ilgi çekirdeklerini sahne yararlıdır. Bununla birlikte, tubulin görselleştirme yüksek bir konsantrasyon sabitleyici tedavi gerektiren; iğ, aşağıda tarif edilen standart koşullar altında kaybolur. Bu örnek, daha önce uncharacterized proteinin dağılımını analiz ederken, bu proteinin böyle varyasyon ne kadar duyarlı belirlemek için sabitleştirici konsantrasyonunu değişir önemli olduğunu göstermektedir. Kromozom yapısına yayılan koşulların etkilerine ilişkin endişe rağmen, yayılma yöntemi yarar ve güç pek çok bağlamda gösterdiler ve mitoz karakterizasyonu ve özellikle mayotik hücreleri 4-7 geniş yarar sahiptir. Two yayma yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Dresser ve Giroux&#39;nun 8 tarafından geliştirilen bu yöntem, ilk olarak, deterjan kullanımını önler ve DNA spesifik boya DAPI lekeli göreceli olarak iyi korunmuş morfolojisinin sahip gibi görünmektedir yayılmış preparatları elde edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem, mükemmel nispeten zordur ve bir sürgünün bir bölge, diğer bölgelere kıyasla zaman yayılmış çekirdeğin kalitesi, önemli ölçüde değişir. Bu sorun veri toplama önyargı önlemek için, bir slayt birçok seçilmemiş çekirdekleri görüntüleme içeren kantitatif yaklaşımların karmaşık hale getirebilir. Loidl ve Klein 1 tarafından geliştirilen yöntem yayılan ikinci kromozom, lizis ve deterjan çözeltisi tarafından teşvik kromatin dekompresyon ile, paraformaldehid ile fiksasyon dengeleme içerir. Düzgün yapıldığında, bu yöntem Dresser ve Giroux yöntemine göre daha az bölge için bölge varyasyon ile çok tekrarlanabilir sonuçlar verir. Bu sunum, bir tadil odaklanırnedeniyle güvenilirliğe ve sadeliğe sahip Loidl ve Klein yöntemine d versiyonu. Kromozom yayma karmaşık ya da zaman alıcı değildir; 100&#39;e kadar slaytlar tek bir gün içinde immün için hazırlanmış olabilir. Ayrıca, yayılma hazırlıkları öncesinde immün yıllarda dondurucuda saklanabilir ve böylece laboratuarları yeni biyolojik sorular ortaya ya da yeni boyama reaktifleri kullanılabilir hale kullanılabilen donmuş kromozom yayılır bir depo gelişebilir. kromozom yayma yöntemi en sık immün ve widefield floresan mikroskobu ile birlikte kullanılır, ancak bu tür uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi olarak süper çözünürlüklü ışık mikroskobu yöntemleri için slaytlar hazırlamak da mümkündür olduğunu.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biyolojik&nbsp;</td><td>Z1004</td><td>% 2 glikoz ile desteklenmiş 50 mM Tris pH 7.5'te 20 mg / mL çözelti hazırlayın. Her deneyi taze hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın; Kullanıma hazır olana kadar C.</td></tr><tr><td>Lipsol&nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&nbsp;</td><td>artık ticari olarak mevcut değil</td><td>Suda %1 (h/h) çözelti hazırlayın. Buz üzerinde saklayın.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Suda %1 (h/h) çözelti hazırlayın. Buz üzerinde saklayın.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standart lamel</td><td>Fisher</td><td>12-544-E veya 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek çözünürlüklü lameller</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solüsyonu</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Suda %0,2 (h/h) solüsyon hazırlayın.</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>TBS'de% 1 (a/h) çözelti hazırlayın. 4 derecede saklayın; Bir aya kadar C.</td></tr><tr><td>Birincil antikor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Tavşan</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H + L) DAPI</td> Vector ile Antikor <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montaj ortamı</td><td>Laboratuvarlar</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kayar kutu</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Kurutulmuş sürülebilir ürünler içeren slaytları -20 ° C'de yuvalarda saklayın. Ayrıca, ıslak bir oda olarak kullanın.</td></tr><tr><td>Karton kayar kutu</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Lekeli/mühürlü slaytları rahatça taşımak veya 4 ° C'de saklamak için kullanın.</td></tr><tr><td>Coplin kavanoz</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Kaydıraklar için lavabo olarak kullanın.</td></tr></tbody></table>

yüzey yayma ve maya kromozomlar immün

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae'nin çekirdek boyutunun küçük olması, kromatine bağlı proteinlerin çekirdek altı dağılımının analizi için ışık mikroskobunun kullanımını sınırlar. Maya çekirdeklerinin yüzeye yayılması, bağlı protein kaybı olmadan kromatinin genişlemesine neden olur. Yüzeye yayma yöntemi, DNA'ya bağlı proteinlerin deterjan muamelesi ile fiksasyonunu dengeler. Gösterilen yöntem, Josef Loidl ve Franz Klein1,2 tarafından tarif edilenden biraz değiştirilmiştir. Yöntem, mitotik hücre döngüsünün çeşitli aşamalarında birçok kromatine bağlı proteinin lokalizasyonunu karakterize etmek için kullanılmıştır, ancak özellikle mayotik rekombinozomlar ve sinaptonemal kompleks gibi mayotik kromozom yapılarının incelenmesi için yararlıdır. Ayrıca, orijinal prosedürde talep edilen, ancak artık ticari olarak mevcut olmayan tescilli bir deterjan olan Lipsol'ün kullanılmasını gerektirmeyen bir modifikasyonu da açıklıyoruz. Kromozom yayma yöntemi ile uyumlu bir immün boyama protokolü de açıklanmaktadır.

yayılmış çekirdeklerinin görünümü eleştirel kromozom tespit ve de-sıkıştırma arasındaki dengeye bağlıdır. Reaktifler düzgün dengeli bile, kromozom de-sıkıştırma derecesi değişim ve / veya farklı slaytlar arasında aynı slayt değişik bölgelerinde meydana gelebilir. Görüntüleri yorumlanır önce Böylece, bir slayt belirli bir bölgedeki formaların kalitesi değerlendirilmelidir. &quot;overspreading&quot; ve &quot;underspreading&quot; etkileri öz değişmesine ait rekombinasyon proteinlerine karşı ant...

Tomurcuklanan mayadan yüzeye yayılan kromozomlar için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, daha önce Loidl ve Klein tarafından açıklanan bir yöntemden türetilmiştir. Ek olarak, yayılmış kromozomların immün boyaması için bir prosedür gösteriyoruz.

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Bu prosedürün genel amacı, kromozoma bağlı proteinleri floresan mikroskobu ile görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle enzimlerle işlem yaparak hücre duvarının uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. Ben olis.İkinci adım, genellikle bir deterjan yardımıyla, ozmotik şok yoluyla hücreyi nükleer membranlara kadar lizlemektir. Bu işlem, protein yapısını korumak için düşük konsantrasyonda bir fiksatif varlığında gerçekleştirilir. Hücre lizinden sonra, protein yapılarını daha fazla stabilize etmek için fiksatif konsantrasyonu artırılır.Ardından lizize edilmiş hücreler bir mikroskop lamı üzerine yerleştirilir ve çekirdeklerin lam yüzeyine çökmesi beklenir. Son adım, örneklerin immün boyanmasıdır. Burada gösterilen indirekt immün boyama yöntemi, ilgilenilen proteine bağlanan bir birincil antikor ve birincil antikora bağlanan floresan işaretli bir ikincil antikor kullanır.Nihayetinde, kromozoma bağlı proteinlerin dağılımını incelemek için immünofloresan mikroskopi kullanılır. Bu temsili görüntüler, rekombinasyon proteinleri DMC one ve RAD 51 için immün boyama yapılmış yayılmış bir miyotik çekirdeğe aittir. Bu tekniğin, Mike Dresser ve Craig Deru tarafından tanıtılan yaygın olarak kullanılan diğer yönteme göre temel avantajı, lam yüzeyinin çoğunluğunun optimal şekilde yayılmış çekirdekler içermesi ve böylece tek bir lamdan çok sayıda yayılmış çekirdek görüntüsü elde etmeyi kolaylaştırmasıdır.Bu yöntem, iki proteinin beraber yerelleşip yerelleşmediği veya belirli bir nükleer alt yapının oluşumunun ilgilenilen belirli bir genin fonksiyonuna bağlı olup olmadığı gibi, nükleer alt yapıların incelenmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin aslen Franz Klein ve Yosef Lole tarafından geliştirildiğini vurgulamak isteriz. Bu videonun, tekniğin bizim versiyonumuzda uzmanlaşmak isteyen diğer kişilere yardımcı olacağını umuyoruz.Splatlar, istenen koşullar altında büyütülen maya hücrelerinden hazırlanır. Her örnek için yaklaşık 2x10⁸ hücre kullanın. Hücre süspansiyonunu 15 ml'lik santrifüj tüplerine aktarın.Hücreleri çöktürmek için tüpleri klinik bir santrifüjde beş ayarında üç dakika boyunca döndürün. Çökelekten hücre kaybı olmamasına dikkat ederek besiyerini boşaltın. Hücreleri nazikçe 1 mL ZK tamponunda ve ardından 40 µL 1 M dihi içerisinde yeniden süspanse edin.Üç etol ile oda sıcaklığında iki dakika boyunca hafifçe karıştırarak inkübe edin. Hücreleri daha önce yapıldığı gibi pelletleyin. Her bir pelleti bir mililitre ZK tamponu içinde süspande edin.İyice karıştırılmış, taze hazırlanmış zy liase 100 T çözeltisinden beş µL ekleyin. Hücre duvarını uzaklaştırmak ve sferoplastlar oluşturmak için 30 °C'de 20 ila 30 dakika inkübe edin. Sferoplast oluşumunun tamamlanıp tamamlanmadığını belirlemek için hücre süspansiyonunun 10 µL'sini mikroskop altında inceleyin.Hücre duvarı uzaklaştırılmadan önce, maya hücreleri hafifçe oval görünür; sferoplasti hücreleri ise şişkin ve yuvarlak görünmelidir. Su eklendikten sonra sferoplasti hücreleri nazikçe süspanse edilmeli ve hücre peleti 2,5 mililitre soğuk MES orbital tamponu ile yıkanmalıdır. Pelitleme işleminden sonra, hücreler tekrar nazikçe 300 ila 400 mikrolitre soğuk MES orbital tamponunda süspanse edilmelidir; hücreler bu aşamada birkaç saat boyunca buz üzerinde tutulabilir.Bu prosedür, çeker ocak içerisinde kurulu, 10 x uzun çalışma mesafeli objektife sahip bir maya tetra diseksiyon mikroskobu gerektirir; mikrodiseksiyon iğnesi çıkarılmış olmalıdır. Kromozomların yayılacağı cam yüzey de önceden hazırlanmalıdır: P 20 pipet kullanarak temiz bir lamın yüzeyine 20 µL hücre süspansiyonu damlatın, P 200 pipet ile 40 µL taze hazırlanmış %3 paraformaldehit %3.4 sükroz çözeltisi ekleyin ve şleyn çizgileri kaybolana kadar lamı elinizle dairesel hareketlerle sallayarak çözeltiyi nazikçe karıştırın. Lamı mikroskobun altına yerleştirin ve hücrelerin odakta olduğunu doğrulayın.P 200 pipet kullanarak, 80 µL %1 Lip Sal ekleyin; çözeltileri mümkün olduğunca tamamen karıştırmak için daha önce olduğu gibi dairesel hareketlerle çalkalayın ve bir zamanlayıcıyı başlatın. Lip sal mevcut değilse, aynı hacimde %1 MP 40 veya distile su kullanılabilir. Bu süre zarfında hücreleri dikkatle izleyin ve lamı her 15 saniyede bir nazikçe çalkalayın.Bu video klip, hücrelerin yaklaşık %80 ila %90'ı lize olduğunda neyin gözlemlenmesi gerektiğini göstermektedir. Zamanlayıcıyı durdurun ve lamı derhal mikroskoptan çıkarın. Lizis 30 ila 90 saniye arasında gerçekleşmelidir.Zamanlayıcıyı başlattıktan sonra, 80 µL paraformaldehit sakkaroz çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için dairesel hareketlerle sallayın. Lamı temiz ve düz bir yüzeye yerleştirin. Sıvıyı lamın buzlanmamış tüm yüzeyine yaymak için, temiz bir tek kullanımlık pastör pipetinin ucunu sıvı birikintisinin menisküs seviyesinin altında ancak lam yüzeyinin üzerinde tutarak kullanın.Pipetle lam yüzeyini kazımayın. Numunelerin kontamine olmasını önlemek için her lamda yeni bir pipet kullanın. Lamların çeker ocakta gece boyunca kurumaya bırakılmasıyla, kromozomlar dahil çözünmeyen nükleer bileşenler lam yüzeyine çökecek ve lamlar kuruduğunda buraya bağlanacaktır.En iyi sonuçlar, immün boyamaya aynı gün içinde geçilerek elde edilir. Lamları 30 saniye boyunca %0,2 Photo flow içine daldırın. Kurumuş sakkaroz çözeltisini uzaklaştırmak için lamları, kenarları bir kağıt havluya yaslanacak şekilde eğerek kalıntı Photo flow'u temizleyin.Yıkamak için lamları beş dakika boyunca bir XTBS içine daldırın. Lamları bir kenara yaslayarak fazla sıvıyı uzaklaştırın ancak kurumalarına izin vermeyin. Ardından, lamları buzlu yüzeyi yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve her lamın buzlu olmayan kısmına 300 microliters T-B-S-B-S-A pipetleyin.Lamları oda sıcaklığında, nemli bir kap içerisinde 15 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika sonra, her lamın kısa kenarını bir kağıt havluya yaslayıp lamı deney tüpü rafı gibi uygun bir desteğe dayayarak süzün. Yüzeyin hemen kurumasına izin vermeyin.Kaba tavşan serumu için uygun primer antikor dilüsyonunu içeren 80 µL T-B-S-B-S-A tamponu uygulayın. Bu dilüsyon genellikle 1/50 ile 1/500 arasındadır. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek lam üzerine cilalı 22 x 50 mm boyutunda bir lam camı yerleştirin.Bunu yapmak için lamelin uzun kenarını, bir kısa kenara yakın konumlardan başparmak ve işaret parmağıyla tutun. Lameli slayda göre 30 derecelik bir açıyla tutarken, parmaklarınızdan en uzak olan kısa kenarı, slaydın buzlu bölgesine en yakın olan sıvı birikintisinin kenarının hemen içine değene kadar indirin.Lamla temas edene kadar lamelin yavaş ve pürüzsüz bir hareketle indirilmesini sağlayın ve ardından bırakın. Lamel yerleştikten sonra konumunu ayarlamaya çalışmayın. Lamları sızdırmaz nemli bir hazneye yerleştirin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, lamları buzlu kenarlarından tutarak, her birini TBS içeren bir boyama kabına daldırın.Lam üzerindeki kapatma camını çıkarmak için su altındaki lamları nazikçe yukarı ve aşağı hareket ettirin. Bunu yaparken çok fazla kuvvet uygulamamaya çalışın. Lamları, her biri 10 dakika sürecek şekilde iki kez TBS içine daldırarak yıkayın.İlk yıkamadan sonra tampon çözeltiyi değiştirin. Lamları raktan çıkarın ve kenarlarını kağıt havluya değdirerek fazla sıvıyı süzün. Yüzeyin hemen kurumasını önleyin.Her bir lamın üzerine, 1/1000 oranında seyreltilmiş florokrom konjuge ikincil antikor içeren 80 µL T-B-S-B-S-A ekleyin. Lam camını daha önce yapıldığı gibi yerleştirin ve nemli oda içerisinde, dört °C'de, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra lam camlarını çıkarın, daha önce yapıldığı gibi yıkayın ve lamları süzün.Kağıt havlu üzerine bırakın. Yüzeylerinin karanlıkta, yaklaşık 30 µL dbi içeren montaj ortamı altında, loş ışıkta bir ila iki saat boyunca havada kurumasına izin verin. Ardından, bir lamelini dikkatlice üzerine indirin.Lamine kapatıcının oturması için loş ışık altında iki dakika daha bekleyin ve ardından lamine kapatıcının kenarlarını şeffaf oje ile mühürleyin. Lamları düz bir lam kutusuna yerleştirin. Lamlar, inceleme aşamasına kadar dört derece Celsius sıcaklıkta, karanlıkta saklanabilir.Dondurmayın. Bu adımda gösterilen lamlar, iki ökaryotik zincir değişim proteini olan RAD 51 ve DMC1 için çift immünboyama ve diploid hücreler için DNA'nın DPI ile karşıt boyama yapılmış, optimal şekilde yayılmış MYOTIC çekirdeklerin iki örneğidir; optimal şekilde yayılmış miyotik çekirdeklerin çapları yaklaşık beş mikrondur. Yetersiz yayılmış bir çekirdekte, daha az sayıda RAD 51 ve DMC1 odağı seçilebilir ve numune yeterince düz olmadığı için tüm yapılar tek bir odak düzleminde görüntülenemez; aşırı yayılmış çekirdeklerde ise durum farklıdır.Yetersiz tespit ve/veya aşırı deterjan kullanımı nedeniyle daha az RAD 51 ve DMC1 odağı kalmıştır. Ticari olarak artık mevcut olmayan lip sal'ın MP 40 ile değiştirildiği işlem deneyleri de gerçekleştirilmiş ve sinaptonemal kompleksin merkezi bölgesinin bir bileşeni olan RAD 51 ve zip1 için yayılmış miyotik çekirdek boyamasında gösterildiği üzere tatmin edici sonuçlar elde edilmiştir. Lip sal'ın distile su ile değiştirilmesi de tatmin edici sonuçlar vermiştir.Her iki durumda da, hücreler leptin NEA'dan PAA'ya geçerken meydana gelen kromozom sıkılaşması büyük ölçüde korundu. Bu yayma yöntemi, süper-çözünürlüklü mikroskopi yöntemleri ile kullanıma uygundur. Synap Neal Kompleksinin bu görüntüsünde, Paki INE çekirdeği zip one ve red one için korundu.Synap Neal Kompleksinin bileşenleri, stimüle emisyon yok etme mikroskobisi ile görüntülenmiştir. Burada yeşil renkle gösterilen zip one antikorunun, paralel doğrusal boyama paterninin kanıtladığı üzere, lateral elementlerin yakınına bağlandığına dikkat ediniz. Lateral elementler yaklaşık 100 nanometre aralıklıdır ve konvansiyonel mikroskopi ile çözümlenemezler.Yeterlilik kazanıldıktan sonra, örnek sayısına bağlı olarak ekim ve yayma tekniği işlemi iki ila dört saat içinde tamamlanabilir ve pratikle bu yöntemle 100 slayta kadar hazırlık yapılabilir. Her örnekten bir veya daha fazla kopya slayt hazırlanması önerilir. Kopyalar, gece boyu kurutma adımının ardından gelecek kullanımlar için -20 °C'de saklanabilir.Slaytlar, bu şekilde saklandığında genellikle yıllarca muhafaza edilir.

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir...

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Işık ve elektron mikroskopi için kesit maya kolonileri izin gömmek için bir yöntem. Bu protokol, bir mantar toplum içinde hücre tiplerinin organizasyon anlayışına yönelik yeni bir araç sağlayan koloniler içinde sporulated hücreleri ve pseudohyphal hücrelerin dağılımı belirliyor.

Maya Colony Gömme Yöntemi

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem...

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Fisyon mayası cinsel yaşam döngüsünün uzun süreli mikroskobu için tekrarlanabilir bir temel yöntem sunuyoruz. Açıklanan küçük ayarlamalarla, sunulan protokol, araştırmanın üreme sürecinin farklı adımlarına odaklanmasına izin verir.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Bu protokolün amacı Memeli gastrointestinal sistemde Candida albicans hücre şekli ve lokalizasyonu görselleştirmektir.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Keşfedin maya kromozomlarının yüzey yayma ve immün boyama yöntemlerini, kromozom bağlı proteinleri floresan mikroskopi ile görüntülemek için. Bu teknik genetik ve hücre biyolojisi araştırmalarında değerlidir.

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

Daha fazla video keşfet