Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

Bu prosedürün genel amacı, ototoksik ajanları fare kokleasının yuvarlak pencere nişine stratejik olarak doğrudan ileterek bir iç kulak yaralanma modeli oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle deri altı yağ tabakasının diseke edilmesi ve timpanik bulla periosteumunu ortaya çıkarmak için kas gövdesinin nazikçe geri çekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, yuvarlak pencere nişi açığa çıkana kadar kemik parçaları kademeli olarak kaldırılarak bullanın kapağının açılmasıdır.

Ardından, yuvarlak pencere nişinin optimal şekilde görüntülenmesine olanak sağlamak için orta kulak ve yuvarlak pencere nişindeki görünür sıvı tamamen kurutulur. Son adım, STA pedial arterine zarar vermeden yuvarlak pencere nişini seçilen ototoksik ajanla doldurmak ve ardından ajanın spesifikasyonlarına göre uygun tekrarları gerçekleştirmektir. Son olarak, koklear mikro mimarinin seçici olarak korunduğunu veya dejenerasyona uğradığını göstermek için işitsel beyin sapı cevabı ve morfolojik değerlendirme dahil olmak üzere fonksiyonel prosedürler kullanılır.

Mevcut ölçüm yöntemimiz olan bu tekniğin temel avantajı, bu prosedürün oval pencere nişinin mükemmel bir şekilde açığa çıkarılmasına ve seçici oto-toksik yaşlandırmanın doğrudan uygulanabilmesine olanak tanımasıdır. Bu tekniğin avantajları arasında iç kulağın mikro mimarisinin korunması, sistemik toksisitenin önlenmesi, etkinin hızlı başlaması, belirli koklear hücre tiplerinin seçici dejenerasyonu ve tekrarlanabilir sonuçlar yer almaktadır. Bu teknik; sıçanlar, kobaylar ve gerbiller dahil olmak üzere diğer kemirgen türlerine küçük değişikliklerle uygulanabilir.

Şimdi prosedürü laboratuvarımda göstereceğim. Hayvan araştırmalarının tüm aşamaları, ilgili kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesinin kılavuzlarına uygun olarak yürütülmüştür. Burada açıklanan tüm vertebra deneysel prosedürleri, South Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin kılavuzları kapsamında onaylanmıştır.

Hayvan onaylanmış prosedürlere göre anesteziye alındıktan sonra, kilogram başına 0.1 miligram preoperatif analjezik uygulayın. Burada Buprenorphine kullanılır. Hayvanın cerrahi anestezi seviyesine ulaştığını kontrol edin.

Ayak parmağına sıkma işlemine yanıt alınmamalı ve burada görüldüğü gibi farelerde yazma refleksi yok olmalıdır. Seçilen ototoksik maddeyi içeren sulu çözeltinin 0,2 mililitresini, ucu kütleştirilmiş 28 gauge yarım inç iğne takılı bir mililitrelik bir tüberküloz şırıngasına önceden hazırlayın; şırınga içindeki tüm havayı boşaltın, çünkü hava kabarcıkları maddenin doğru şekilde uygulanmasını engelleyebilir. Bölgedeki tüyleri temizlemek için elektrikli tüy alma makinesi kullanın; temizleme işlemini asefalik katlantıdan omuz kuşağına kadar dikkatlice genişletin.

Kıl temizliğini dorsal sagital orta hattan mandibular açıya doğru lateral olarak genişletin. Temiz bir tıraş hazırlığı sağlamak için tek kullanımlık bir jilet kullanın. Hazırlanan bölgedeki cildi kurumsal protokollere uygun olarak sterilize edin.

Burada, Betadine ve etanol sırayla iki dakika boyunca dairesel hareketlerle topikal olarak uygulanır. Hayvanın vücut sıcaklığını korumak için gövdenin altına küçük bir ısıtıcı ped yerleştirin. 36 ila 38 °C sıcaklıkta, hayvanın başını bir baş tutucu aparat yardımıyla sabitleyin.

Hayvanın burnunu sabit tutmak için burun sırtı üzerine küçük bir klempi nazikçe sıkın. Kafa tutucunun, U şeklinde eklemli bir kolun merkezine sıkıca bağlandığını doğrulayın. Sağ tarafa erişim sağlamak amacıyla, U'nun sol koluna sol taraf baş desteği olarak kullanılacak bir santimetre genişliğinde bir çubuk sabitleyin.

Baş tutucuya sıkıca sabitlendikten sonra, fareyi sol yan yatış pozisyonuna getirin. Prosedür boyunca stabil kalmasını sağlamak ve servikal vertebralar üzerinde aşırı torsiyonel stres oluşmasını önlemek için gövdeyi düz operasyon yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Cerrahi alanın üzerine, 10 x ve 20 x büyütme kapasitesine sahip bir operasyon mikroskobu konumlandırın.

Mikroskobik büyütme altında çalışırken her iki elin de cerrahi işlem için kullanılabilmesi amacıyla, mikroskobun eller serbest şekilde konumunu koruyabildiğinden emin olun. Auriküler sefalik kıvrımın yaklaşık altı ila sekiz milimetre üzerinde, bir ila 1,5 santimetre uzunluğunda postauriküler bir insizyon oluşturmak için keskin makas veya bistüri ucu kullanın. Alttaki vasküler yapıları korumak için derin kesim yapmaktan kaçının.

Subkütan yağ tabakası boyunca künt diseksiyon yapın. Ventralden mediale doğru diseksiyon yapılıyorsa, vena jugularis externa'ya zarar vermemeye dikkat edin. Kanama meydana gelirse, akışı durdurmak için emilebilir jelatin, süngerler veya pamuk peletleri kullanın.

Yağ tabakası uygun şekilde ayrıldıktan sonra, servikal kas yapısını açığa çıkarın. Önemli bir referans noktası, C CTO mastoidin arka kenarı etrafını saran 11. kranial sinirin küçük bir sinir dalıdır. Pinna'ya doğru genişletmek için, CTO mastoiditis kas gövdesini posterior yöne doğru nazikçe geri çekmek üzere kendi kendine tutunan bir ekartör kullanın.

Kas gövdesini saran şeffaf fasyayı nazikçe ayırın. Ayrıca parotis bezini ve eksternal juguler veni dikkatlice ters yöne doğru çekin. CTO Masto kas gövdesi yeterince retraksiyonla açıldığında, bulla'nın medyal yönünde, daha derin bir servikal kasın insersiyon noktasında timpanik bulla periosteumunun parlak kubbesi görünür hale gelir.

Sternokleidomastoid bölgesi görünür hale gelecektir. CTO mastoidi ayırmak için iki el tekniği kullanarak kendi kendini tutan bir ekartör yerleştirin, bulla periostunu bölmek ve alttaki kemiği açığa çıkarmak için nazikçe bipolar diyatermi kullanın. Ardından, bulla kubbesini tamamen açığa çıkarmak için periostu nazikçe kaldırmak ve periferik yönde itmek için pens veya bir otolojik kavisli instrument kullanın.

Şimdi, bulla kemiği üzerinden dikkatlice 2 mm'lik bir kılavuz delik açmak için bir veya iki milimetrelik konik uca sahip, kayış tahrikli bir dental el matkabı kullanın. Kubbenin kaudal kenarı ile bulla'nın rostral yönü boyunca uzanan görünür opak çizgi arasından delin. Ardından, yakınına ikinci bir kılavuz delik dikkatlice açın. Bulla kemiğinin tavanının açılmasını kolaylaştırmak için, bir çift kuyumcu cımbızı kullanarak bulla kemiğinin tavanını dorsal ve kaudal yönde kaldırın.

Bullock kapağının hemen altında bulunan EDL arterini delmemeye dikkat edin. Ajan uygulanmadan önce orta kulağa aşırı sıvı girişini önlemek için çıkarılan kemik miktarını minimize edin. Kuru kemik görünene kadar orta kulaktaki ve yuvarlak pencere nişindeki tüm görünür sıvıları temizlemek için kağıt fitil kullanın.

Bu adım, protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. Alan maksimum büyütme altında izlenirken, bir mililitrelik tüberküloz şırıngası üzerindeki ince çaplı bir iğne kullanarak, bir damla ototoksik ajan doğrudan yuvarlak pencere nişine uygulanmalı ve niş tamamen doldurulmalıdır. Ajanın yuvarlak pencere nişinde 10 dakika boyunca beklemesine izin verin.

Erken aşamalarda, kuru nişin tabanındaki küçük bir ışık yansımasının yerini mat ve puslu bir sıvı menisküsünün almasını dikkatle izleyin. Bu, nişin düzgün şekilde dolduğunu gösterir. 10 dakika geçtikten sonra ajanı tamamen emdirerek uzaklaştırın ve yerine aynı ajanın yeni bir uygulamasını yapın.

Uygulama sayısı kullanılan ajana bağlıdır. Maruz kalma süresi tipik olarak 30 ile 60 dakika arasında değişir. Son uygulamayı takiben, boğa kapatılmadan bırakılır ve cerrahi bölge üzerindeki yumuşak dokuyu kapatmak için pens kullanılır.

Cerrahi bölgedeki cildi kapatmak için 4-0 emilmeyen monofilaman sütür kullanın. Hayvanın, yataklama malzemesi ve yumuşak gıdalarla donatılmış temiz bir ev kafesinde anesteziden ayılmasını sağlayın. Sakrifikasyon ve koklear doku hasadı yapılana kadar yetişkin C-B-A-C-A-J hayvanlarını günlük olarak izleyin.

Her iki cinsiyetteki fareler ototoksik ajan Hept etanole maruz bırakıldı. Yuvarlak pencere difüzyonu gerçekleştirildi. Hept uygulanan farelerde, saline ile sham cerrahisi yapılan kontrol hayvanlarına kıyasla, ameliyat sonrası birinci günden 14. güne kadar BR eşiklerinde anlamlı artışlar gözlendi.

Etanol, test edilen hiçbir frekansta anlamlı eşik kaymaları göstermemiştir. Yeşil renkte gösterilen, içeriye doğru doğrultucu bir potasyum kanalına karşı yapılan immün boyama, koklear yapıların hasarını ve iyileşmesini görselleştirmek için dolaylı bir yöntem olarak kullanılmıştır. Boyama yoğunluğu theria vais içinde belirgin şekilde azalmıştır.

Postoperatif birinci günde, kırmızı renkte gösterilen nükleer karşı boyamalarda, hücresel apoptoza özgü nükleer bütünlüğün bozulması ve kromozomal kondansasyon kanıtları da görülmüştür. Stratis ile tedavi edilen kulakların bölgelerinde potasyum kanalı boyama yoğunluğu nicelendirildiğinde, hept maruziyetinden yedi gün sonra başlangıçta bir düşüşün ardından kontrol yoğunluğuna doğru belirgin bir geri dönüş olduğu ve iyileşmenin sonrasında da devam ettiği gösterilmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu işlem uygun şekilde gerçekleştirilirse 30 ila 60 dakika içinde tamamlanabilir.

Ekpozürün tekrarlanmasının veya sıvının yenilenmesinin, oto toksik ajanın kan yoğunlaşması veya interstisyel sıvı nedeniyle istenmeyen şekilde seyrelmesini önlemeye yardımcı olabileceğini unutmak önemlidir. Bununla birlikte, bu yaklaşımda dikkatli olunmalıdır çünkü kudal arterin yanlışlıkla zedelenmesi veya yuvarlak pencere nişine interstisyel sıvı girmesi riskini artırma eğilimindedir. Bu minimal invaziv teknik, hassas biyokimyasal süreçlerin ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanır ve in vivo koklear rejeneratif potansiyeli anlamaya yönelik araştırmalarımızı ilerletmede çok önemli bir rol oynamıştır.