TCR-pMHC Bağlama Ölçüm

Bu videoda, bir T hücresi ile düzlemsel destekli lipid tabaka arasındaki immünolojik sinaps içerisinde, T hücresi antijen reseptörü ile peptit yüklü majör histokompatibilite kompleksi (pMHC) arasındaki kinetiğin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Protein üretimi ve kalsiyum akışı ölçümleri yoluyla lipid tabakanın fonksiyonel bütünlüğünün doğrulanmasıyla ilgili önemli yönler hakkında size kısa bir rehberlik sunacağız. Lipid tabakanın nasıl hazırlanacağı ve tek molekül floresan mikroskobunun nasıl kurulacağı hakkında daha ayrıntılı bilgi için lütfen Journal of Visualized Experiments'taki paralel katkımıza başvurun. Daha sonra, toplu (bulk) ve tek molekül düzeyinde floresan rezonans enerji transferi ölçümlerinin nasıl gerçekleştirileceğini ve analiz edileceğini ayrıntılı olarak açıklayacağız.

Genel yaklaşımımızda kullandığımız FRET tabanlı stratejimizi açıklamak için sinaptik T-hücre reseptörü PMHC bağlanma kinetiğini belirlemek amacıyla, burada mavi renkle gösterilen T-hücre reseptörünün veya TCR'nin, antijeni olan peptid yüklü MHC molekülü veya sarı ve kırmızı ile gösterilen PMHC ile bağlanmış kristal yapısıyla başlıyoruz. Ayrıca, age 57 olarak adlandırılan, T-hücre reseptörü betasına reaktif bir antikorun değişken domenlerinden oluşan tek zincirli bir fragmanı ekliyoruz. Kantitatif FRET tabanlı ölçümler için, hem FRET donörünün (bizim durumumuzda tek zincirli fragman) hem de FRET akseptörünün (PMHC) bölgeye özgü bir şekilde etiketlenmesi zorunludur.

Bu işlem, ardından maleimid konjuge Floresen boyaya kovalent olarak bağlanabilen bir sistein kalıntısının eklenmesi yoluyla rekombinant proteinler için gerçekleştirilebilir. Gösterildiği gibi, FRET donörü olan Alexa Fluor 555 veya SI3'ü tek zincirli fragmana ve FRET akseptörü olan Alexa Fluor 647 veya SI5'i MHC'ye bağlı peptidin C-terminusuna bağlıyoruz.

Bu kompozit yapıda gösterilen Indy mesafesi yaklaşık 41 angstrumdur ve bu mesafe, iki boya arasındaki yarı maksimal enerji transferi mesafesi olan ilk yarıçaptan bile daha küçüktür. Deneylerimizde, sürveyan antijen sunan hücreler olarak düzlemsel cam destekli lipid çift tabakaları kullanıyoruz. Bunlar PMXC, atory molekül B yedi bir ve adhezyon molekülü I chem bir ile fonksiyonelleştirilmiştir.

Bu sayede, arayüze çok yakın konumdaki Flor kuvvetini aydınlatan ve böylece hücresel arka planı önemli ölçüde azaltan toplam iç yansıma floresan modunda görüntüleme yapılabilir. Fret, yalnızca tek zincir fragmanı ile işaretlenmiş TCR'ler katmana gömülü PM hcs ile etkileşime girdiğinde tespit edilebilir. Bu, T-C-R-P-M-H-C bağlanmasını görselleştirmemize ve ardından C iki düzgün katlanmış histo gene Tact içindeki bağlanma kinetiğini hesaplamamıza olanak tanır.

P71 ve Ichem1'in hücre dışı kısımları, ilgili BUC virüsü ile enfekte edilmiş böcek hücresi kültürlerinin süpernatanlarından saflaştırılır. Saflaştırma; nikel NTA afinite kromatografisi ile başlayan, ardından iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisinin izlediği üç adımda gerçekleştirilir. His-tagli MHC Sınıf II heterodimerleri, e coli'de inklüzyon cisimcikleri olarak eksprese edilir ve redoks tamponu içinde hızlı dilüsyon yoluyla, 4 °C'de bir yer tutucu peptit varlığında in vitro olarak yeniden katlanır.

Yer tutucu peptit, daha sonra UV ışığına maruz bırakılarak parçalanacaktır. Doğru katlanmış PMHC kompleksleri, yer tutucu madde saflaştırılarak ve konsantre edilerek elde edilir. Peptit, pH 5.2'de parçalanır ve floresan peptit ile yer değiştirilir.

Nihai ürün boyutla saflaştırılmıştır. Tek zincirli fragman, E. coli'de inklüzyon cisimcikleri olarak serbest bir sistein ile eksprese edilmiş, ardından basamaklı diyaliz yoluyla in vitro refolde edilmiş ve boyutla saflaştırılmıştır. Daha sonra, serbest sisteini üzerinden maleimid konjuge bir boya ile işaretlenmiş ve tekrar boyutla saflaştırılmıştır.

Tüm rekombinant proteinler, son olarak 50% gliserol içeren PBS ile diyalize edilerek mililitre başına bir miligram protein olacak şekilde konsantre edilir ve -20 °C'de uzun süreli olarak saklanır. Lipid tabakasının stimülatuar gücünü doğrulamak amacıyla, T hücrelerindeki hücre içi kalsiyum seviyelerini ölçmek için rasyometrik URA iki boyası kullanın. T-hücre blastlarını URA 2:00 AM esteri ile yükleyin.

Bu bileşik hücrelere AM grubu aracılığıyla girer, ancak daha sonra AM kısmını koparan esterazların etkisiyle hücre içinde hapsolur. Yaklaşık 3 milyon T hücresine, litre başına beş mikromolar nihai konsantrasyonda fira 2:00 AM ekleyin. Hücreleri 24 kuyucuklu plakadan yeni bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Hücreleri, kalsiyum ve magnezyum içeren Hanks dengeli tuz çözeltisi ve %1 albümin içeren görüntüleme tamponu ile bir kez yıkayın. Hücre içi kalsiyumu izlemek için UV kapasiteli otomatik bir ters mikroskop sistemi kullanın. Zamanlama protokolünü başlatın ve mikroskop tablasında odaklanmış durumda olan fonksiyonelleştirilmiş lipid çift tabakasına iki yüklü T hücresinden daha azını ekleyerek düzenli zaman aralıklarında bir DIC görüntüsü ile 340 ve 380 nanometre UV ışığı ile uyarılan iki floresan görüntü alın.

Çift katman teması kurulduktan hemen sonra, çalışmanın 15. dakikasındaki URA iki oran okumasına göre T hücreleri yüksek kalsiyum seviyeleri sergiler. Tüm PMHC antijenlerini doyuracak bir bloklama antikoru hücrelere ekleyin. Bunun sonucunda, hücre içi kalsiyum seviyeleri, daha sonra referans olarak kullanılacak olan aktive edilmemiş durum seviyelerine düşer.

Bloke edici antikor seviyeleri, FRET ölçümleri için bir olarak normalize ettiğimiz ve nonaktif durumu yansıtan bir değere düştüğünde, her deney için T hücrelerinin TCR reaktif tek zincirli fragman FRET probu ile boyanması gerekir; yaklaşık 1 milyon hücreyi bir tüpe aktarın ve 400 G'de çöktürün. Besiyerini dökün ve iç duvarlara yapışmış kalan besiyeri damlacıklarını bir kağıt havlu ile temizleyin. Bu işlem, daha önce belirttiğim yaklaşık 30 µL'lik minimum inkübasyon hacmini sağlar.

FRET probu, 1 mg/mL konsantrasyonda ve %50 gliserol ile -20 °C'de saklanır. Prob, hücrelere 0,3 µL oranında eklendiğinde, protein başına bir oranla ya Alexa Fluor 555 ya da Alexa Fluor 647 ile bölgeye özgü olarak işaretlenmiştir. Peleti birkaç kez dikkatlice hafifçe sallayın ve hücreleri 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Hücreleri buz gibi soğuk görüntüleme tamponu ile yıkayın. Bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. İnkübasyon, santrifügasyon ve düşük sıcaklıkta saklama işlemleri, T hücrelerinin floresan proba maruz kaldıkları sırada probu internalize etmemelerini sağlar.

Bu durum, arka plan floresansının artmasına neden olur. Ayrıca, T hücreleri, kamarayı içeren bilar mikroskop sahne değişimine yerleştirilmeden önce yapılan yıkama ve saklama işlemleri sırasında soğukta probu kaybetmezler. PBS'in sırayla görüntüleme tamponu ile değiştirilmesi, çift katmanın havayla temasını her ne pahasına olursa olsun önler; çünkü bu temas katmana zarar verir.

Hücresel arka planı azaltmak için turf aydınlatma yöntemini kullanıyoruz. Bunun için, eksitasyon ışınını toplam iç yansımanın gerçekleştiği kritik açıya konumlandırıyoruz. Eksitasyonu kapatın, geniş alan ışığını açın, T-hücresini ltec haznesine ekleyin ve lipid tabakası üzerine çökmelerini bekleyin.

Uyarılmayı açın ve turf dışı bir aydınlatmaya odaklayın. Hücre membranı, her odak düzleminde optik eksen boyunca bir halka şeklinde gözlenir; turf'ta ise sadece bilayer ile temas halindeki bazal membran gözlemlenebilir. Üstteki odak düzlemleri artık uyarılmaz ve bu nedenle görünür değildir.

Zamanlama protokolü, PMHC ve TCR görüntülemesi için kırmızı ve yeşil eksitasyon darbeleriyle başlar ve ardından P-M-H-C-F akseptörünü yok etmek için bir kırmızı ağartma darbesiyle devam eder. F yağ akseptörü ağartmasından sonra TCR'yi görüntülemek için bir yeşil darbe ve F akseptörü yok etme deneylerini doğrulamak için bir kırmızı darbe, birinci ve ikinci yeşil darbeler arasındaki mümkün olan en kısa gecikme ile saniyenin altında bir zaman ölçeğinde gerçekleştirilir. Opsiyonel olarak, başlangıçta bir DIC görüntüsü elde edilebilir; iki renkli görüntü ayırma, donör ve akseptör kanallarının eş zamanlı olarak tespit edilmesine olanak tanır.

Beslenen akseptör eksitasyonu, T hücresi sinapsındaki P HCS birikimini göstermektedir. Bu ön görüntü, pmcs varlığını doğrular ve halihazırda TCR aracılı PMHC bağlanmasını gösterir. Heyecan verici. Beslenen donör, her iki kanalda da görüntüler oluşturur.

Beslenen donör kanalının sinyali, F akseptör kanalına enerji transferi nedeniyle bir dereceye kadar şiddette azalma gösterir. FRET akseptör kanalının sinyali, beslenen donörün FRET sızıntısından (bleed through) ve FRET akseptörünün çapraz uyarılmasından oluşur. Her halükarda, bu görüntü analiz için kullanılmayacaktır.

Mevcut protokolde, hızlı bir ağartma işlemi uygulanarak tüm kabul edilen floroforlar ortadan kaldırılır. Fret kabul ağartması sonrası F donör görüntüsünün yoğunluğu, fret kanalında herhangi bir yoğunluk kaybı olmaksızın yeniden daha yüksek seviyelere çıkarılır.

Aşağıdaki FRET akseptör beklentisi, tam F fat akseptör ağartmasını doğrular. FRET donör geri kazanımını nicelendirmek için sinapsa yakınlaşalım. FRET akseptöründen bağımsız olarak sabit olan ortalama arka plan yoğunluğunu belirleyin.

Ardından fotobloklama (photobleaching) yapılır ve sinapsın ortalama yoğunluğu ile temsili bir TCR kümesinin yoğunluğu belirlenir. FRET verimi, f akseptör ablasyonu öncesi ve sonrası fark normalize edilerek hesaplanır. Örneğimizde, tüm sinaps için %16 FRET ve temsili küme için %26 FRET ölçüyoruz.

TCR küme fret verimleri daha sonra, iki boyutlu sinaptik Disosiyasyon sabiti tek molekül verilerini oluşturan TCR doluluk oranlarına dönüştürülecektir. Bu, tek molekül FRET deneyleri için sinaptik TCR peptid MHC bağlanma kinetiğini belirlememize yardımcı olur. Daha önce kullanılan reaktiflerin ve etiketleme stratejisinin aynısını kullanıyoruz.

Bununla birlikte, gerçekten tek bir TCR ile tek bir peptid MHC arasındaki etkileşimi gözlemlediğimizden emin olmak için aşağıdaki kriteri karşılamayı tercih ediyoruz. Tek moleküllü bir FRET olayı için aday bir olayın, tek bir FRET akseptör veya FRET donör molekülü ile örtüşmesi gerekir. Burada, gözlemlenen FRET olayının tek moleküllü doğasını doğrulamak için tek bir pMHC'yi FRET akseptör molekülü olarak kullanıyoruz, ancak aynı mantık tersi için de geçerlidir.

Üst bölgelerde fed akseptörlerin ve alt bölgelerde Fred donörlerin kullanılması kesinlikle bir seçenektir. Genellikle, uyarıcı bir lipid tabakasıyla temas eden T hücrelerini 514 ve 647 nanometre eksitasyon ile inceliyoruz; bir milisaniyelik minimum zaman gecikmesiyle takip edilen sıralı ve tekrarlayan donör ve akseptör eksitasyonundan sonra bekleme süresi gelir. Bu süre, deneyin gereksinimlerine göre değiştirilebilir.

Uyarılmadan sonraki milisaniyeler içinde tek bir boya tespiti için yeterince güçlü bir floresan sinyali elde etmek amacıyla, santimetrekare başına bir ile beş kilowatt arasında değişen yüksek uyarım güç yoğunlukları uygulamamız gerekir. Fotobeyazlama nedeniyle, görünür PMHC fret akseptör moleküllerinin sayısı, kare mikron başına 30 veya daha fazla etiketli PMCS içeren bir çift katmanda tekil fret akseptör fluro kuvvetlerinin ayırt edilebileceği bir seviyeye hızla düşer. Toplam 42 milisaniyelik bir zaman gecikmesi için bir örnek burada gösterilmiştir.

Kırmızı daire ile işaretlenen tek bir FRET olayı, ikinci ve üçüncü zaman noktalarında görünür hale gelir. Bu olay, yeşil daire ile işaretlenmiş tek bir S5 molekülü ile ko-lokalize olur. Bu örnekte, gözlemlenebilir FRET olayının iz uzunluğu ikidir; "some 128 traces" tablosunda gösterildiği gibi daha fazla tek molekül FRET izi toplayın.

Ardından, yeşil sayılarla gösterildiği gibi izlerin tamamlayıcı kümülatif toplamını hesaplayın ve bunları gösterildiği gibi normalize ederek normalize edilmiş değerleri grafiğe dökün ve tek bir eksponansiyel fonksiyonla uydurun. Beklenen değer 1,5 zaman diliminden biraz fazladır. Bu değer TCR peptidine, MHC bağlanmasına ve fotobeyazlamaya bağlıdır; bu iki katkıyı ayırt edebilmek için beklenen değerin en az üç farklı zaman için hesaplanması gerekir.

Şimdi tüm beklenen değerleri ilgili zaman gecikmelerine karşı grafiğe dökün ve veri noktalarını, burada ömrü içeren gösterilen fonksiyona uydurun. 2,12 saniye ve PHOTOBLEACHING için beklenen değer f Fred. Burada ve daha öncesinde daha detaylı olarak gösterildiği gibi, F Fred kabul edilebilir ağartma sonrası donör geri kazanımı, immünolojik sinaps içinde etkili oldukları haliyle iki boyutlu disosiyasyon sabitlerinin sadece birkaç adımda belirlenmesi için kullanılabilir.

Burada analizimizi, TCR etkileşimine ve TCR-pMHC bağlanmasının en belirgin olduğu TCR kümelerine odaklıyoruz. Gösterilen ölçümlerden anlaşıldığı üzere, F FRED değerleri önemli ölçüde farklılık göstermektedir. Münferit TCR kümeleri için.

F fred değerinin C orantı faktörü ile çarpılması, PMHC'ye bağlı TCR'lerin sayısının toplam sayıya oranını tanımlayan bir terim olan TCR doluluğunu ortaya çıkarır. C faktörü, belirli bir set fre çifti ve kullanılan FRE sistemi için bir kez belirlenmelidir. Bu sunumun sonunda, örneğin, özellikle TCR R reaktif tek zincirli antikor fragmanı ve MHC'ye bağlı peptidin C terminusuna yerleştirilmiş SI üç ve SI beş'i içeren C'nin nasıl belirleneceğini daha ayrıntılı olarak açıklayacağız. Yaklaşık iki sinaptik, iki boyutlu disosiyasyon sabiti, TCR doluluğu olarak adlandırılan A'dan ve lipid tabakada bulunan başlangıç pMHC yoğunluğundan hesaplanabilir.

Gösterilen ilişki, kütle etki yasasından türetilmiştir ve bu videoya eşlik eden makalede daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Örneğimizde, pmc'lerin başlangıç yoğunluğu kare mikron başına 30 moleküldür. T-hücresi sinapsında etkili olan 2D kd'lerin, kare mikron başına yaklaşık 34 molekül medyan değerine sahip bir dağılımına ulaşıyoruz.

Açılma hızı (on rate) dağılımı, sinaptik 2D KD dağılımından ve buna karşılık gelen, 24 °C'de tek molekül FRET iz analizi yoluyla belirlenen saniyede 0,41'lik kapanma hızıyla (off rate) hesaplanabilir. Medyan değer yaklaşık olarak molekül başına saniyede 0,01 kare mikrondur. Özetle, TCR ve peptit MHC arasındaki FRET ölçümleri, C2'deki reaksiyon dinamiklerini tanımlayan tüm kinetik parametrelerin kapsamlı bir şekilde analiz edilmesine olanak tanır.

Bu metodoloji, prensipte, hücre hücre tanıması için bütünsel olabilecek diğer reseptör ligand etkileşimlerinin analizine de genelenebilir. Son olarak, yağ verimlerini TCR doluluk oranlarına dönüştürmek için gerekli olan C sabitinin deneysel olarak nasıl elde edileceğini tartışıyoruz. Bu prosedürün yalnızca bir kez gerçekleştirilmesi yeterlidir.

Belirlenen C sabiti, aynı floroforlara sahip aynı FRET sisteminin uygulandığı sonraki tüm deneyler için kullanılabilir. Bu prosedürde, temelde, akseptör fotoblokaj sonrası donör geri kazanımı yoluyla tekil TCR kümelerinde ölçülen FRET verimlerini, sensitize edilmiş FRET kanalında saptanan ilgili yoğunluk değerlerine ilişkilendirdik. Daha önce tartışıldığı üzere, FRET verimi, FRET akseptör ablasyonu öncesi ve sonrası arka planı düzeltilmiş FRET donör kanalı görüntülerinden belirlenir.

Hassaslaştırılmış FRET kanalı, F donör kanalı ile X ve Y eksenlerinde hizalanmalı ve arka plan düzeltmesi yapılmalıdır. Burada gösterildiği gibi FRET donör sızıntısı (bleed-through) ve FRET akseptör çapraz uyarımı düzeltilmelidir. FRET donör sızıntısı ve FRET akseptör çapraz uyarımının nasıl düzeltileceğine dair ayrıntılı bir açıklama makalede sunulmuştur.

Bu videoyu takip ederek, şimdi her bir TCR kümesi için düzeltilmiş fret görüntüsünün bug sinyalinin, karşılık gelen düzeltilmiş fret donör görüntüsüne oranını hesaplayın. Tekil fret donörleri ve tek moleküllü fret olayları için düzeltilmiş ortalama sinyali belirleyin ve oranı hesaplayın. TCR doluluk oranı, ardından her iki oranın çarpılmasıyla elde edilir.

Şimdi, bireysel TCR kümeleri için belirlenen FRET verimlerini, TCR doluluk oranlarına karşı grafiğe dökün. C değeri daha sonra burada gösterildiği gibi lineer regresyon aracılığıyla belirlenir. Bizim örneğimizde, bu değer yaklaşık olarak ikiye tekabül etmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, PMHC ve TCR arasındaki sinaptik bağlanma kinetiğini ölçmek için tek molekül floresan mikroskopisi ile kombinlenmiş protein fonksiyonelleştirilmiş bir lipid çift katmanını kullanabilmeniz gerekir. Protein üretimi, T hücresi işaretlemesi ve nihai FRET ölçümlerini içeren tüm gerekli adımlar tartışılmıştır. Ayrıca, T hücresi aktivasyon eğrileri ve FRET değerleri sağlayan görüntü analizi ayrıntılı olarak gösterilmiştir.

Son olarak, kinetik açma-kapama hızlarının belirlenmesinin temelindeki metodoloji gösterilmiştir. Prensipte, uygun modifikasyonların gerekli olabileceği durumlar olsa da, benzer bir yaklaşım diğer sinaptik reseptör ligand etkileşimlerini belirlemek için de kullanılabilir.