Name: Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Keşfedin bakteriyel piomelanin üretiminde NTBC inhibisyonunu ve oksidatif stres duyarlılığı artışını mikrobiyoloji ve antimikrobiyal direnç araştırmalarında. Bu yöntem enfeksiyon tedavisi stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, suşlara cömert katkıları için Dara Frank ve Carrie Harwood'a teşekkür eder. Wisconsin Üniversitesi Milwaukee Araştırma Vakfı, 8,354,451 numaralı patente sahiptir; 2-[2-nitro-4- (triflorometil)benzoil]-1,3-sikloheksandion (NTBC) gibi bir 4-hidroksifenilpiruvat dioksijenaz inhibe edici bileşik uygulayarak bir hastada bir mikroorganizmanın enfeksiyonunun ilerlemesini tedavi etmeye veya inhibe etmeye yönelik iddialarla. Mucitler Graham Moran ve Pang He'dir. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R00-GM083147) tarafından desteklenmiştir. Washington Üniversitesi P. aeruginosa transpozon mutant kütüphanesi NIH P30 DK089507 tarafından desteklenmektedir.

Kültür Ortamı Antibiotics hazırlanması 1. ve 2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil] -1,3-sikloheksandion (NTBC) <ol><li> Uygun birimlere LB suyu (% 1 Tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.25 NaCl, H 2 O) ve kısım sağlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayınız. </li><li> 100 ml LB agar (% 1 tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.25 NaCl, H2 O% 1.5 ağar) 250 ml&#39;lik şişelere sağlayın. Oda sıcaklığında otoklav ve mağaza tarafından sterilize edin. Agar tabak içine dökülmeden önce eritilir emin olun. Not: 4 plakayı verecektir LB agar 100 ml ihtiva eden şişeler. LB agar miktarı tayini için gereken levha sayısı uygun şekilde değiştirilebilir. </li><li> (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16 PBS sağlayın. Oda sıcaklığında otoklav veya filtrasyon ve mağaza tarafından sterilize edin. </li><li> Gentamisin antibiyotik stok çözümleri hazırlayın, kanamisin, bird tobramisin. <ol><li> P. uygun antibiyotik stok konsantrasyonları hazırlayın 100 mg / ml gentamisin, 30 mg / ml kanamisin ve 10 mg / ml tobramisin ihtiva eden aeruginosa suşu. 4 ° C&#39;de su, filtre ile sterilize (0,2 um) ve deposunda antibiyotik çözülür. Çalışılan bakteriye bağlı antibiyotik ve konsantrasyonları değiştirin. </li></ol></li><li> NTBC stok çözümleri hazırlayın. DMSO 400 ul NTBC 10 mg eritin. Bu 75,9 mM NTBC bir konsantrasyon elde edilir. -20 ° C&#39;de saklayın NTBC stok çözümleri. Oda sıcaklığında çözülme çözümler gerektiği gibi. NOT: NTBC Farklı kaynaklardan çözünürlüğündeki farklılıklar var. Üreticinin önerilerine dayanan NTBC çözülür ve Adım 1.5 buna göre ayarlamak için hangi uygun araç belirleyin. </li></ol> 2. Bakteriyel Suşlarının NTBC Titrasyonları <ol><li> Suşların kurmak gecede kültürleri test edilecek. 2 ml LB suyu 16 x 150 mm test tüpünü ekles (suş başına bir tane) ve her bir suş 1 izole koloni aşılamak. Bir hava kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator havalandırma ile 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, LB suyu NTBC arasında titrasyonları hazırlar. Farklı suşları NTBC duyarlılık farklılıkları beri 0&#39;dan 900 mcM NTBC bir başlangıç ​​aralığı kullanın. <ol><li> Suş başına 4 ila 5 test tüpleri (16 x 150 mm) 1 ml LB suyu ekleyin. </li><li> Bir konsantrasyon aralığında test tüpleri (16 x 150 mm) NTBC stok solüsyonu (75,9 mM) eklenir. LB brot, 1 ml eklemek NTBC konsantrasyonları ve karşılık gelen hazır hacimleri için Tablo 1&#39;e bakınız. </li></ol></li><li> Gece boyunca kültürler OD 600 ölçün. Medyada mevcut pyomelanin ortadan kaldırmak için OD 600 okuma almadan önce kültürleri yıkayın. <ol><li> 2 dakika boyunca 16.000 x g&#39;de bir mikrosantrfuj kültür 1 ml santrifüj edilerek kültürleri yıkayın. Süpernatantı ve herhangi gevşek pelet hücreleri ile kaldırBir mikropipet ve 1 ml LB katı hücre pelletini </li></ol></li><li> OD 600 0.05 titrasyon tüpleri inoküle edin. Tüpleri aşılamak için gerekli yıkanmış kültür miktarını hesaplayın. NOT: Bu olmamalı pyomelanin beri ekimlerde için yıkanmış kültürleri kullanın. </li><li> Havalandırma, bir kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator kullanılarak 37 ° C sıcaklıkta yaklaşık 24 saat için titrasyon inkübe edin. </li><li> Titrasyon tüpleri fotoğraf ve MIC ve oksidatif stres testleri için kullanmak NTBC miktarını belirlemek için içinde ve suşları arasında pigment üretimini karşılaştırın. Hücre içermeyen kültür süpernatanında pyomelanin miktarını belirlemek ve hücre yoğunluğu belirlemek için OD 600 değerlendiriniz. Not: hücrelere kültür yüzey maddesinde pyomelanin OD 600 oranı NTBC ile muamele edildikten sonra pyomelanin üretim farklılıkları ölçmek için hesaplanabilir. </li></ol> 3. Antibiyotik Asgari inhibitörlerinin96 oyuklu plakalar içerisinde edici Konsantrasyon (MİK) Deneyi <ol><li> Suşların ayarlama gece boyunca kültürler ile NTBC olmadan LB içinde test edilmelidir. NOT: Bu protokol, 300 mcM NTBC temsilcisi seviyesini kullanarak tarif edilir. Kullanılacak NTBC uygun düzey Aşama 2,6 belirlenir. <ol><li> 2 ml LB 300 uM NTBC ekleme Herhangi bir NTBC durum için 2 ml LB araç (DMSO), eşdeğer bir hacim. </li><li> Steril kürdan kullanarak, bakteri, bir izole edilen bir koloninin Tüpleri inoküle. NTBC ile tek kültür ve her bir suş için NTBC olmadan tek kültür olacak. Havalandırma, bir kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator kullanılarak 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li> Ertesi gün, MIC tahlil kurmak için LB + NTBC ve LB + DMSO usta çözümleri yapmak. Aşı ilave edildiğinde, bu da 600 uM bir konsantrasyonda NTBC ekleyin 300 uM&#39;lik bir nihai konsantrasyon verecek şekilde, iki kat seyreltilmiş olacaktır. <ol><li> Bir antibi test etmek içintek zorlanma, 2 ml LB 600 mcM NTBC ekleyebilir ve NTBC ana çözüm yapmak mix otik. 2 ml LB araç (DMSO), eşdeğer bir hacim ilave edin ve herhangi bir NTBC ana çözelti yapmak için karıştırın. Antibiyotik stok solüsyonları oluşturmak için hem de 96-yuvalı plakalar içinde bir seyreltme serisi ayarlamak için bu çözüm kullanın. NOT: Master çözüm formülasyonları pipetleme hataları hesaba ekstra bir çözüm sağlayacaktır. Test antibiyotik ve suşların sayısına bağlı olarak gerektiği gibi usta çözümleri yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir edilebilir. </li></ol></li><li> LB + NTBC veya LB + DMSO usta çözümleri antibiyotik çözümler hazırlayın. Not: Bu çözeltiler antibiyotik konsantrasyonu iki istenen son konsantrasyonu olmalıdır. Yeterli çözelti 96 oyuklu bir plaka içerisinde dört gözeneğe 100 ul aktarma yapılmalıdır. <ol><li> Gentamisin +/- 64 ug / ml NTBC stok çözelti hazırlayın. 450 gentamisin stokunun 0.288 ul (100 mg / ml) ekleyin, bu çözüm yapmakul LB + NTBC veya LB + DMSO ana çözüm. NOT: P. gentamisin maksimum konsantrasyon aeruginosa PAO1 32 ug / ml&#39;dir. </li><li> Kanamisin +/- 256 ug / ml NTBC stok solüsyonu olun. 450 ul LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözümlere kanamisin stokunun 3,84 ul (30 mg / ml) ekleyin, bu çözüm yapmak için. NOT: P. kanamisin maksimum konsantrasyon aeruginosa PAO1 128 ug / ml&#39;dir. </li><li> Tobramisin +/- 8 ug / ml NTBC stok çözelti hazırlayın. Bu çözelti yapmak 450 ul LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözümlere tobramisin stokunun 0,36 ul (10 mg / ml) ekleyin. NOT: P. İçin aeruginosa PAO1 tobramisin maksimum konsantrasyonu 4 ug / ml&#39;dir. Not: Test edilecek bakteriler için antibiyotikler ve konsantrasyonlar ayarlanabilir. </li></ol></li><li> Bir 96-yuvalı plaka içinde dört gözeneğe her 2x antibiyotik çözeltisinin 100 ul ekle. Exampl için satır A&#39;da bu çözümleri yerleştirine, gentamisin A4 boyunca A1 yerleştirilmelidir, kanamisin A8 ile A5 yerleştirilmelidir ve tobramisin A12 ile A9 yerleştirilmelidir. Kurmak 96 oyuklu bir plakanın şeması için Şekil 1A bakınız. Not: Çoklu antibiyotik bir plaka olarak test edilebilir, ancak yalnızca tek bir suş başka türlerden gelen çapraz kirlenme ihtimalinin ortadan kaldırılması için plaka başına test edilmelidir. </li><li> 96 oyuklu plakanın H den satır B LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözeltisi 50 ul ekle. Bu bir tabak olun LB + NTBC ve bir tabak LB + DMSO olduğunu. Şekil 1A bakınız. <ol><li> LB + antibiyotiklerin NTBC LB + NTBC kullanın. LB + DMSO antibiyotikler için LB + DMSO kullanın. </li></ol></li><li> Bir mikropipet pipet ipuçları değiştirmek, B. karıştırın çözüm satır satır A solüsyonu 50 ul aktararak antibiyotik iki kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek kullanarak ve satır B solüsyonu 50 ul transferi C. tekrarlayın satır remaining satırlar. Satır G sulandırarak sonra o satır ve artıklar gelen çözelti 50 ul çıkarın. Bakteriyel büyüme için hiçbir antibiyotik kontrol olarak satır H kullanın. Şekil 1B bakınız. NOT: G aracılığıyla her biri iyi satırlarda A şimdi 2X LB + NTBC veya LB + DMSO antibiyotiğin 50 ul nihai istenen konsantrasyon içerir. Satır H hiçbir antibiyotik LB + NTBC veya LB + DMSO içerir. </li><li> Gece boyunca kültürler OD 600 ölçün. Medyada mevcut pyomelanin ortadan kaldırmak için OD 600 okuma almadan önce tüm kültürleri yıkayın. <ol><li> 2 dakika boyunca 16.000 x g&#39;de bir mikrosantrfuj kültür 1 ml santrifüj edilerek kültürleri yıkayın. Bir mikropipetöre ile Süpernatantı ve 1 ml LB hücre pelletini </li></ol></li><li> LB içinde 2.75x10 5 CFU / ml gecede kültürleri sulandırınız NOT: Bir OD 600 adet P. 1x10 9 CFU / ml eşdeğer olduğunu varsayalım aeruginosa. CFU / ml dönüşümleri OD d edilebilirDiğer bakteri ifferent. </li><li> Uygun kuyuya seyreltilmiş bakteri kültürü 50 ul ekleyin. Not: NTBC yetiştirilen kültürler DMSO içinde yetiştirilen NTBC ve kültürler DMSO ihtiva eden oyuklara ilave edilmelidir içeren oyuklara ilave edilmelidir. Şekil 1B bakınız. <ol><li> Her bir suş ve antibiyotik konsantrasyonu için üç kuyu bakteriler ekleyin. Bakteriyel kontaminasyon için bir kontrol olarak hareket etmek dördüncü kuyuya LB 50 ul ekleyin. Şekil 1B bakınız. </li><li> Boşlukların aşılanması için çok kanallı bir micropipettor kullanın. Komşu kuyuların kirlenmesini önlemek için inokulum eklerken ipuçları kuyuların dibine yakın olduğu pipet olun. NOT: kuyulara bakteri kültürü eklemek antibiyotik ve NTBC yoğunluklanyla iki kat sulandırmak olur. </li></ol></li><li> Parafilm, 96 gözlü levhalar kapatılır ve 37 ° C&#39;de yaklaşık 24 saat inkübe edilir. Bir hava kuluçka makinesi içinde, statik 96 oyuklu inkübe edin. </li><li> Incelemekkuyularda bakteriyel büyüme için plakalar. MIC bakteriyel büyüme her suşun her üç kopya için görülebilir olduğu en düşük antibiyotik konsantrasyonu. <ol><li> Görme büyüme için plaka incelemek veya OD 600 plaka okuyucu seti kullanarak okuyun. </li></ol></li></ol> Oksidatif Stres Tepki için 4. Nokta Plaka Testi <ol><li> Aşama 3.1&#39;de tarif edildiği gibi suşların ayarlama gece boyunca kültürler NTBC LB ve olmaksızın test edilecek. </li><li> Sonraki gün, bir oksitleyici zor olarak H2O 2 ihtiva eden LB agar plakaları hazırlamak. 0 ila 1 mM, H bir dizi 2 O 2 konsantrasyonları için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. <ol><li> LB agar şişeler eritin. Oda sıcaklığında, yaklaşık 50 ° C&#39;ye soğutun ortam. </li><li> Arzu edilen konsantrasyonlarda soğutuldu ortam doğrudan O 2 H 2 ekleyin. Girdap şişeler karıştırın. H konsantrasyonları için Tablo 2&#39;ye bakınız 2 O 2ve konsantre H 2 O 2 hacimleri ekleyin. Bu değerler, LB agar 100 ml dayanmaktadır. </li><li> Hemen kabarcıklarını çıkarmak için H 2 O 2 ve alev yüzeyi ekledikten sonra plakaları dökün. Verim LB agar 100 ml başına 4 plakalarının. H 2 O 2 konsantrasyonu ile plakaları işaretleyin. </li><li> Plakalardan fazla nemi çıkarmak için 30 dakika boyunca çalışan fan ile biyolojik akış kaputu ele tabak yerleştirin. NOT: tabak onlar hazırlanır aynı gün kullanın. Bunu yapmamak tutarsız verileri neden olabilir. NOT: paraquat oksidatif stres, bu tahlilde, H2O 2 ikame edilebilir. Diğer oksidatif stres için kullanılan konsantrasyonlar, H2O 2 için kullanılanlardan farklı olabilir. </li></ol></li><li> Yıkayın ve adım 3.7&#39;de açıklandığı gibi OD gecede kültürlerin 600 ölçün. </li><li> Bütün gece boyunca cu OD 600 Normalesuşları seti için en düşük değere ltures denenmektedir. P. aeruginosa genel LB + NTBC ya da LB + DMSO içinde gece boyunca büyütülmüştür, yaklaşık 2.5 OD 600 yer alır. <ol><li> 1 ml &#39;lik bir toplam hacim içinde düşük OD 600 kültürün seyreltilmesi için ihtiyaç duyulan kültür hacminin belirlenmesi. Bir kültür OD 3 600 ve suşlar grubu için en düşük OD 600 yer alır, örneğin, 2.5 olan aşağıdaki hesaplamayı gerçekleştirmek: (2.5) (1 mi) = (3) (x). x = 0.833 mi. Kültür 0,833 ml kadar bir mikrofüj tüpüne yerleştirilir. </li><li> 1 ml kültür hacmi getirmek için gerekli LB + NTBC (300 uM) ya da LB + DMSO miktarını hesaplayın. Aşama 4.4.1 Örneğin, LB + NTBC ya da LB + DMSO miktarı 0,167 ml (- 0,833 ml kültür, 1 ml toplam hacim) olacak kültüre ilave edildi. LB + NTBC ve LB + DMSO stok çözeltileri, tüm suşları seyreltilmesi için gerekli hacme dayanarak bu dilüsyonları için kullandığınızdan emin olun. </li><li> Kültür ve LB + N MixVorteks TBC veya LB + DMSO. </li></ol></li><li> NTBC veya DMSO sabit bir konsantrasyonda kültürleri korumak için, PBS + NTBC veya PBS + DMSO normalize gece boyunca kültürler on kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek. <ol><li> PBS + NTBC ve PBS + DMSO stok çözümleri olun. Bir suşu için seyreltileri bir set için, 720 ul bir toplam hacim elde etmek üzere 300 uM NTBC veya PBS ile eşdeğerli bir DMSO hacmi karıştırın. Test kaç suşları bağlı yukarı veya aşağı bu stokları Scale. </li><li> 10 -7 seri seyreltme ile 10 -1 Label mikrofuge&#39;de tüpleri. Uygun tüplere PBS + NTBC veya PBS + DMSO 90 ul ekle. LB + NTBC yetiştirilen suşları için PBS + NTBC kullanımı ve LB + DMSO içinde yetiştirilen suşları için PBS + DMSO kullanılır. </li><li> Uygun 10 -1 seyreltme tüp kültür 10 ul ekleyin. Vorteks karıştırın ve 10 -2 seyreltme tüpüne 10 -1 seyreltme 10 ul aktarın. Tüm seyreltmeler perfo olmuştur kadar tekrarlayınonaylanmamis. Seyreltilerde arasındaki pipet ipuçları değiştirin. </li></ol></li><li> Her bir suş için kopya halinde LB + H 2 O 2 plakaları üzerinde 10 -7 seyreltileri 10 -3 Spot 5 ul. Noktalar kaplanır, en az seyreltilmiş (10 -7 -3 10) sulandırmak itibaren bir pipet ucu kullanın. İpucu veya sıvı plakasına kuruyana kadar plaka eğmeyin. </li><li> Suşuna bağlı olarak 37 ° C&#39;nin (hava kuluçka makinesinde) de 24-48 saat süreyle inkübe edin. NOT: P. aeruginosa PAO1 inkübasyon 24 saat sonra LB iyi ölçekli koloniler olacaktır. Bunlar koloniler PAO1 ile yaklaşık olarak aynı boyuta sahip olana kadar suşları inkübe edin. </li><li> Bir transluminator üstünde bir CCD kamera kullanarak plakaları fotoğrafını. İsteğe bağlı olarak, aynı boyutta aksine ve ekme için fotoğraflarınızı düzenleyebilir. Oksidatif strese duyarlılık değişiklikleri belirlemek için her yerde koloni sayısını sayın. </li></ol>

<ol><li>Rodriguez-Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+hmgA++of+Pseudomonas+aeruginosa++to+pyomelanin+hyperproduction%2C+stress+resistance+and+increased+persistence+in+chronic+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection.</a> Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).</li>
<li>Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia++Produces+a+Pigment+with+Antioxidant+Properties+Using+a+Homogentisate+Intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate.</a> J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).</li>
<li>Schmaler-Ripcke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pyomelanin%2C+a+Second+Type+of+Melanin%2C+via+the+Tyrosine+Degradation+Pathway+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).</li>
<li>Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+Function+of+Pyomelanin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers+In+Tech%22%5BJournal%5D)">Properties and Function of Pyomelanin.</a> Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).</li>
<li>Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chemicals+to+melanins+re-examined%3A+adsorption+of+some+drugs+to+the+surface+of+melanin+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles.</a> Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).</li>
<li>Barza, M., Baum, J., Kane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+antibiotic+activity+in+vitro+by+synthetic+melanin%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin.</a> Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Melanin+on+Microbial+Virulence+and+Clinical+Resistance+to+Antimicrobial+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).</li>
<li>Arias-Barrau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Homogentisate+Pathway%3A+a+Central+Catabolic+Pathway+Involved+in+the+Degradation+of+L-Phenylalanine%2C+L-Tyrosine%2C+and+3-Hydroxyphenylacetate+in+Pseudomonas+putida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida.</a> J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).</li>
<li>Ernst, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+mosaicism+is+conserved+but+not+unique+in+Pseudomonas+aeruginosa++from+the+airways+of+young+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis.</a> Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).</li>
<li>Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+tyrosine+degradation+in+Vibrio+cholerae++The+strain+ATCC+14035+as+a+prokaryotic+melanogenic+model+of+homogentisate-releasing+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).</li>
<li>Hunter, R. C., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Putative+ABC+Transporter%2C+HatABCDE%2C+Is+among+Molecular+Determinants+of+Pyomelanin+Production+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).</li>
<li>Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NTBC+treatment+of+the+pyomelanogenic+Pseudomonas+aeruginosa++isolate+PA1111+inhibits+pigment+production+and+increases+sensitivity+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress.</a> Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).</li>
<li>Kavana, M., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+%284-Hydroxyphenyl%29pyruvate+Dioxygenase+with+the+Specific+Inhibitor+2-%5B2-Nitro-4-%28trifluoromethyl%29benzoyl%5D-1%2C3-cyclohexanedione%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione.</a> Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).</li>
<li>Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+melanin-overproducing+transposon+mutants+of+Pseudomonas+putida+F6%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6.</a> FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Roy-Burman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+is+associated+with+death+in+lower+respiratory+and+systemic+Pseudomonas+aeruginosa+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections.</a> J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).</li>
<li>Jacobs, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).</li>
<li>Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanogenesis+in+dermatophyte+species+in+vitro++during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection.</a> Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).</li>
<li>Khajo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Melanized+Cryptococcus+neoformans+Lethal+Dose+Gamma+Irradiation+Involves+Changes+in+Melanin%27s+Chemical+Structure+and+Paramagnetism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism.</a> PLoS ONE. 6, e25092(2011).</li>
<li>Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from:
	 
 <a target="_blank" href="http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm">http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm</a> (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokolde açıklanan NTBC titrasyon yöntemi, kullanıcının NTBC'nin bakterilerde pyomelanin üretimini azaltıp azaltamayacağını veya ortadan kaldırıp kaldıramayacağını belirlemesine ve gerekli NTBC konsantrasyonunu belirlemesine olanak tanır. NTBC titrasyon testindeki en kritik adım, testte kullanılacak NTBC konsantrasyonlarının aralığını belirlemektir. Farklı P. aeruginosa suşları NTBC'ye karşı farklı duyarlılıklara sahiptir ve laboratuvar suşları NTBC'ye klinik izolatlardan12 daha duyarlı olabilir ...

Pseudomonas aeruginosa, oksidatif stres1-4'ten koruma sağlamaya yardımcı olan ve aminoglikozit antibiyotikler5-7 dahil olmak üzere çeşitli bileşikleri bağlayan kırmızı-kahverengi bir pigment olan pyomelanin dahil olmak üzere çeşitli pigmentler üreten Gram negatif bir bakteridir. Piyomelanin üretimi, homogentizat 1,2-dioksijenaz (HmgA)1,9'u kodlayan genin delesyonları veya mutasyonları yoluyla veya yol10'daki çeşitli enzimlerdeki dengesizlikler yoluyla tirozin katabolizma yolu4,8'deki bir kusurdan kaynaklanır. Homogentizat, HmgA'nın inaktivasyonu nedeniyle birikir ve pyomelanin11 oluşturmak üzere salgılanır ve oksitlenir. Pyomelanin üretimi, tirozin katabolizma yolağında 4-hidroksifenilpiruvat dioksijenazı (Hpd) inhibe eden herbisit 2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil]-1,3-sikloheksandion (NTBC) 12 ile muamele yoluyla doza bağlı bir şekilde ortadan kaldırılabilir veya azaltılabilir. Hpd, homojenizat oluşumu için gereklidir ve bu nedenle pyomelanin11. 
P. aeruginosa'nın pyomelanin üreten suşlarının NTBC tedavisi çalışmalarımızda önemli olan üç tekniği ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu teknikler arasında, laboratuvar ve klinik pyomelanin üreten suşlarda pyomelanin üretimini ortadan kaldıracak veya azaltacak konsantrasyonları belirlemek için NTBC titrasyonu, bakteriler NTBC ile tedavi edildiğinde antibiyotiklerin minimum inhibitör konsantrasyonunun (MIC) belirlenmesi ve NTBC tedavisi ile oksidatif strese karşı ortaya çıkan duyarlılık yer almaktadır.
Geliştirdiğimiz titrasyon testi iki amaca hizmet eder. İlk olarak, tahlil, kullanıcının NTBC'nin incelenen bakteride pyomelanin üretimini ortadan kaldırıp kaldıramayacağını veya azaltıp azaltamayacağını ve hangi konsantrasyonlarda olduğunu belirlemesine izin verecektir. Bu, kullanıcının NTBC'ye duyarlılığı belirlemesine izin verecektir, çünkü P. aeruginosa12'de gözlemlendiği gibi, farklı bakteri türleri bu bileşiğe karşı farklı hassasiyetlere sahip olabilir. İkinci olarak, NTBC titrasyon testi, amaç pyomelanin üretimini ortadan kaldırmak veya azaltmak ve pigment azaltmanın etkilerini belirlemekse, kullanıcının antibiyotik MIC ve oksidatif stres yanıtı testleri gibi sonraki deneylerde kullanmak üzere uygun NTBC konsantrasyonunu belirlemesine izin verecektir. 
Titrasyon testi işe yarar çünkü NTBC ile tedavi edilen suşlarda pyomelanin üretiminde gözle görülür bir fark görülebilir ve piyomelanin üretimindeki farklılıklar doza bağlıdır12. Ek olarak, bu teknik, bakterilerde pigment üretimini ortadan kaldırabilecek veya artırabilecek diğer bileşiklerin incelenmesine uygulanabilir.
Antibiyotik MİK'ler, bakterilerin antibiyotiklere duyarlılığını belirlemek için kullanılır. Agar seyreltme plakaları ve et suyu seyreltmeleri14 dahil olmak üzere MIC'leri belirlemek için çeşitli yöntemler vardır. Et suyu seyreltmeleri, küçük test tüplerinde veya 96 oyuklu bir mikrotitre plakasında gerçekleştirilebilir. Burada açıklanan MIC tayininde kullanılan mikrotitre plaka yöntemi, kullanıcının minimum kaynak kullanarak çok çeşitli antibiyotikleri test etmesine olanak sağlayacaktır. Test, bu yöntemle test edilen antibiyotik ve suş sayısında esnekliğin yanı sıra tekrarlanabilirlik sağlar. Ek olarak, NTBC'nin teste dahil edilmesiyle, kullanıcı, pyomelanin üretiminin ortadan kaldırılmasının veya azaltılmasının pyomelanin üreten bakterilerde antibiyotik duyarlılığını değiştirip değiştirmediğini belirleyebilir.
Oksidatif strese bakteriyel yanıt çeşitli şekillerde test edilebilir. Açıklanan en yaygın yöntemler, bir süre boyunca oksidatif strese maruz kalan canlı bakteri sayıları1 veya oksidatif stres diski difüzyon deneyleridir15. Bu yöntemler, bakterilerde oksidatif stresin etkilerini incelemek için yüksek konsantrasyonlarda oksidatif stresörler kullanma eğilimindedir ve sonuçlar biyolojik kopyalar arasında oldukça değişken olabilir. Uygulanabilir sayım tahlili ayrıca diğer yöntemlerden daha fazla agar plakası kullanma eğilimindedir. Tanımladığımız nokta plakası testi, düşük konsantrasyonlardaH2O2kullanır ve kullanıcının minimum plaka kullanarak çoklu suşların oksidatif stres tepkisini test etmesine olanak tanır. Tahlil ayrıca teknik ve biyolojik kopyalar arasında tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir. Piyomelanin oksidatif strese karşı dirençte rol oynadığından, NTBC'nin teste dahil edilmesi, kullanıcının pyomelanin üretiminin ortadan kaldırılmasının oksidatif stres direnci üzerindeki etkilerini belirlemesine olanak tanır.

<table><tbody><tr><td>2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil] -1,3-sikloheksandion (NTBC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>Ayrıca nitinon olarak da adlandırılır. DMSO'da çözünür.</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>ağırlıkça %30 H2O.&nbsp; Stabilize.</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Altın Bio</td><td>G-400-100</td><td>H2O.&nbsp; Filtre sterilize eder.</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>H2O.&nbsp; Filtre sterilize eder.</td></tr><tr><td>Tobramisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>H2O.&nbsp; Filtre sterilize eder.</td></tr></tbody></table>

yöntemler bakteriyel pyomelanin Üretim ønhibe ve oksidatif stres duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin, çeşitli bakteri ve mantar türleri tarafından üretilen hücre dışı kırmızı-kahverengi bir pigmenttir. Bu pigment, tirozin katabolizma yolundan türetilir ve oksidatif stres direncinin artmasına katkıda bulunur. Pseudomonas aeruginosa'da pyomelanin üretimi, 2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil]-1,3-sikloheksandion (NTBC) ile muamele yoluyla doza bağlı bir şekilde azaltılır. Bakterilerde pyomelanin üretimini azaltacak veya ortadan kaldıracak ilaç konsantrasyonunu belirlemek için çoklu NTBC konsantrasyonları kullanan bir titrasyon yöntemini tarif ediyoruz. Titrasyon yöntemi, artan ilaç konsantrasyonları ile pigment üretiminde gözle görülür bir azalma gibi kolayca ölçülebilir bir sonuca sahiptir. Ayrıca bakterilerde antibiyotik minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) test etmek için bir mikrotitre plaka yöntemi de tarif ediyoruz. Bu yöntem minimum kaynak kullanır ve bir bakteri türü için bir mikrotitre plakasında birden fazla antibiyotiği test etmek için kolayca ölçeklendirilebilir. MIC testi, antibiyotik olmayan bileşiklerin belirli konsantrasyonlarda bakteri üremesi üzerindeki etkilerini test etmek için uyarlanabilir. Son olarak, H2O2'yi agar plakalarına dahil ederek ve plakalar üzerinde çoklu bakteriseyreltmelerini tespit ederek oksidatif strese karşı bakteriyel duyarlılığı test etmek için bir yöntem tarif ediyoruz. Oksidatif strese duyarlılık,H2O2 içermeyen bir H2O 2kontrolüne kıyasla H 2 O2 içeren plakalar üzerindeki farklı seyreltmeler için koloni sayısı veboyutundaki azalmalarla gösterilir. Oksidatif stres nokta plakası testi, minimum kaynak ve düşük konsantrasyonlardaH2O2kullanır. Daha da önemlisi, aynı zamanda iyi bir tekrarlanabilirliğe sahiptir. Bu nokta plakası testi, bileşikleri agar plakalarına dahil ederek ve ortaya çıkan bakteri büyümesini karakterize ederek çeşitli bileşiklere bakteri duyarlılığını test etmek için uyarlanabilir.

NTBC titrasyonları NTBC P. pyomelanin üretimini azaltmak mümkün olsaydı NTBC titrasyonları belirlemek için kullanıldı aeruginosa ve aynı zamanda ortadan kaldırır ya da ek tahlillerinde kullanım için üretim pyomelanin azaltır NTBC konsantrasyonunu belirler. Farklı tekrarlamalı üretilen pyomelanin seviyelerindeki varyasyonlar olabilir, ama genel eğilimler sabit kalabilir. NTBC titrasyon testi, diğer bakterilerde pigment üretiminin etkileyebilecek diğer bileşikleri test etmek ...

Bakteriyel pyomelanin üretimi, oksidatif strese ve virülansa karşı direncin artmasına neden olur. Pyomelanin üretiminin inhibisyonunu belirlemek ve bakterilerde oksidatif strese duyarlılıkta ortaya çıkan artışı test etmek ve ayrıca antibiyotik minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirlemek için kullanılabilecek teknikleri rapor ediyoruz.

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Aşağıdaki deneylerin genel amaçları, NTBC'nin P melanin üretimi ve oksidatif strese duyarlılığın yanı sıra antibiyotik minimum inhibitör konsantrasyonları veya MIC'ler üzerindeki etkilerini belirlemektir. Bu, ikinci bir adım olarak p melanin üretimini azaltan konsantrasyonu belirlemek amacıyla bakteriyel kültürlere NTBC eklenerek gerçekleştirilir. Bakteriyel kültürler, NTBC ve antibiyotikler ile işleme tabi tutulur; bu işlem, kullanıcının NTBC uygulamasının antibiyotik MIC'leri üzerinde bir etkisi olup olmadığını belirlemesine olanak tanır.NTPC ile işlem görmüş kültürler, NTPC tedavisine karşı duyarlılığı belirlemek amacıyla hidrojen perokside maruz bırakılır; oksidatif stres yanıtı spot plakları ve mikrotitrasyon MIC analizlerinden elde edilen sonuçlar, genik bakterilerin NTPC ile işlenmesinin pigment üretiminde azalmaya yol açtığını ve oksidatif strese karşı duyarlılığı artırdığını, ancak antibiyotik MIC değerleri üzerinde herhangi bir etkisi olmadığını göstermektedir. Oksidatif stres spot plak tekniğinin, canlı sayımı ve disk difüzyon analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, diğer analizlerde kullanılan yüksek hidrojen peroksit konsantrasyonları yerine daha düşük konsantrasyonların kullanılabilmesidir. Genellikle, antibiyotik MIC değerlerini belirleme yöntemimize yeni başlayan kişiler, pipetleme tekniğindeki hassasiyet eksikliğinin tekrarlar arasında değişkenliğe yol açması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.Bu değişkenlik, antibiyotiğin MİK değerinin doğru bir şekilde belirlenmesini zorlaştırabilir. MİK analizinden bir gün önce, test edilecek suşların kültürlerini LB içinde, katkı maddeli ve katkısız olarak hazırlayın.2,4-dinitro-2',4'-dinitrophenylcyclohexane-1,3-dion veya NTBC. Bu demonstrasyonda temsilci düzey olan 300 µM NTBC kullanılmıştır. Uygun NTBC konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan titrasyon yöntemi protokol metninde açıklanmıştır; kültürleri 37 °C'de, havalandırma ile gece boyunca inkübe edin ve bir sonraki güne geçin.Bir suş için bir antibiyotiği test etmek amacıyla, MIC analizi için 2 mL LB'ye 600 µM NTBC ekleyerek LB artı NTBC ve LB artı DMSO stok çözeltilerini hazırlayın ve karıştırın. NTBC stok çözeltisini hazırlamak için; inokülm eklendiğinde iki kat seyrileceği için NTBC 600 µM konsantrasyonda eklenir.300 micromolar nihai konsantrasyon elde etmek için, iki mililitre LB'ye eş hacimde taşıyıcı DMSO ekleyin ve NO NTBC ana çözeltisini oluşturmak için karıştırın. Bu iki ana çözelti, hem antibiyotik stok çözeltilerinin hazırlanmasında hem de 96 kuyucuklu plakalarda dilüsyon serilerinin oluşturulmasında kullanılacaktır. Ardından, antibiyotik çözeltilerini LB artı NTBC veya LB artı DMSO ana çözeltileri içerisinde hazırlayın.Gentamycin artı veya eksi NTBC stok çözeltisini 64 µg/mL konsantrasyonda hazırlayın. KANAMYCIN artı veya eksi NTBC stok çözeltisini 256 µg/mL konsantrasyonda hazırlayın. Tobramycin artı veya eksi NTB stok çözeltisini 8 µg/mL konsantrasyonda hazırlayın.2x antibiyotik çözeltileri hazırlandıktan sonra, 96 kuyucuklu bir plakanın A sırasındaki kuyucuklara her bir antibiyotik çözeltisinden 100 µL ekleyin. Örneğin, gentamycin 1'den 4'e kadar olan kuyucuklara, kanamycin 5'ten 8'e kadar olan kuyucuklara ve tobramycin 9'dan 12'ye kadar olan kuyucuklara yerleştirilmelidir. 96 kuyucuklu plakanın B'den H'ye kadar olan sıralarına 50 µL LB+NTBC veya LB+DMSO ana çözeltisi ekleyin; bir plakanın LB+NTBC, diğer plakanın ise LB+DMSO olduğundan emin olun. Bir mikropipet kullanarak, A sırasındaki çözeltiden B sırasına 50 µL aktararak antibiyotiklerin iki katlı seri dilüsyonlarını gerçekleştirin. Çözeltiyi karıştırın, pipet uçlarını değiştirin ve B sırasındaki çözeltiden C sırasına 50 µL aktarın. G sırasını seyrelttükten sonra geri kalan sıralar için işlemi tekrarlayın. O sıradaki çözeltiden 50 µL alarak atın.Bakteriyel büyüme için H sırasını antibiyotiksiz kontrol olarak kullanın. Besiyerinde bulunan lanini gidermek için tüm kültürleri yıkadıktan sonra, gece boyu inkübe edilen kültürleri geri alın; kültürlerin OD 600 değerini ölçün ve gece boyu inkübe edilen kültürleri, çok kanallı bir mikropipet kullanarak lb içerisinde seyreltin.Seyreltilmiş bakteri kültüründen uygun kuyucuklara 50 µL ekleyin. Her suş ve antibiyotik konsantrasyonu için üç kuyucuğa bakteri ekleyin. Bakteriyel kontaminasyon için kontrol olarak dördüncü kuyucuğa 50 µL LB ekleyin.96 kuyucuklu plakaları parafilm ile kapatın ve ertesi gün yaklaşık 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Plakaları, kuyucuklardaki bakteriyel büyüme açısından görsel olarak inceleyin. MIC, her suşun her üç tekrarı için de hiçbir bakteriyel büyümenin görülmediği en düşük antibiyotik konsantrasyonudur.Bu prosedüre başlamak için, test edilecek suşların NTBC içeren ve içermeyen LB ortamındaki gece boyu kültürlerini, daha önce gösterildiği gibi ertesi gün için hazırlayın. Oksidatif stres faktörü olarak hidrojen peroksit içeren LB APL'leri hazırlayın. Öncelikle LB agro flasklarını eritin ve ortamı oda sıcaklığında yaklaşık 50 °C'ye kadar soğutun.Ardından, hidrojen peroksiti istenen konsantrasyonlarda soğutulmuş besiyerine doğrudan ekleyin. Sıfırdan bir milimolar aralığında farklı hidrojen peroksit konsantrasyonlarını karıştırmak için erleni hafifçe çalkalayın. Milimolar seviyesi iyi bir başlangıç noktasıdır.Plakları hemen dökün ve kabarcıkları gidermek için yüzeyi alevle sterilize edin. Verim, 100 mililitre lb agar başına dört plaktır. Plakları hidrojen peroksit konsantrasyonuna göre işaretleyin.Plakalardaki fazla nemi gidermek için, fan çalışır durumdayken plakaları bir biyolojik güvenlik kabinine ağızları açık şekilde 30 dakika boyunca yerleştirin. Plakalar aynı gün içinde kullanılmalıdır. Plakalar kururken, yıkama ve ölçüm işlemlerini gerçekleştirin.Gece boyunca büyütülen kültürlerin OD 600 değerleri, test edilen suş grubundaki tüm gece kültürlerinin OD 600 değerlerini en düşük değere normalize eder. Bunu yapmak için, kültürü toplam bir mililitrelik hacimde en düşük OD 600 değerine seyreltmek için gereken kültür hacmini belirleyin. Örneğin, bir kültürün OD 600 değeri üç ve suş grubundaki en düşük OD 600 değeri 2,5 ise, gerekli kültür hacmi olarak 0,833 mililitre sonucunu verecek olan aşağıdaki hesaplamayı yapın ve bir mikrosantrifüj tüpüne 0,833 mililitre kültür ekleyin.Ardından, kültür hacmini bir mililitreye tamamlamak için gereken LB artı NTBC veya LB artı DMSO miktarını hesaplayın. Bu örnekte, miktar 0,167 mililitre olacaktır; kültürleri sabit bir NTBC veya DMSO konsantrasyonunda tutmak için vorteksleyerek karıştırın; normalize edilmiş gece boyu büyütülen kültürlerin PBS artı NTBC veya PBS artı DMSO içerisinde on katlı seri dilüsyonunu gerçekleştirin; test edilen suş sayısına göre ölçeklendirerek PBS artı NTBC ve PBS artı DMSO stok çözeltileri hazırlayın; bir suş için bir set dilüsyon için 300 mikromolar NTBC veya eşdeğer hacimde DMSO'yu, toplam 720 mikrolitre hacme ulaşacak şekilde PBS ile karıştırın; 10⁻¹'den 10⁻⁷'ye kadar olan seri dilüsyonlar için etiketlenmiş uygun mikrosantrifüj tüplerine 90 mikrolitre PBS artı NTBC veya PBS artı DMSO ekleyin.Vorteks ile karıştırılmış uygun 10⁻¹ dilüsyon tüpüne 10 µL kültür ekleyin ve 10⁻¹ dilüsyonundan 10 µL'yi 10⁻² dilüsyon tüpüne aktarın. Tüm dilüsyonlar tamamlanana kadar her dilüsyon arasında pipet uçlarını değiştirerek işlemi tekrarlayın. 10⁻³ ile 10⁻⁷ arasındaki dilüsyonlardan beşer µL'yi, duble olarak LV artı hidrojen peroksit plakalarına damlatın.Her bir suş için bir pipet ucu kullanın. Noktalar en seyreltikten en az seyreltik olana doğru plakaya ekildiyse, sıvı plaka üzerinde kuruyana kadar plakayı sallamayın veya eğmeyin. Plakaları, suşa bağlı olarak 37 °C'de 24 ila 48 saat inkübe edin.Yeterli büyüklükte koloniler oluştuktan sonra, bir translüminatör üzerindeki CCD kamera kullanılarak plakların fotoğrafı çekilir. NTBC titrasyonları, NTBC'nin p. aerogen'de p-melanin üretimini azaltıp azaltamadığını belirlemek ve burada gösterildiği gibi ek analizlerde kullanılmak üzere p-melanin üretimini ortadan kaldıran veya azaltan NTBC konsantrasyonunu tespit etmek için kullanılmıştır. NTBC, p-melanin üreten suşlarda PY-melanin üretimini doz bağımlı bir şekilde azaltmış, ancak p-melanin üretmeyen suşlarda pigment üretimi üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir.Bu tablo, NTBC ile ve NTBC olmadan işlem görmüş farklı p aerogen suşları için MIC testi sonuçlarını göstermektedir; MIC değerleri, bakteriyel büyümeyi inhibe eden en düşük antibiyotik konsantrasyonu olarak kaydedilmiştir. NTBC uygulaması, test edilen suşların antibiyotik MIC değerleri üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir. NTBC ile ve NTBC olmadan işlem görmüş melanin üreten ve melanin üretmeyen PIO suşlarında oksidatif stres yanıtı için bir spot plaka testi gerçekleştirilmiştir.Sıfır milimolar hidrojen peroksit plakası, tüm suşların uygun şekilde seyreltildiğini göstermiştir ve PIO melanin üreten bakteriler NTBC ile tedavi edildiğinde oksidatif strese karşı duyarlılığın arttığı gözlemlenmiştir; PIO melanin üretmeyen suşlar, p melanin üreten suşlara göre oksidatif strese karşı daha duyarlıydı. Bu videoyu izledikten sonra, oksidatif strese duyarlılık ve antibiyotik MİK değerleri test edilerek NTBC tedavisinin PIO melanin üretimi üzerindeki etkilerinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

methods-to-inhibit-bacterial-pyomelanin-production-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, bakteri suşlarının oksidatif stres tepkilerini değerlendirmek için özel olarak tasarlanmış bir spot plaka testini göstermektedir. Bazı suşlar, bir antioksidan pigment olan pyomelanin üretir. Tersine, bir test ajanı ile muamele edilen ve piyomelanin üretiminin azalmasına yol açan suşlar, oksidatif strese karşı artan duyarlılık sergiler ve bu da piyomelanin üreten suşlara kıyasla hücre canlılığının azalmasına neden olur.

Bakteri Suşlarında Oksidatif Stres Tepkilerini Değerlendirmek için Bir Spot Plaka Testi

Bu video, bakterilere karşı test antibiyotiklerinin Minimum İnhibitör Konsantrasyonunu (MIC) belirlemek için mikrotitre plakası tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bir test antibiyotiğinin seri dilüsyonlarını içeren bir mikrotitre plakasına bakteriyel patojen Pseudomonas aeruginosa'nın bir süspansiyonu ve bakteriler tarafından pyomelanin üretiminin bir inhibitörü eklendikten sonra, oyukların optik yoğunluğu, antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunu ve piyomelanin üretim inhibitörünün...

Bir Antibiyotiğin Minimum İnhibitör Konsantrasyonunu Değerlendirmek için Bir Mikrotitre Plaka Yöntemi

Bu el yazması oksidatif stres xenobiotic kaynaklı incelenmesi için genetik olarak kodlanmış fluorogenic gazetecilere canlı hücre görüntüleme bir uygulamada kullanımını açıklar. Bu deneysel yaklaşım eşsiz kronolojik zamanmekansal çözünürlük, duyarlılık ve özgüllük eksiklikleri toksikolojik oksidatif stres tespiti için kullanılan geleneksel yöntemlerden birçoğu kaçınırken sunmaktadır.

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

Bu iletişim kuralı spectrophotometrically trans-plazma membran elektron taşıma ekstraselüler elektron alıcısı kullanan izlemek ve bu hücre dışı elektron alıcısı ile oluşabilir enzimatik etkileşimleri analiz için hedeftir.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Biz kimyasallar tüp bebek hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için üç deneysel yöntemleri tarif: miktar 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve 3) melanin hücresel melanin boyama ve görüntü analizi tarafından ölçümü.

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

Bu protokolün amacı, fare derisinde öldürücü olmayan seviyelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) geçici in vivo üretimini indüklemek ve dokudaki fizyolojik tepkileri daha da teşvik etmektir.

Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IX'a Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde

Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.

Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi

Hücre morfolojisi, canlılık, yoğunluk, glutatyon ve UCP-2 seviyesini analiz eden retina pigment epitel hücrelerini H2O2ile tedavi ederek oksidatif stres modelinin geliştirilmesi ve kullanımı için bir protokol sunuyoruz. Transposon transfected hücreler tarafından salgılanan proteinlerin nöroretinal dejenerasyonu tedavi etmek için antioksidan etkisini araştırmak için yararlı bir modeldir.

Uyuyan Güzel Transposon Transposon Transfected İnsan Retina Pigment Epitel Hücrelerinde Oksidatif Stresin İndüksiyonu ve Analizi

Burada, düşük yoğunluklu mavi ve mor ışık ışınlaması altında flavin mononükleotidin (FMN) fotolizi sırasında üretilen reaktif oksijen türleri ile patojenik bakterileri inaktive etmek için bir protokol sunuyoruz. FMN fotolizinin sıhhi işlemler için basit ve güvenli bir yöntem olduğu gösterilmiştir.

Riboflavin-5′- Fosfatın Görünür Işık Fotolizi ile Patojenlerin İnaktivasyonu

HNM'de erken yaşlanmayı tetiklemek için tBHP kullanılarak standartlaştırılmış bir protokol, büyüme durması, SA-β-galaktosidaz aktivitesi ve SASP faktörleri dahil olmak üzere temel yaşlanma belirteçlerini analiz etmek için standartlaştırılmış protokoller.

Tert-bütil hidroperoksit kullanarak birincil insan melanositlerinde stres kaynaklı erken yaşlanma için standart bir protokol

Keşfedin bakteriyel piomelanin üretiminde NTBC inhibisyonunu ve oksidatif stres duyarlılığı artışını mikrobiyoloji ve antimikrobiyal direnç araştırmalarında. Bu yöntem enfeksiyon tedavisi stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Daha fazla video keşfet