Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Aşağıdaki deneylerin genel amaçları, NTBC'nin P melanin üretimi ve oksidatif strese duyarlılığın yanı sıra antibiyotik minimum inhibitör konsantrasyonları veya MIC'ler üzerindeki etkilerini belirlemektir. Bu, ikinci bir adım olarak p melanin üretimini azaltan konsantrasyonu belirlemek amacıyla bakteriyel kültürlere NTBC eklenerek gerçekleştirilir. Bakteriyel kültürler, NTBC ve antibiyotikler ile işleme tabi tutulur; bu işlem, kullanıcının NTBC uygulamasının antibiyotik MIC'leri üzerinde bir etkisi olup olmadığını belirlemesine olanak tanır.

NTPC ile işlem görmüş kültürler, NTPC tedavisine karşı duyarlılığı belirlemek amacıyla hidrojen perokside maruz bırakılır; oksidatif stres yanıtı spot plakları ve mikrotitrasyon MIC analizlerinden elde edilen sonuçlar, genik bakterilerin NTPC ile işlenmesinin pigment üretiminde azalmaya yol açtığını ve oksidatif strese karşı duyarlılığı artırdığını, ancak antibiyotik MIC değerleri üzerinde herhangi bir etkisi olmadığını göstermektedir. Oksidatif stres spot plak tekniğinin, canlı sayımı ve disk difüzyon analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, diğer analizlerde kullanılan yüksek hidrojen peroksit konsantrasyonları yerine daha düşük konsantrasyonların kullanılabilmesidir. Genellikle, antibiyotik MIC değerlerini belirleme yöntemimize yeni başlayan kişiler, pipetleme tekniğindeki hassasiyet eksikliğinin tekrarlar arasında değişkenliğe yol açması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.

Bu değişkenlik, antibiyotiğin MİK değerinin doğru bir şekilde belirlenmesini zorlaştırabilir. MİK analizinden bir gün önce, test edilecek suşların kültürlerini LB içinde, katkı maddeli ve katkısız olarak hazırlayın.

2,4-dinitro-2',4'-dinitrophenylcyclohexane-1,3-dion veya NTBC. Bu demonstrasyonda temsilci düzey olan 300 µM NTBC kullanılmıştır. Uygun NTBC konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan titrasyon yöntemi protokol metninde açıklanmıştır; kültürleri 37 °C'de, havalandırma ile gece boyunca inkübe edin ve bir sonraki güne geçin.

Bir suş için bir antibiyotiği test etmek amacıyla, MIC analizi için 2 mL LB'ye 600 µM NTBC ekleyerek LB artı NTBC ve LB artı DMSO stok çözeltilerini hazırlayın ve karıştırın. NTBC stok çözeltisini hazırlamak için; inokülm eklendiğinde iki kat seyrileceği için NTBC 600 µM konsantrasyonda eklenir.

300 micromolar nihai konsantrasyon elde etmek için, iki mililitre LB'ye eş hacimde taşıyıcı DMSO ekleyin ve NO NTBC ana çözeltisini oluşturmak için karıştırın. Bu iki ana çözelti, hem antibiyotik stok çözeltilerinin hazırlanmasında hem de 96 kuyucuklu plakalarda dilüsyon serilerinin oluşturulmasında kullanılacaktır. Ardından, antibiyotik çözeltilerini LB artı NTBC veya LB artı DMSO ana çözeltileri içerisinde hazırlayın.

Gentamycin artı veya eksi NTBC stok çözeltisini 64 µg/mL konsantrasyonda hazırlayın. KANAMYCIN artı veya eksi NTBC stok çözeltisini 256 µg/mL konsantrasyonda hazırlayın. Tobramycin artı veya eksi NTB stok çözeltisini 8 µg/mL konsantrasyonda hazırlayın.

2x antibiyotik çözeltileri hazırlandıktan sonra, 96 kuyucuklu bir plakanın A sırasındaki kuyucuklara her bir antibiyotik çözeltisinden 100 µL ekleyin. Örneğin, gentamycin 1'den 4'e kadar olan kuyucuklara, kanamycin 5'ten 8'e kadar olan kuyucuklara ve tobramycin 9'dan 12'ye kadar olan kuyucuklara yerleştirilmelidir. 96 kuyucuklu plakanın B'den H'ye kadar olan sıralarına 50 µL LB+NTBC veya LB+DMSO ana çözeltisi ekleyin; bir plakanın LB+NTBC, diğer plakanın ise LB+DMSO olduğundan emin olun. Bir mikropipet kullanarak, A sırasındaki çözeltiden B sırasına 50 µL aktararak antibiyotiklerin iki katlı seri dilüsyonlarını gerçekleştirin. Çözeltiyi karıştırın, pipet uçlarını değiştirin ve B sırasındaki çözeltiden C sırasına 50 µL aktarın. G sırasını seyrelttükten sonra geri kalan sıralar için işlemi tekrarlayın. O sıradaki çözeltiden 50 µL alarak atın.

Bakteriyel büyüme için H sırasını antibiyotiksiz kontrol olarak kullanın. Besiyerinde bulunan lanini gidermek için tüm kültürleri yıkadıktan sonra, gece boyu inkübe edilen kültürleri geri alın; kültürlerin OD 600 değerini ölçün ve gece boyu inkübe edilen kültürleri, çok kanallı bir mikropipet kullanarak lb içerisinde seyreltin.

Seyreltilmiş bakteri kültüründen uygun kuyucuklara 50 µL ekleyin. Her suş ve antibiyotik konsantrasyonu için üç kuyucuğa bakteri ekleyin. Bakteriyel kontaminasyon için kontrol olarak dördüncü kuyucuğa 50 µL LB ekleyin.

96 kuyucuklu plakaları parafilm ile kapatın ve ertesi gün yaklaşık 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Plakaları, kuyucuklardaki bakteriyel büyüme açısından görsel olarak inceleyin. MIC, her suşun her üç tekrarı için de hiçbir bakteriyel büyümenin görülmediği en düşük antibiyotik konsantrasyonudur.

Bu prosedüre başlamak için, test edilecek suşların NTBC içeren ve içermeyen LB ortamındaki gece boyu kültürlerini, daha önce gösterildiği gibi ertesi gün için hazırlayın. Oksidatif stres faktörü olarak hidrojen peroksit içeren LB APL'leri hazırlayın. Öncelikle LB agro flasklarını eritin ve ortamı oda sıcaklığında yaklaşık 50 °C'ye kadar soğutun.

Ardından, hidrojen peroksiti istenen konsantrasyonlarda soğutulmuş besiyerine doğrudan ekleyin. Sıfırdan bir milimolar aralığında farklı hidrojen peroksit konsantrasyonlarını karıştırmak için erleni hafifçe çalkalayın. Milimolar seviyesi iyi bir başlangıç noktasıdır.

Plakları hemen dökün ve kabarcıkları gidermek için yüzeyi alevle sterilize edin. Verim, 100 mililitre lb agar başına dört plaktır. Plakları hidrojen peroksit konsantrasyonuna göre işaretleyin.

Plakalardaki fazla nemi gidermek için, fan çalışır durumdayken plakaları bir biyolojik güvenlik kabinine ağızları açık şekilde 30 dakika boyunca yerleştirin. Plakalar aynı gün içinde kullanılmalıdır. Plakalar kururken, yıkama ve ölçüm işlemlerini gerçekleştirin.

Gece boyunca büyütülen kültürlerin OD 600 değerleri, test edilen suş grubundaki tüm gece kültürlerinin OD 600 değerlerini en düşük değere normalize eder. Bunu yapmak için, kültürü toplam bir mililitrelik hacimde en düşük OD 600 değerine seyreltmek için gereken kültür hacmini belirleyin. Örneğin, bir kültürün OD 600 değeri üç ve suş grubundaki en düşük OD 600 değeri 2,5 ise, gerekli kültür hacmi olarak 0,833 mililitre sonucunu verecek olan aşağıdaki hesaplamayı yapın ve bir mikrosantrifüj tüpüne 0,833 mililitre kültür ekleyin.

Ardından, kültür hacmini bir mililitreye tamamlamak için gereken LB artı NTBC veya LB artı DMSO miktarını hesaplayın. Bu örnekte, miktar 0,167 mililitre olacaktır; kültürleri sabit bir NTBC veya DMSO konsantrasyonunda tutmak için vorteksleyerek karıştırın; normalize edilmiş gece boyu büyütülen kültürlerin PBS artı NTBC veya PBS artı DMSO içerisinde on katlı seri dilüsyonunu gerçekleştirin; test edilen suş sayısına göre ölçeklendirerek PBS artı NTBC ve PBS artı DMSO stok çözeltileri hazırlayın; bir suş için bir set dilüsyon için 300 mikromolar NTBC veya eşdeğer hacimde DMSO'yu, toplam 720 mikrolitre hacme ulaşacak şekilde PBS ile karıştırın; 10⁻¹'den 10⁻⁷'ye kadar olan seri dilüsyonlar için etiketlenmiş uygun mikrosantrifüj tüplerine 90 mikrolitre PBS artı NTBC veya PBS artı DMSO ekleyin.

Vorteks ile karıştırılmış uygun 10⁻¹ dilüsyon tüpüne 10 µL kültür ekleyin ve 10⁻¹ dilüsyonundan 10 µL'yi 10⁻² dilüsyon tüpüne aktarın. Tüm dilüsyonlar tamamlanana kadar her dilüsyon arasında pipet uçlarını değiştirerek işlemi tekrarlayın. 10⁻³ ile 10⁻⁷ arasındaki dilüsyonlardan beşer µL'yi, duble olarak LV artı hidrojen peroksit plakalarına damlatın.

Her bir suş için bir pipet ucu kullanın. Noktalar en seyreltikten en az seyreltik olana doğru plakaya ekildiyse, sıvı plaka üzerinde kuruyana kadar plakayı sallamayın veya eğmeyin. Plakaları, suşa bağlı olarak 37 °C'de 24 ila 48 saat inkübe edin.

Yeterli büyüklükte koloniler oluştuktan sonra, bir translüminatör üzerindeki CCD kamera kullanılarak plakların fotoğrafı çekilir. NTBC titrasyonları, NTBC'nin p. aerogen'de p-melanin üretimini azaltıp azaltamadığını belirlemek ve burada gösterildiği gibi ek analizlerde kullanılmak üzere p-melanin üretimini ortadan kaldıran veya azaltan NTBC konsantrasyonunu tespit etmek için kullanılmıştır. NTBC, p-melanin üreten suşlarda PY-melanin üretimini doz bağımlı bir şekilde azaltmış, ancak p-melanin üretmeyen suşlarda pigment üretimi üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir.

Bu tablo, NTBC ile ve NTBC olmadan işlem görmüş farklı p aerogen suşları için MIC testi sonuçlarını göstermektedir; MIC değerleri, bakteriyel büyümeyi inhibe eden en düşük antibiyotik konsantrasyonu olarak kaydedilmiştir. NTBC uygulaması, test edilen suşların antibiyotik MIC değerleri üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir. NTBC ile ve NTBC olmadan işlem görmüş melanin üreten ve melanin üretmeyen PIO suşlarında oksidatif stres yanıtı için bir spot plaka testi gerçekleştirilmiştir.

Sıfır milimolar hidrojen peroksit plakası, tüm suşların uygun şekilde seyreltildiğini göstermiştir ve PIO melanin üreten bakteriler NTBC ile tedavi edildiğinde oksidatif strese karşı duyarlılığın arttığı gözlemlenmiştir; PIO melanin üretmeyen suşlar, p melanin üreten suşlara göre oksidatif strese karşı daha duyarlıydı. Bu videoyu izledikten sonra, oksidatif strese duyarlılık ve antibiyotik MİK değerleri test edilerek NTBC tedavisinin PIO melanin üretimi üzerindeki etkilerinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.