TCR-pMHC Bağlama Ölçüm In Situ Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

Bu videoda, bir T hücresi ile düzlemsel destekli bir lipid blay arasındaki immünolojik sinaps içinde bulunan C iki'de T hücresi antijen reseptörü ile peptit yüklü majör histouyumluluk kompleksi veya PMHC arasındaki kinetiğin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Protein üretiminin önemli yönleri ve kalsiyum akışı ölçümleri yoluyla lipit kilin fonksiyonel bütünlüğünün doğrulanması konusunda size kısaca rehberlik edeceğiz. Lipid kilinin nasıl hazırlanacağı ve tek moleküllü bir floresan mikroskobunun nasıl kurulacağı hakkında daha ayrıntılı bilgi için lütfen paralel katkımıza bakın Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi'nde, daha sonra ilk veya rezonans enerji transferi ölçümlerinin nasıl yapılacağını ve analiz edileceğini ayrıntılı olarak açıklayacağız.

Genel yaklaşımımızda kullanılan fret tabanlı stratejimizi açıklamak için sinaptik T hücresi reseptörü PMHC bağlanmasının kinetiğini çıkarmak için, T hücresi reseptörünün veya TCR'nin kristal yapısıyla burada antijenini, peptit yüklü MHC molekülünü veya sarı ve kırmızı ile gösterilen PMHC'yi bağlarken mavi renkle başlıyoruz. Ayrıca, yaş 57 olarak adlandırılan bir T hücresi reseptörü beta reaktif antikorundan değişken alanların tek bir zincir fragmanını da tanıtıyoruz. Kantitatif fre tabanlı ölçümler için, hem fre donörünün, bizim durumumuzda tek zincir fragmanının hem de fre reseptörünün, PMHC'nin bölgeye özgü bir şekilde etiketlenmesi zorunludur.

Bu, rekombinant proteinler için, daha sonra akar konjuge Fluor kuvvetine kovalent olarak bağlanabilen, havalandırılmamış bir sisteinin eklenmesi yoluyla mümkündür. Gösterildiği gibi, beslenen donör Alexa Fluor 5 5 5 veya üçüncü tarafı tek zincir parçasına ve perde alıcısına takıyoruz. Alexa, MHC'ye bağlı peptidin C terminaline 6, 4, 7 veya SI beşini akar.

Bu kompozit yapıda gösterildiği gibi Indy mesafesi yaklaşık 41 angstrum'dur, ilk yarıçaptan bile daha azdır, iki boya arasındaki yarı maksimal enerji transferinin mesafesidir. Deneylerimizde, vekil antijen sunan hücreler olarak düzlemsel cam destekli lipid bilar kullanıyoruz. Bunlar PMXC, atoryon molekülü B yedi ve adezyon molekülü I kimyasal molekül ile işlevselleştirilir.

Bu şekilde görüntüleme, arayüze yakın bir yerde Flor kuvvetini aydınlatan ve böylece hücresel arka planı önemli ölçüde azaltan toplam iç yansıma floresan modunda gerçekleştirilebilir. Fret, yalnızca TCR'ler etiketli tek zincir parçası, katmana gömülü PM hcs tarafından etkileşime girdiğinde tespit edilebilir. Bu, T-C-R-P-M-H-C bağlanmasını görselleştirmemizi sağlar ve ardından C'deki bağlanma kinetiğini hesaplamamızı sağlar.

P seven one ve I chem one'ın hücre dışı kısımları, karşılık gelen BUC virüsü ile enfekte olmuş böcek hücre kültürlerinin süpernatantlarından saflaştırılır. Saflaştırma, nikel anti aros afinite kromatografisi ile başlayan, ardından demir değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile devam eden üç adımda gerçekleştirilir. Histo tag MHC Sınıf iki heterodimerler, e coli'de inklüzyon cisimcikleri olarak eksprese edilir ve in vitro olarak dört santigrat derecede ve redoks tamponunda hızlı seyreltme yoluyla bir boşluk tutucu peptitin varlığında yeniden katlanır.

Boşluk tutucu peptit daha sonra UV ışığına maruz kalma yoluyla parçalanacaktır. Düzgün bir şekilde katlanmış PMHC kompleksleri daha sonra saflaştırılmış ve konsantre edilmiş alan tutucu. Peptit parçalanır ve pH 5.2'de floresan peptit ile ikame edilir.

Nihai ürün stand boyutu saflaştırılır. Tek zincirli fragman, e coli'deki inklüzyon cisimleri olarak havalandırılmamış bir sistein ile eksprese edilir in vitro kademeli diyaliz yoluyla yeniden katlanır ve boyut saflaştırılır. Daha sonra, havalandırılmamış sisteini ile maide konjuge boya ile etiketlenir ve boyutu saflaştırılır. Yine.

Tüm rekombinant proteinler son olarak mililitrede bir miligram proteine konsantre %50 gliserol içeren PBS'ye karşı diyalize edilir ve eksi 20 santigrat derecede uzun süreli çalışmaya başlar. Oran metriğini kullanın URA iki boya Lipid kilinin uyarıcı gücünü doğrulamak için T hücrelerinde hücre içi kalsiyum seviyelerini ölçmek için. T hücresi patlamasını URA 2:00 ester ile yükleyin.

Bu bileşik, hücrelere moty'si yoluyla girer, ancak daha sonra kısmını parçalayan esterazların etkisiyle içinde hapsolur. Litre başına beş mikrom MO'luk bir nihai konsantrasyonda yaklaşık 3 milyon T hücresine fira 2:00 ekleyin. Hücreleri 24 oyuklu plakadan yeni bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Hücreleri, kalsiyum ve magnezyum ve% 1 albümin içeren Hanks tamponlu salin solüsyonu içeren görüntüleme tamponunda bir kez yıkayın. Hücre içi kalsiyumu izlemek için otomatik UV özellikli ters mikroskop sistemi kullanın. Zamanlama protokolünü başlatın ve mikroskop aşamasına odaklanmak üzere yerleştirilmiş işlevselleştirilmiş lipid çift tabakasına daha az sayıda iki yüklü T hücresi ekleyin, düzenli zaman aralıklarında, bir DIC görüntüsü ve 340 ve 380 nanometre UV ışığı ile uyarılmış iki floresan görüntü elde edin.

İki katmanlı temas kurduktan hemen sonra, T hücreleri, koşuya 15 dakika kala URA tarafından okunan yüksek kalsiyum seviyelerini benimser. Tüm PMHC antijenlerini doyuran hücrelere bir bloke edici antikor ekleyin. Sonuç olarak, hücre içi kalsiyum seviyeleri, daha sonra referans olarak hizmet eden aktive edilmemiş durumdaki seviyelere düşer.

Bloke edici antikor mevcut seviyeleri, fret ölçümleri için bire normalleştirdiğimiz, aktive edilmemiş durumu yansıtan bir değere düşer düşmez, T hücresinin her deney için bir TCR reaktif tek zincirli fragman fret probu ile boyanması gerekir, yaklaşık 1 milyon hücreyi bir tüpe aktarın ve bunları 400 G'de döndürün. Bir kağıt havlu ile iç duvarlara yapıştırmak. Bu, daha önce bahsettiğim yaklaşık 30 mikrolitrelik minimum inkübasyon hacmi sağlar.

Perde prope, mililitrede bir miligram ve eksi 20 santigrat derecede% 50 gliserol konsantrasyonunda saklanır. Özellikle Alexa, 5, 5 5 grip, ayrıca üç Probun hücrelere 0.3 mikrolitresinde bir dito protein oranı ile etiketlenmiştir. Peleti birkaç kez dikkatlice hafifçe vurun ve hücreleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.

Hücreleri buz gibi soğuk görüntüleme tamponunda yıkayın. Bu yıkama işlemini bir kez tekrarlayın. İnkübasyon, düşük sıcaklıkta santrifüj depolama, T hücrelerinin floresan probuna maruz kaldıklarında onu içselleştirmemelerini sağlar.

Bu, arka plan floresansının yükselmesine neden olur. Ayrıca, T hücreleri, bilar içeren hazneyi mikroskop tablası değişimine yerleştirmeden önce yıkama ve saklama sırasında probu soğukta kaybetmez. PBS, art arda görüntüleme tamponu ile, çift tabakanın her ne pahasına olursa olsun havaya maruz kalmasını önler, çünkü bu onu yok eder.

Hücresel arka planı azaltmak için çim aydınlatması kullanıyoruz. Bunun için, uyarma ışınını toplam iç yansımanın meydana geldiği kritik bir açıya konumlandırıyoruz. Uyarımı kapatın, geniş ışığı açın ve T hücresini ltec odasına ekleyin ve lipit kilin üzerine yerleşmelerine izin verin.

Uyarımı açın ve çim olmayan bir aydınlatmaya odaklanın. Hücre zarı, her odak düzleminde optik eksen boyunca bir halka olarak gözlenir, çimde sadece çift tabaka ile temas halinde olan bazal zar gözlemlenebilir. Yukarıdaki odak düzlemleri artık uyarılmaz ve bu nedenle görünmez.

Zamanlama protokolü, PMHC ve TCR'yi görüntülemek için kırmızı ve yeşil uyarma yığınları ile başlar ve ardından P-M-H-C-F alıcısını ablate etmek için kırmızı bir ağartma darbesi ile devam eder. F yağ alıcısı ağartmasından sonra TCR'yi görüntülemek için yeşil bir darbe ve F alıcı ablasyon deneylerini doğrulamak için kırmızı bir darbe, birinci ve ikinci yeşil darbeler arasında mümkün olan en kısa gecikme ile saniyenin altında bir zaman ölçeğinde gerçekleştirilir. İsteğe bağlı olarak, başlangıçta bir DIC görüntüsü elde edilebilir, iki renkli görüntü bölme, beslenen donör ve beslenen alıcı kanalın aynı anda algılanmasına olanak tanır.

Beslenen alıcı uyarımı, T hücresi sinapsında P HCS birikimini gösterir. Bu preble görüntüsü, pmc'lerin varlığını doğrular ve zaten TCR aracılı PMHC bağlanmasını gösterir. Heyecanlı. Beslenen donör her iki kanalda da görüntülere yol açar.

Beslenen donör kanalının sinyali, F tarafından kabul edilen kanala enerji transferi nedeniyle yoğunluğu bir dereceye kadar azalır. Perde kabul edilen kanalın sinyali, beslenen donörün perde kanamasından ve perde alıcısının çapraz uyarılmasından oluşur. Her neyse, bu görüntü analiz için kullanılmayacak.

Mevcut protokolde. Hızlı bir ağartıcı yığını, F'nin kabul ettiği tüm floro kuvvetini takip eder ve ortadan kaldırır. Fret kabul edilebilir beyazlatma sonrası F Fed donör görüntüsünün yoğunluğu artık fre kanalında yoğunluk kaybı olmadan daha yüksek seviyelere geri kazanılır.

Aşağıdaki perde alıcısı beklentisi, tam F yağ alıcısı ağartmasını doğrular. Beslenen donör iyileşmesini ölçmek için sinapsa yakınlaşalım. Fre alıcısından bağımsız olarak ortalama arka plan yoğunluğunu bir sabit olarak belirleyin.

Foto ağartma daha sonra sinapsın ve temsili bir TCR kümesinin ortalama yoğunluğunu belirler. Perde verimi daha sonra f alıcı ablasyonundan önceki ve sonraki farkın normalleştirilmesiyle hesaplanır. Örneğimizde, tüm sinaps için %16 fret ve temsilci için %26 fret ölçüyoruz.

TCR küme perde verimleri daha sonra TCR doluluklarına dönüştürülecek ve bu da iki boyutlu sinaptik Ayrışma sabiti tek molekül verisine yol açacaktır. Tek molekül F tehdit deneyleri için sinaptik TCR peptit MHC bağlanmasının kinetiğini çıkarmamız için Bize hizmet edin. Daha önce olduğu gibi aynı reaktifleri ve işçilik stratejisini kullanıyoruz.

Bununla birlikte, tek bir TCR ile tek bir peptit MHC arasındaki etkileşimi gerçekten gözlemlediğimizden emin olmak için aşağıdaki kriteri karşılamayı seçiyoruz. Tek moleküllü bir fre için aday olay, tek fre alıcısı veya fre donör molekülü ile konuşma dilinde olmalıdır. Burada, gözlemlenen fre olayının tek molekül doğasını doğrulamak için fre alıcı molekül olarak tek bir PMHC kullanıyoruz, ancak bunun tersi rasyonel.

Daha yüksek düğmelerde beslemeli alıcıları ve Fred vericileri ve düşük düğmeleri kullanmak kesinlikle bir seçenektir. Tipik olarak, 514 ve 647 nanometre uyarım, ışık sıralı ve tekrarlayan donör ve alıcı uyarımı ile 514 ve 647 nanometre uyarılma ile uyarıcı bir lipid kil ile temas eden T hücrelerini maruz bırakırız, bunu minimum bir milisaniyelik zaman gecikmesi ile takip ederiz. Bu, deneyin gereksinimlerine göre değiştirilebilir.

Uyarıldıktan sonraki milisaniyeler içinde tek kalıp tespiti için yeterince güçlü bir floresan sinyali elde etmek için, santimetre kare başına bir ila beş kilovat arasında değişen yüksek uyarma gücü yoğunlukları uygulamamız gerekir. Foto ağartma nedeniyle, görünür PMHC perde alıcı moleküllerinin sayısı, mikron kare başına 30 veya daha fazla etiketli PMCS içeren bir çift tabakada tek perde alıcı floro kuvvetinin ayırt edilebilir hale geldiği bir seviyeye hızla düşer. Burada 42 milisaniyelik toplam zaman gecikmesi için bir örnek gösterilmektedir.

Kırmızı daire ile işaretlenmiş tek bir perde olayı, ikinci ve üçüncü zaman noktasında görünür hale gelir. Yeşil bir daire ile işaretlenmiş tek bir S beş molekülü ile birlikte lokalize olur. Bu örnekte, gözlemlenebilir fret olayının iki iz uzunluğu vardır, tabloda gösterildiği gibi yaklaşık 128 izde daha fazla tek molekül fret izi toplayın.

Ardından, yeşil sayılarla gösterildiği gibi izlerin tamamlayıcı kümülatif toplamını hesaplayın ve bunları gösterildiği gibi normalleştirin, normalleştirilmiş değerler çizin ve bunları bir mono üstel fonksiyonla eşleştirin. Beklenti değeri 1,5 zaman diliminden biraz fazla. Bu değer, bu iki katkı arasında ayrım yapabilmek için TCR peptidine, MHC bağlanmasına ve foto ağartmaya bağlıdır, bu nedenle beklenti değerinin en az üç farklı zaman için hesaplanması gerekir.

Gecikmeler artık tüm beklenti değerlerini ilgili zaman gecikmelerine göre çiziyor ve veri noktalarını, buradaki kullanım ömrünü içeren gösterilen işleve sığdırıyor. 2.12 saniye ve PHOTOBLEACHING f Fred için beklenti değeri. Burada ve daha önce daha ayrıntılı olarak gösterildiği gibi, F Fred kabul edilebilir ağartma işleminden sonra donör iyileşmesi, immünolojik sinaps içinde etkili oldukları için iki boyutlu ayrışma sabitlerini sadece birkaç adımda belirlemek için kullanılabilir.

Burada analizimizi, T-C-R-P-M-H-C bağlanmasının en belirgin olduğu TCR katılımına ve TCR kümelerine odaklıyoruz. Gösterilen ölçümlerden de anlaşılacağı gibi, F FRED verimleri önemli ölçüde değişir. Bireysel TCR kümeleri için.

F fred verimlerinin orantılılık faktörü C ile çarpılması, TCR doluluğuna yol açar, PMHC'ye bağlı TCR'lerin sayısı ile bunların toplam C sayısı arasındaki oranı tanımlayan bir terim, belirli bir fre çifti seti ve kullanılan FRE sistemi için bir kez belirlenmelidir. Bu sunumun sonuna doğru, örneğin C'nin nasıl belirleneceğini daha ayrıntılı olarak açıklayacağız, bu da özellikle TCR R reaktif tek zincirli antikor fragmanı ve MHC'ye bağlı peptidin C terminali üzerine yerleştirilmiş SI üç ve SI beşi içerir. Yaklaşık iki sinaptik, iki boyutlu ayrışma sabiti, A olarak adlandırılan TCR doluluğundan ve lipit kil üzerinde bulunan pmc'lerin başlangıç yoğunluğundan hesaplanabilir.

Görüntülenen ilişki, kitle eylemi yasasından türetilmiştir ve bu filme eşlik eden makalede daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Örneğimizde, pmcs'nin başlangıç yoğunluğu mikron kare başına 30 moleküldür. Mikron kare başına yaklaşık 34 moleküllük bir medyan değere sahip T hücresi sinapsında etkili olan 2D kds'nin bir dağılımına ulaşıyoruz.

Açık oran dağılımı, sinaptik 2D KD dağılımından ve buradaki karşılık gelen kapalı orandan, 24 santigrat derecede tek molekül perde izi analizi ile belirlendiği gibi saniyede 0.41 olarak hesaplanabilir. Medyan değer, saniyede molekül başına yaklaşık 0.01 mikron karedir. Özetle, TCR ve peptit MHC arasındaki F tehdidi ölçümleri, C iki'deki reaksiyon dinamiklerini tanımlayan tüm kinetik parametrelerin kapsamlı bir analizine izin verir.

Bu metodoloji prensip olarak, hücre hücresi tanımanın ayrılmaz bir parçası olabilecekleri için diğer reseptör ligand etkileşimlerinin analizine genelleştirilebilir. Son olarak, yağ verimlerini TCR doluluklarına dönüştürmek için gerekli olan C sabitinin deneysel olarak nasıl türetileceğini tartışıyoruz. Bu prosedürün yalnızca bir kez yapılması gerekir.

Belirlenen C sabiti daha sonra aynı flor dörtlüsü ile aynı perde sisteminin uygulandığı sonraki tüm deneyler için kullanılabilir. Bu prosedürde, özünde, alıcı foto ağartma işleminden sonra donör geri kazanımı yoluyla bireysel TCR kümelerinde ölçülen perde verimlerini, hassaslaştırılmış perde kanalında tespit edilen karşılık gelen yoğunluk değerlerine aktardık. Daha önce tartışıldığı gibi, perde verimi, perde alıcı ablasyonundan önce ve sonra arka planda düzeltilmiş perde verici kanal görüntülerinden belirlenir.

Hassaslaştırılmış perde kanalının, F donör kanalı ve X ve Y ile hizalanması ve arka plan için düzeltilmesi gerekir. Fred donörü kanar ve Fred burada gösterildiği gibi çapraz uyarımı kabul eder. Makalede Fred donör kanamasının nasıl düzeltileceğine ve Fred'in çapraz uyarılmayı kabul etmesine ilişkin ayrıntılı bir açıklama verilmiştir.

Bu videoya eşlik ederek, şimdi her bir TCR kümesi için düzeltilmiş perde görüntüsünün hata sinyalinin ve karşılık gelen düzeltilmiş perde verici görüntüsünün oranını hesaplayın. Tek perde donörleri ve tek molekül perde olayları için düzeltilmiş ortalama sinyali belirleyin ve oranı hesaplayın. TCR doluluk oranı daha sonra her iki oranın çarpılmasıyla elde edilir.

Şimdi, bireysel TCR kümeleri için TCR doluluklarına karşı belirlenen arsa perde verimleri. C daha sonra burada gösterildiği gibi doğrusal regresyon yoluyla belirlenir. Örneğimizde, ikinci tura tekabül ediyor.

Bu videoyu izledikten sonra, PMHC ve TCR arasındaki sinaptik bağlanma kinetiğini ölçmek için tek moleküllü floresan mikroskobu ile birlikte protein işlevselleştirilmiş bir lipid çift tabakası kullanabilmelisiniz. Protein üretimi, T hücresi etiketlemesi ve son fret ölçümleri dahil olmak üzere gerekli tüm adımlar tartışıldı. Ayrıca, görüntü analizi ayrıntılı olarak gösterilerek T hücresi aktivasyon eğrileri ve fret değerleri elde edildi.

Son olarak, kinetik açma kapama oranlarının belirlenmesinin altında yatan metodoloji gösterilmiştir. Benzer bir yaklaşım, prensip olarak, diğer sinaptik reseptör ligand etkileşimlerini belirlemek için kullanılabilir, ancak uygun modifikasyonların gerekli olduğu kanıtlanabilir.