Fonksiyonel Araştırmaları 3D İnsan Akciğer Doku Modeli Mycobacterium tuberculosis Enfeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, M tüberküloz enfeksiyonu çalışmaları için bir in vitro akciğer dokusu modeli oluşturmaktır. Bu, önce bir fibroblast kollajen matrisinin bir hücre kültürü plakası ekinin filtresine katmanlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, enfekte olmuş bağışıklık ve akciğer epitel hücreleri fibroblast kollajen tabakası üzerine oturtulur.

Elde edilen 3D doku modeli daha sonra epitelin mukus salgılanmasını ve tabakalaşmasını kolaylaştırmak için havaya maruz bırakılır. Son adımda, doku toplanır ve monte edilir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu, M tüberkülozunun neden olduğu erken granülom oluşumunu analiz etmek için kullanılır.

Bu tekniğin veya in vitro mono hücre tabakası gibi mevcut yöntemlerin temel avantajı, bu sistemdeki hücrelerin 3 boyutlu bir mikro ortamda bulunması ve insan tüberkülozuna benzeyen virülan mikrobakterilerle enfeksiyon üzerine granülom oluşumuna izin vermesidir Kollajen gömülü fibroblastları hazırlamak için, hücreler ayrıldığında akciğer fibroblast hücrelerini 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca tripsin ile tedavi ederek başlayın, Reaksiyonu sekiz mililitre tam DMEM ile durdurun ve ardından hücreleri aşağı doğru döndürün. Peletleri taze dmm'de mililitre başına 230.000 hücrede yeniden süspanse edin ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Ardından, altıya oyuk başına bir uç ekleyin.

Her bir parçaya bir mililitre taze hazırlanmış bir hücresel tabaka karışımını iyice plakalayın ve dağıtın, karışımın herhangi bir hava kabarcığı olmadan tüm parçayı kapladığından emin olun. Ardından plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, ek başına kollajenin pH'ını nötralize etmek için iki mililitre kollajeni 615 mikrolitre premiks ile buz üzerinde steril bir konik tüpte karıştırın.

Daha sonra kollajen karışımına ek başına 58 mikrolitre tam dmem ve 327 mikrolitre akciğer fibroblastı ekleyin. Hücreleri karışım boyunca eşit olarak dağıtmak için yukarı ve aşağı pipetleme. Şimdi, her bir aselüler kollajen tabakasının üzerine, her bir ekin yanından aşağıya doğru üç mililitre hücresel tabaka ekleyin.

Hava kabarcıklarını önlemeye dikkat edin ve plakayı iki saat daha hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Kollajenin polimerizasyonunu takiben, her bir oyuğun dibine iki mililitre tam dmem ekleyin ve plakayı 24 saat daha inkübatöre geri koyun. Ertesi gün, ekleri teker teker dikkatlice kaldırmak için bir çift temiz forseps kullanın ve kültür ortamını her birinin altından aspire edin.

Daha sonra her bir kuyucuğun dibine iki mililitre tam DMM ve her bir parçaya iki mililitre tam DMM ekleyin. Her iki ortam hacmini de beş ila yedi gün boyunca her iki günde bir değiştirmek. Enfekte makrofajları hazırlamak için, bir makrofaj kültürünü virülan M tüberkülozu ile dört saat boyunca 10 enfeksiyon çokluğunda inkübe ederek başlayın.

İnkübasyonun sonunda, hücre dışı bakterileri uzaklaştırmak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve makrofajları 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca iki milimolar, A DTA ile tedavi edin. Hücreler ayrılmış resüse sahip olduğunda, onları antibiyotik içermeyen tam dmm'de askıya alın. Daha sonra tüm ortamı fibroblast kollajen matris plakasından aspire edin ve dış odalara 1.5 mililitre taze antibiyotik içermeyen tam DMM ekleyin.

Daha sonra, floresan etiketli monositleri, enfekte makrofajlarla, ek başına 50 mikrolitre antibiyotik içermeyen tam DM EM'de beşe bir oranında karıştırın. Daha sonra her bir parçanın içine 50 mikrolitre monosit makrofaj karışımı ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun. Bir saat sonra, hücrelerin yerinden çıkmasını önlemek için eklerin duvarlarından aşağı doğru iki mililitre kültürü yavaşça ekleyin ve kültürleri 24 saat daha inkübe edin.

Kültürleri akciğer epitel hücreleri ile tohumlamak için, bağışıklık hücresi fibroblast kollajen matrislerinin üzerine 50 mikrolitre tam dmm'de mililitre başına 4 milyon epitel hücresi ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında iki dakika, ardından 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra, az önce gösterildiği gibi eklere nazikçe iki mililitre antibiyotik içermeyen, tam DMM ekleyin ve hücreleri üç gün daha kültürleyin.

Tohumlamadan beş gün sonra, enfekte makrofajlar tüm kültür ortamını plakadan aspire edin ve dış odalara 1.8 mililitre antibiyotik içermeyen, tam DMM ekleyin. Daha sonra hava, 3D doku modellerini inkübatörde iki gün boyunca maruz bıraktı ve yedinci günde ek parçaya ortam eklemedi. Tohumlama sonrası.

Ortamı plakadan tamamen çıkarın ve doku modellerini karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraldehit ile karıştırın. Daha sonra bir neşter kullanarak, zarları kuyu eklerinden ayırın. Daha sonra, doku modellerinin kenarlarını dikkatlice çıkarmak için temiz bir neşter kullanın ve her dokuyu yaklaşık olarak eşit büyüklükte dört kare parçaya bölün.

Parçaları süper donlu cam slaytlara aktarın ve beş dakika kurumaya bırakın. Daha sonra floresan montaj, ortam içeren anti fade ve dpi kullanarak, dokuları monte edin ve üzerlerini kapak fişleri ile örtün. Slaytları kuruyana kadar karanlıkta oda sıcaklığında bırakın ve ardından kapak fişinin kenarlarını oje ile kapatın.

Cila kuruduğunda, BSL üç tesisinden dışarı transfer için slaytları %70 etanole batırın. Dokuları görselleştirmek için, tüm doku parçasını 512 x 512 çözünürlükte kaplayan beş ila 10 farklı alanın 3D görüntülerini elde edin ve Zack en az 20 mikron kalınlığında ve yığınlar arasında bir ila 1.5 mikron ayrım ile yığınlar arasında bir ila 1.5 mikron ayrım ile hücre kümelerinin 3D nicelleştirilmesi için. 3D görüntü işleme yazılımını açın ve ilgilendiğiniz görüntüyü yükleyin.

Ardından, görüntü ayarlama aracını kullanarak, ses oluşturmayı optimize etmek ve gürültü girişimini en aza indirmek için her kanalı görüntü, kontrast, parlaklık ve karışım opaklığı için ayarlayın. Daha sonra doku yüzeyini görselleştirmek için kırmızı monosit kanalını seçin ve kırmızı monositlerin seçimini kısıtlamak veya gerektiğinde arka planı hariç tutmak için filtreleri kullanarak uygun eşikleri ayarlayın. Son olarak, daha fazla aşağı akış analizi için verileri uygun elektronik tablo programına aktarın.

Yedinci günde, M tüberkülozu ile enfekte hücre tohumlama sonrası konfokal mikroskopi, granülom 3D olarak bilinen insan tb lezyonlarını taklit eden yeşil bakterilerin varlığıyla belirtildiği gibi, enfeksiyon bölgesinde kırmızı monositlerin bir kümelenmesini ortaya çıkarır. Görselleştirme, çeşitli özelliklerle etkileşim kurma, inceleme ve nicelik belirleme esnekliği sağlar. Örneğin, bu görüntülerde em tüberküloz bölgesinde bir monosit kümesini gösteren bir 3D görüntü.

Yeşil bakteri ve kırmızı monosit kümelerinin uzamsal düzenlemesi apikal, rotasyonel ve yanal görünümlerden gözlemlenebilir. Beklendiği gibi, bu kümeler enfekte olmamış dokularda gözlenmedi. Monosit, hücre kümeleri ve M tüberkülozu ile enfekte olmuş dokuların büyüklüğü ve sayısının ölçülmesi, hücre kümelerinin boyutunun arttığını, tek tek monositlerin sayısının ise enfekte olmayan doku modellerine kıyasla azaldığını ortaya koymuştur.

Bu akciğer dokusu modelinin potansiyel kullanıcıları arasında, tüberkülozda farklı bağışıklık hücrelerinin ve doku bağışıklığının rolünün incelenmesi, mikobakteri fenotiplerinin incelenmesi ve granülom içindeki mikobakterileri öldüren ilaç adaylarının test edilmesi yer alır.