Name: Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Öğrenin, prostat kanserinde miRNA analizi için lazer yakalama mikrodisseksiyonu ve kantitatif gerçek zamanlı PCR yöntemlerini kullanarak arşivlenmiş klinik dokularda basitleştirilmiş bir protokol uygulamayı.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazının hazırlanması ile yaptığı destek ve yardım için Dr. Roger Erickson teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen (Hibe Numarası RO1CA177984, RO1CA138642), prostat kanseri (BX001604) VA programı projesi.

Formalin ile sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) ya da dondurulmuş, prostat kanseri örnekleri SFVAMC elde edildi. Numuneler SFVAMC radikal prostatektomi uygulanan prostat kanserli hastaların idi. Yazılı bilgilendirilmiş onam tüm hastalar alındı ​​ve çalışma İnsan Araştırmaları UCSF Komitesi tarafından onaylandı. Seçenek olarak ise, prostat kanseri doku mikrodizileri, ticari kaynaklardan temin edilerek MiRNA ISH ile analizler için kullanılmıştır. Analiz prostat kanseri hastaları için Klinikopatolojik ve takip bilgileri toplanmıştır. 1. Doku numuneleri <ol><li> H &amp; E, üreticinin protokolü aşağıdaki bir mikrotom ve leke kullanılarak 10 um bölüme prostat kanseri dokusu örnekleri kesin. </li><li> Prostat kanseri odaklarının belirlenmesi için lekeli slaytlar yanı sıra komşu normal glandüler epitel gözden geçirin. Not: Bir kurul onaylı patolog H &amp; E lekeli slaytlar ve ma gözden geçirmelidirtümör ve normal bir alanlar için rk. MiRNA için ileriki bölümlerde kılavuzları, normal alanlar vs tümör analizleri olarak işaretlenmiş slaytlar kullanın. </li></ol> Kantitatif Gerçek zamanlı PCR ile 2. miRNA İfade Analizi Not: Lazer Yakalama mikrodiseksiyon, (miRNA ve mRNA dahil) toplam RNA izolasyonu, aşağıdaki bölümlerde ayrıntılı olarak TaqMan MicroRNA ifade tahlilleri kullanılarak olgun miRNA&#39;lar denenmesi: Bu iş akışı aşağıdaki adımları içerir. <ol><li> RNA Ekstraksiyonu <ol><li> Prostat Kanseri FFPE Dokular miRNA İzolasyonu <ol><li> Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) Not: adımları gerçekleştirin 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 kimyasal davlumbaz. <ol><li> LCM doku slaytlar (10 mikron kesitler) hazırlayın. 10 dakika her biri için, (2x) Ksilen ıslatılarak Deparrafinize doku bölümleri, daha sonra damıtılmış ve ardından kademeli etanol (100,% 95,% 90,% 80,% 70%) her 5 dakika boyunca inkübe slaytlar dokuları rehidrasyonu su(5 dakika). </li><li> Rehidrasyondan sonra, 30 saniye için hematoksilin ile leke bölümler su eklendi. </li><li> Talep dereceli etanol dokular (70,% 95,% 90,% 80,% 70%) (her biri 5 dakika) ve ksilenden (5 dakika). </li><li> Daha sonra kuru bir davlumbaz slaytlar ve mikrodiseksiyon LCM enstrüman yerleştirin. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak 24 ile LCM Sistemi ile microdissections gerçekleştirin. Kullanım patolog prostat kanseri odaklarının belirlenmesi yanı sıra komşu normal dokuya için rehber olarak slaytlar işaretlenmiş. 70-90 mW bir gücü olan bir 10-20 mikron çaplı darbe lazer ışını kullanarak. </li><li> LCM kapaklar üzerine kızılötesi lazer darbeleri ile ilgi Yakalama alanları. Numune başına miRNA çıkarılması için 2-5 kapaklar hücreleri birleştirin. Hemen çıkarılan RNA bütünlüğünü sağlamak miRNA çıkarılması için yakalanan hücreleri işlemek için. </li><li> Seçenek olarak ise, MiRNA ekstraksiyon tampon içinde lize hücreleri (üreticinin protokolüne göre) ve sto-80 ºC lizatlarında yeniden. </li></ol></li><li> LCM microdissected Dokular miRNA Ekstraksiyon ve Analizleri <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre bir ticari kit kullanılarak microdissected FFPE dokulardan toplam RNA ekstrakte edin. Not: lazer yakalama miscrodissection RNA verimi tipik olarak düşüktür. Bu nedenle, RNA düşük ses (20-30 ul) içine akıtılan ve üreticinin talimatlarına Taqman mikroRNA ifade analizleri kullanılarak ifade profilleme (ayrıca bölüm 2.2 anlatılmıştır) için kullanılır. Olgun miRNA&#39;ların gerçek zamanlı PCR tespiti için, giriş RNA optimizasyonu elüte RNA 5 ul, her MiRNA özgü ters transkripsiyon reaksiyonu için uygun olduğunu göstermektedir. Endojen bir kontrol olarak, RNU48 / RNU24 kullanılır. Kontrol reaksiyonları için, elüt RNA&#39;nın 2 ul ters transkripsiyon reaksiyonu için kullanılır. </li></ol></li></ol></li><li> Prostat Kanseri Frozen Dokular miRNA İzolasyonu <ol><li> Homojen birbir havan ve havan tokmağı kullanarak sıvı azotun içinde donmuş dokular öğütülmesiyle rezeke prostat dokuları çer-. Soğutulmuş spatula kullanarak bir mikrosantrifüj tüp homojenize doku aktarın. Kolaylıkla transfer edilebilir, böylece sıvı azot Homojenize doku daldırılmak suretiyle aynı sıcaklıkta harç / havan tokmağı ve bir spatula koruyun. </li><li> Homojenize doku ticari guanidin izotiyosiyanat-fenol reaktifı (doku 1 ml / 0.1 g) ilave edilir ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Not: Ticari guanidin izotiyosiyanat-fenol reaktifı içinde homojenleştirilen dokulara birkaç ay boyunca -80 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Homojenat (0.2 ml kloroform / ml) kloroform ilave edin ve 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj, ardından 3-5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Taze, steril RNaz içermeyen 1.5 ml tüp üst sulu faz transfer. </li><li> Izopropil alkol eşit hacim. Mix ve 10 mil boyunca inküben, oda sıcaklığında RNA topak haline 4 ° C &#39;de 20 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ile izledi. </li><li> Süpernatant aspire ve% 70 etanol içinde 1 mL RNA pelet yıkayın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 12.000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle süpernatant aspire. 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında kuru bir RNA peletleri. 50-100 ul nükleaz içermeyen su içinde RNA eritin. </li><li> NanoDrop spektrofotometre kullanılarak RNA miktarının gerçekleştirin ve bir Bioanalyzer RNA bütünlüğünü belirler. 10 ng / ul RNA konsantrasyonları ayarlayın. PCR analizleri gerçek zaman (Bölüm 2.2) ve ardından miRNA- özel cDNA reaksiyonu için 10-50 ng RNA kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> MiRNA İfade Analizi için Kantitatif Real-time PCR Aşağıda tarif edildiği gibi iki aşamalı bir RT-PCR protokol kullanılarak, olgun Deneyi miRNA&#39;ların: edin. <ol><li> Ters Transkripsiyon (RT) <ol><li> Arka üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkripsiyon MiRNA kiti kullanılarak RNA&#39;dan cDNA transkribe.MicroRNA Tahliller ve RT kiti miRNA belirli primer ile toplam RNA 10-50 ng kullanın. Kontrol olarak RNU48 / RNU24 / RNU6B kullanın. (Analiz miRNA&#39;nın bolluğuna bağlı olarak) ila 1:10 5 ve bir sonraki aşamada tarif edildiği gibi gerçek zamanlı PCR algılama kullanımı: cDNA 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Olgun miRNA Tespiti için Real-time PCR <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, hızlı Evrensel ana karışımı ile mikroRNA tahlilleri kullanılarak, cDNA örnekleri PCR ürünleri yükseltin. RNU48 / RNU24 / RNU6B kontrol örnekleri normalize. Hızlı Real Time PCR Sistemi gen ifadesinde göreli değişiklikleri hesaplamak için karşılaştırmalı Ct (eşik döngüsü) yöntemini kullanın. Üçlü olarak her numune analiz edin. </li></ol></li></ol></li></ol> Yerinde Hibridizasyon tarafından 3. miRNA Anlatım Analizleri (ISH) <ol><li> Dokuların Ön Arıtma <ol><li> Bir mikrotom kullanılarak FFPE prostat kanseri dokusu bloklarından 5 mikron bölümleri kesin. </li><li&gt; 1 saat 56 ° C&#39;de slaytlar kuluçka doku bölümleri sabitleyin. Not: MiRNA analizleri Slaytlar birkaç hafta oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> 15 dakika her biri için, (2x), ksilen ile slaytlar ıslatılmasıyla dokuları Deparrafinize. </li><li> Damıtılmış su (5 dakika), ardından aşamalı etanol (100% (2x),% 95,% 90,% 80,% 70) &#39;de 5 dakika süre ile, her slaytlar inkübe edilerek dokuları rehidrate. </li><li> 20 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehit ile slaytlar sabitleyin. </li><li> 5 dakika her biri için oda sıcaklığında PBS (2x) ile slaytlar yıkayın. </li><li> Önceden ısıtılmış Proteinaz K tamponu içinde 10 dakika (5 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl), 37 ° C&#39;de 10 ug / ml proteinaz K ile slaytlar tedavi edin. </li><li> Proteinaz-K işlendikten sonra 30 saniye süreyle PBS içinde% 0.2 glisin ile slaytlar yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS (1x) slaytlar yıkayın. </li><li> 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile slaytlar sabitleyin. </li><li> Ile durulayın slaytlar5 dakika boyunca PBS ile yıkandı. </li></ol></li><li> Melezleme <ol><li> Nemli bir oda içinde 55 ° C &#39;de 3-4 saat için önceden hibridizasyon solüsyonu ile slaytlar önceden hibridize. Odacık nemlendirilmelidir tutmak için% 50 formamid /% 50 5x SSC batırılmış doku laboratuvar mendil kullanın. </li><li> Hibridizasyon tamponu içinde 20-50 nM arasında bir konsantrasyonda 5 &#39;digoksigenin işaretli problar kullanarak. 4 dakika 90 ºC miRNA özgü prob (20-50 nM) ve küçük nükleer RNA U6 kontrol probu (20 nM), ısı seyreltin buz üzerine yerleştirin ve soğuk hibridizasyon tamponu buz ekleyin (2-4 ng / ml ). </li><li> Prob özgü hibridizasyon sıcaklığında 12-16 saat süreyle inkübe hibridizasyon solüsyonu (prob + hibridizasyon tamponu, slayt başına 100 ul) ekleyin öncesi hibridizasyon çözüm çıkarın (Hibridizasyon sıcaklığı = Tm probu-21 ºC). Nemli bir bölmede (% 50 formamid /% 50 5x SSC) &#39;de melezleşme. </li></ol></li><li> Yıkama adımları <ol><li> 45 ºC de 10 dakika boyunca 2x SSC ile slaytlar yıkayın. </li><li> Yıkama tO 45 ºC 10 dakika boyunca 1.5x SSC slaytlar. </li><li> 20 dakika her biri için 37 ° C&#39;de 0.2x SSC (2x) ile slaytlar yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca 1 x bloke edici bir solüsyonuyla slaytlar inkübe </li></ol></li><li> Algılama <ol><li> 1 ile slaytlar inkübe: 100 PBS 1-4 saat boyunca veya bütün gece 4 ° C&#39;de AP-konjuge anti-digoksigenin antikor seyreltilmiştir. </li><li> 10 dakika her biri için, oda sıcaklığında PBS (3x) ile slaytlar yıkayın. </li><li> 5 dakika her biri oda sıcaklığında Alkalin Fosfataz tamponu (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCI,% 0.1 Tween-20) ile slaytlar (2x) yıkanır. </li><li> 1-20 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta BM Mor AP alt-tabaka slaytlar inkübe edin. </li><li> PBS su içinde% 0.1 Tween-20 ve yıkama (2x) içeren slaytlar durulayın. </li><li> Sulu montaj medyayı kullanarak slaytları monte edin ve bir mikroskop altında incelemek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Shen, M. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+prostate+cancer%3A+new+prospects+for+old+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges.</a> Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).</li>
<li>Sequeiros, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+markers+for+prostate+cancer+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Biomed Res Int. 2013, 283635(2013).</li>
<li>Cary, K. C., Cooperberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+in+prostate+cancer+surveillance+and+screening%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Urol%22%5BJournal%5D)">Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future.</a> Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).</li>
<li>Sartori, D. A., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+in+prostate+cancer%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Biomarkers in prostate cancer: what's new.</a> Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li>
<li>Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+microRNA+host+genes+and+transcription+units%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units.</a> Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).</li>
<li>Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+III+transcribes+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase III transcribes human microRNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).</li>
<li>Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microRNAs+are+processed+from+capped%2C+polyadenylated+transcripts+that+can+also+function+as+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs.</a> RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+genes+are+transcribed+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II.</a> EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).</li>
<li>Bartel, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li>
<li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+prostate+cancer%3A+from+biomarkers+to+molecularly-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate+Cancer+Prostatic+Dis%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics.</a> Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).</li>
<li>Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastamir%3A+the+field+of+metastasis-regulatory+microRNA+is+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading.</a> Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).</li>
<li>Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microRNAs+and+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Diet, microRNAs and prostate cancer.</a> Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).</li>
<li>Saini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Role+of+mir-203+in+Prostate+Cancer+Progression+and+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis.</a> Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).</li>
<li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+signatures+from+the+small+non-coding+RNA+transcriptome+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer.</a> Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).</li>
<li>Porkka, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in prostate cancer.</a> Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).</li>
<li>Schaefer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+implications+of+microRNA+profiling+in+prostate+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma.</a> Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).</li>
<li>Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+microRNAs+in+prostate+cancer+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncog%22%5BJournal%5D)">Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities.</a> Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).</li>
<li>Xi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+microRNA+expression+of+RNA+extracted+from+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples.</a> RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).</li>
<li>Lucas, S. M., Heath, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+in+development+of+differentially+expressed+and+prognostic+prostate+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate+Cancer%22%5BJournal%5D)">Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers.</a> Prostate Cancer. , 640968(2012).</li>
<li>Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Novel+Bicyclo%5B2.2.1%5D+Ribonucleosides%3A+2%27-Amino-+and+2%27-Thio-LNA+Monomeric+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides.</a> J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).</li>
<li>Suh, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-145+is+regulated+by+DNA+methylation+and+p53+gene+mutation+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer.</a> Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).</li>
<li>Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection+in+prostate+cancer+research%3A+establishment+and+validation+of+a+powerful+tool+for+the+assessment+of+tumour-stroma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions.</a> BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).</li>
<li>Nelson, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179(2005).</li>
<li>Hanna, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+microRNAs+in+tissue+microarrays+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization.</a> Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir mali açıklaması bulunmamaktadır.

Bu yazıda, arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik dokularda profilleme miRNA ifade basitleştirilmiş iş akışını açıklar. Prostat kanserinde, çeşitli çalışmalar prostat kanseri başlatılması, ilerlemesinde ve metastazında microRNA önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. Ancak, çelişkili sonuçlar genellikle miRNA çıkarma beri belirli bir miRNA 22 üzerinde elde edilen ve yöntemler çok farklıdır analizlerin. Prostat kanseri prognoz, teşhis ve tedavi için alternatif bir prostat kanseri biyobel...

Prostat bezi kanseri erkekler arasında kanserle ilişkili ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olan yaygın tanı erkek kanseridir. ABD&#39;de, bir 220.800 yeni vaka tahmin ve 27540 ölüm 2015 1 rapor edilecektir. Prostat kanseri tümörleri tembel ya da çok agresif olabilir ders-derece değişken hastalığı olan heterojen bir hastalıktır. Prostat kanseri, klinik yönetiminde kritik bir meydan okuma hastalığı taraması, tanısı, prognozu ve tedavisi 2 şu anda kullanılan yöntemler / biyomarkerların yetersizliği ile ortaya atılır. Güncel tarama yöntemleri prostat spesifik antijen (PSA) testi ve prostat biyopsisi 3 tarafından izlenen bir parmakla rektal muayene (PRM) içerir. Prostat spesifik antijen (PSA) anlamlı klinik yönetimi ve sağkalım oranları 4 devrim yarattı en yaygın kullanılan prostat kanseri biyomarkerdir. Ancak, PSA dahil lac doğasında sınırlamalarözgünlüğü, PSA bazlı tarama k tanı üzerinde ve hastalığın tedavisi üzerinde yol açmıştır. Bu bakışa göre, yoğun çabalar, alternatif prostat kanseri biyomarkerların için bir arama doğru hastalığın saldırganlık tahmin ve daha iyi tedavi kararları 4,5 sürebilirsin hangi özellikle yöneltiliyor. Son birkaç yıldır, mikroRNAlar (miRNA&#39;lar) umut verici alternatif prostat kanseri biyomarkerler olarak ortaya çıkmıştır. MikroRNA&#39;lar (miRNA&#39;ların) aynı kökenli mRNA hedef 3&#39;- çevrilmemiş bölgelerin (UTRs) ile sekansa özel etkileşimler yoluyla post-transkripsiyonel gen ekspresyonunu bastırmak küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar evrimsel olarak muhafaza edilmiş sınıfını teşkil ederler. Bu mRNA% 60 miRNA&#39;ların 6 hedeflerini muhafaza edilir&gt; olduğu tahmin edilmektedir. miRNA genlerinin intergenik bölgelerde veya intronlar veya genleri 7 kodlama protein / non-protein ekson içinde yer almaktadır. Bu genler tercihen prima içine RNA Polimeraz II transkripsiyonury miRNA&#39;lar (pri-miRNA&#39;lar, birkaç kilobaz uzunluğunda) Bu biçim firkete şeklinde kök halka ikincil yapılar. Bu pri-miRNA&#39;lar sitoplazmaya ihraç ve ayrıca 8-10 (18-25 nükleotid uzunluğunda) olgun miRNA&#39;lar içine işlenir haberci miRNA&#39;lar (60-75 nükleotid uzunluğunda öncesi miRNA&#39;lar) içine işlenir. miRNA&#39;lar çoğalması, geliştirme, farklılaştırma ve apoptoz 11 gibi önemli hücresel süreçleri düzenler. Çalışmalar prostat kanseri 12-15 olmak üzere çeşitli insan malignlerinde miRNA ifade profillerinin yaygın düzensizliği öneririz. MiRNA sentezleme profilleri yaygın primer ve metastatik prostat kanserinde düzensiz için rapor edilmiştir. Altered miRNA ifade miRNA&#39;ların 12,14,16-19 prognostik potansiyelini vurgulayarak prostat kanseri ilerlemesi, saldırganlık ve nüks ile bağlantılı olmuştur. Artan miktarda kanıt vücut miRNA&#39;lar prostat kanseri başlangıcı, gelişimi, ilerleme önemli mekanik rol oynarlar olduğunu gösteririyonu ve metastazı. Genel olarak, miRNA&#39;lar prostat tümörlerinin 12 tabakalaşma normal ve kanserli dokuların ve yardım ayırt edebilirsiniz prostat kanseri tanı ve prognoz gibi umut verici alternatif biyobelirteçleri ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, miRNA&#39;ların prostat kanseri 20 karşı etkili terapötik maddelerin geliştirilmesi için önemli hedeflerdir. Endojen RNaz etkinliğinin kendi küçük boyutu ve direnci nedeniyle, hali hazırda miRNA&#39;ların formalinle sabitlenmiş dokular 21 ve prostat biyopsisi 22 tespit edilebilir stabil biyolojik belirteçler. Ayrıca, miRNA&#39;ların ekspresyon profilleri, sabit dondurulmuş ve formalin dokularda karşılaştırılmış ve güçlü bir biçimde 21 korelasyon olduğu tespit edilmiştir. Ancak, prostat kanseri, klinik dokularda profilleme miRNA ifade genellikle vb prostat kanseri ağır dinleri etkili biyomarkırların olarak miRNA&#39;lar gelişmesi tümör heterojenliği, örnekleme hataları, stromal kirlenme nedeniyle zorluKlinik dokularda onların doğru algılama es. Burada arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik örneklerde profilleme miRNA ifade laboratuarımızda kullanılan basitleştirilmiş iş akışını açıklar. Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR bir arada istihdam ve miRNA için in situ hibridizasyon eski verimli daha nicel bilgi ve dokuların bir dizi potansiyel miRNA biyomarkerlerin diferansiyel ifadesi görselleştirmek için ikincisi ile, klinik örneklerin analizleri. Bu iş akışı içinde, FFPE ve dondurulmuş prostat dokulardan MiRNA çıkarılması için mevcut olan yöntemleri optimize ekspresyon problar 23 tabanlı kilitli nükleik asit (LNA) kullanılarak MiRNA RT-PCR ve miRNA in situ hibridizasyon tekniği göre Taqman probu ile incelenmiştir. LNA tabanlı sondalar DNA- ya da RNA bazlı prob ile karşılaştırıldığında artan duyarlılık ve özgüllük sunmak ve onların GC içeriği ne olursa olsun, tüm miRNA dizilerinin sağlam algılama sağlar ve aynı zamanda ayrımcılığın izinmiRNA ailelerin yon. Bizim optimize miRNA ISH protokol miRNA biyomarker keşfini hızlandırmak için potansiyeli sunan ikincisi ile, prostat kanseri dokusu slaytlar veya prostat kanseri dokusu mikrodizileri (TMA) tatbik edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biyosistemleri&nbsp;</td>LCM Arcturus / Life Technologies için <td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix</td><td></td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternatif olarak, Life Technolgies'ten Arcutus Xt sistemi kullanılabilir.</td></tr><tr><td>CapSure Makro LCM Kapakları</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler/ Yaşam Teknolojileri</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Ters Transkripsiyon kiti&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler/ Yaşam Teknolojileri</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler/ Yaşam Teknolojileri</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr>U6 <td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td>BM Mor AP substratı<td>için DIG etiketli LNA probu</td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Ön hibridizasyon çözümü&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon çözümü&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>Engelleme çözümü&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>AP konjuge anti-digoksigenin antikoru</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>Sulu montaj ortamı&nbsp;</td><td>Vektör Laboratuvarları&nbsp;</td><td>H-5501 ve nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (guanidin izotiyosiyanat-fenol reaktifi)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoksilen</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eozin&nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

prostat kanseri klinik dokularındaki mirna İfade analizleri

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Prostat kanseri (PCa) klinik yönetiminde kritik bir meydan okuma hastalığı taraması, tanısı, prognozu ve tedavisi için günümüzde kullanılan biyolojik belirteçlerin yetersizliği ile ortaya atılır. Son yıllarda, mikroRNAlar (miRNA&#39;lar) prostat kanseri tanı ve prognoz gibi umut verici alternatif biyomarkerları ortaya çıkmıştır. Ancak, prostat kanseri için etkili biyomarkırların olarak miRNA&#39;lar gelişimi ağır klinik dokularda onların doğru algılama dayanır. miRNA genellikle tümör heterojenite, örnekleme hataları, stromal kirlenme vb miRNA bir arada kullanarak arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik örneklerin analizleri için bu makalenin amacı basitleştirilmiş iş akışı tanımlamaktır nedeniyle zorlu prostat kanseri klinik örneklerin analizleri kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) ve in situ hibridizasyon (ISH). Bu iş akışı içinde, biz FFPE gelen miRNA çıkarılması için mevcut metodolojiler ve dondurulmuş prostat tissu optimizees ve ifade miRNA RT-PCR tabanlı Taqman-prob ile analiz eder. Dayanan problar - Ayrıca, ISH için optimize edilmiş bir yöntem, kilitli nükleik asit (LNA) kullanılarak prostat dokularında formiRNA algılama analiz tarif eder. Bizim optimize miRNA ISH protokol prostat kanseri dokusu slaytlar veya prostat kanseri dokusu mikrodizileri (TMA) tatbik edilebilir.

RT-PCR ile LCM birincil prostat kanseri, klinik örneklerde miR-203 İfade profil analizleri (Şekil 1) RT-PCR LCM primer prostat kanseri dokularında göre miR-203 ekspresyonunun analiz eder ve bir kontrol olarak kullanılmıştır Saini ve ark., 15 RNU48 tarif edildiği gibi eşleştirilir, bitişik normal bölgeler gerçekleştirilmiştir. Aşağıdaki tablo, komşu normal dokulara göre prostat kanseri tümör dokularında göre miR-203 ekspresyonunu özetlemektedir. <p cla...

Burada, kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) ve yerinde hibridizasyon (ISH) kullanan arşivlenmiş Formalin-Sabit, Parafine Gömülü (FFPE) veya taze dondurulmuş prostat kanseri (PCa) klinik dokularında mikroRNA (miRNA) ekspresyon analizleri için basitleştirilmiş bir protokolü açıklıyoruz.

Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Bu videonun genel amacı, kilitli nükleik asit tabanlı probların uygulanmasıyla birlikte, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve NC iki hibridizasyon kombinasyonunu kullanarak arşivlenmiş prostat kanseri klinik örneklerinde mikro RNA analizleri için basitleştirilmiş bir iş akışını tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle lazer yakalama mikrodisseksiyonu kullanılarak prostat kanseri FFPE kesitlerinden doku izole edilmesi ve ardından bir mikro RNA ekstraksiyonu ile gerçekleştirilir. Daha sonra, dokudaki mikro RNA'yı miktarsal olarak belirlemek için iki aşamalı R-T-P-C-R kullanılır ve C iki hibridizasyon analizinde mikro RNA'yı lokalize etmek için digoksigen işaretli LNA probları ve BM purple ile tespit edilen AP konjugeli antijen ve antikor kullanılır.Sunulan sonuçlar, prostat kanseri klinik dokularında bir mikro RNA'nın ekspresyonunu göstermektedir. Bu tekniklerin kullanılmasıyla birlikte, son zamanlarda mikroRNA'lar prostat kanseri için gelecek vadeden alternatif hastalık biyobelirteçleri olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, prostat tümörlerinin heterojenliği ve stromal kontaminasyon gibi karıştırıcı faktörler nedeniyle, prostat kanseri klinik örneklerinde mikroRNA ekspresyon analizi yapm

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kantitatif Real Time PCR (qPCR) tümör örneklerinde çeşitli mikroRNA ifade seviyeleri (miRNA) molekülleri araştırmak için hızlı ve duyarlı bir yöntemdir. Farklı miRNA moleküller yüzlerce bu yöntem ifadesi kullanılarak, amplifiye miktarı, ve aynı cDNA şablon ile analiz edilebilir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

İnsan genomunun% 8'ini işgal insan endojen retrovirüsleri (herv), kıt kodlama kapasitelerini ama yüz bin uzun terminal tekrarları (LSY) korur. Özel bir Affymetrix mikroarray bireysel herv odağı ifade belirlemek için tasarlanmıştır ve gelecekteki klinik çalışmalar için kavramının bir kanıtı olarak prostat kanseri dokularda kullanıldı.

Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Bu protokolün amacı, aşağı akış RNA analizi için heterojen prostat dokularından saf hücre tipi popülasyonlarını izole etmek için etkili bir yöntem olarak lazer yakalama mikro-diseksiyonunu kullanmaktır.

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

İmmünohistokimya, dokulardaki protein lokalizasyonunu ve ekspresyonunu değerlendirmek için güçlü bir laboratuvar tekniğidir. Kantitasyon için mevcut yarı otomatik yöntemler öznelliği ortaya çıkarır ve çoğu zaman tekrarlanamaz sonuçlar yaratır. Burada, multispektral görüntüleme kullanılarak çoğullanmış immünohistokimya ve protein ekspresyonunun objektif kantitasyonu ve ko-lokalizasyonu için yöntemler tanımlanmıştır.

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Burada, miRNA in situ hibridizasyon kullanarak meme kanseri hasta örneklerinde miRNA ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.

miRNA kullanarak Meme Kanseri Dokularındaki miRNA İfade Klinikopatolojik Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

Bu modifiye çıkarma protokolü histopatolojik doku blokları ilgi daha doğrusu hedef bölgelerden RNA ve DNA verimi artırır.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Nükleik asit bozulması arşivleme doku, tümör heterojenite ve taze donmuş doku örnekleri eksikliği kanser tanı Hizmetleri dünya çapında patoloji laboratuarlarında olumsuz etkileyebilir. Bu el yazması meme kanserlerinin sınıflandırmak için bir multiplex manyetik boncuk tahlil kullanarak biyolojik bir panel optimizasyonu açıklar.

Meme kanseri arşivleme malzeme kullanarak bir Multiplex RNA temel ifade tahlil duruma getirilmesi

Biz mikroRNA (miRNAs) dolaşan ifade düzeylerini değerlendirmek için bir protokol kanserli hastalarda plazma örnekleri mevcut. Özellikle, biz piyasada bir kit miRNA çıkarma ve ters transkripsiyon dolaşan için kullanılır. Son olarak, gerçek zamanlı önceden benekli sonda özel plakaları kullanarak 24 seçili miRNAs oluşan bir panel analiz ettik.

Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti

Tedavi direnci genellikle ileri prostat kanseri olan hastalarda gelişir, ve bazı durumlarda, kanser nöroendokrin prostat kanseri denilen ölümcül bir alt tip ilerler. Bu geçişi kolaylaştıran küçük kodlamayan RNA aracılı moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi, daha iyi hastalık tabakalaşmasına ve nöroendokrin prostat kanserigelişimine yol açan nedensel mekanizmaların tanımlanmasına olanak sağlayacaktır.

Formalin-sabit Dokulardan Küçük Kodlamaz RNA'nın ve Kastrasyona Dirençli Prostat Kanseri Hastalarından Serum Türetilmiş Ekzozomların Dizilimi

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Öğrenin, prostat kanserinde miRNA analizi için lazer yakalama mikrodisseksiyonu ve kantitatif gerçek zamanlı PCR yöntemlerini kullanarak arşivlenmiş klinik dokularda basitleştirilmiş bir protokol uygulamayı.

Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri

Daha fazla video keşfet