Name: TCR-pMHC Bağlama Ölçüm In Situ Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 5 s
Description: Öğrenin, FRET tabanlı mikroskopi kullanarak TCR-pMHC bağlanma kinetiğini immunolojik sinaps içinde ölçme yöntemini. Tek molekül çözünürlüğünde afinite ve kinetik parametreleri belirleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MA mali ve idari destek Avusturya Bilim Fonu&#39;nun (FWF, J3086-B11) ve bir teşekkür Schrödinger bursu Max-Planck-Toplum tarafından desteklenmiştir. GS ve JH Viyana Bilim ve Teknoloji Fonu (WWTF, LS13-030) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+TCR+germline+bias+for+MHC+is+surprisingly+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol.%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple.</a> Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).</li>
<li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature.. 463, 963-967 (2010).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interdisciplinary+science+of+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology.%22%5BJournal%5D)">The interdisciplinary science of T-cell recognition.</a> Advances in immunology.. 119, 1-50 (2013).</li>
<li>Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Microscopy+on+Planar+Supported+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vizualized+Experiments+J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Microscopy on Planar Supported Bilayers.</a> Journal of Vizualized Experiments J. Vis. Exp.. 101, e53158(2015).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinkable+pMHC+monomers+stain+T+cells+specifically+and+cause+ligand-bound+TCRs+to+be+preferentially+transported+to+the+cSMAC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinkable pMHC monomers stain T cells specifically and cause ligand-bound TCRs to be preferentially transported to the cSMAC.</a> Nat Immunol. 13, 674-680 (2012).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21, 1387-1395 (2003).</li>
<li>Toebes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+use+of+conditional+MHC+class+I+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Design and use of conditional MHC class I ligands.</a> Nat Med. 12, 246-251 (2006).</li>
<li>Tsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+recovery+of+functional+single-chain+Fv+fragments+from+inclusion+bodies+overexpressed+in+Escherichia+coli+by+controlled+introduction+of+oxidizing+reagent--application+to+a+human+single-chain+Fv+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment.</a> J Immunol Methods. 219, 119-129 (1998).</li>
<li>Ruegg, U. T., Rudinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+cleavage+of+cystine+disulfides+with+tributylphosphine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine.</a> Methods Enzymol. 47, 111-116 (1977).</li>
<li>Ruprecht, V., Brameshuber, M., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+single+molecule+tracking+combined+with+photobleaching+for+the+detection+of+rare+molecular+interactions+in+fluid+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes.</a> Soft Matter. 6, 568-581 (2010).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Davis, M. M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+self+through+two-dimensional+chemistry+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of self through two-dimensional chemistry and synapses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 133-157 (2001).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li>
<li>Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 20296-20301 (2007).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li>
<li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nat Immunol. 5, 524-530 (2004).</li>
<li>Binz, H. K., Stumpp, M. T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+repeat+proteins%3A+well-expressed%2C+soluble+and+stable+proteins+from+combinatorial+libraries+of+consensus+ankyrin+repeat+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins.</a> J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

In situ protein-protein etkileşimlerinin ölçülmesi gibi TCR-pMHC 11 bağlayıcı düşük afiniteli etkileşimler ile ilgili özellikle arzu edilmektedir. On-rate yanı sıra etkileşimlerin stabilitesi önemli ölçüde bağlanma gerçekleşir altında belirli koşullar tarafından etkilenmektedir olmasıdır. Minimal invaziv FRET tabanlı görüntüleme yaklaşımları mükemmel gibi görevler için uygun prensipte böylece, henüz ilk aşılması gereken engellerin bir dizi içerir. Hücresel otofloresansı tarafından oluşturulan gürültü ölçüm hassasiyeti sınırlar ve dolayısıyla, en azından tutulmalıdır. TIRF mikroskopi ideal seçim 13-15 proteinleri ile dekore edilmiş bir düzlemsel cam destekli çift katlı lipid şeklinde, çok iyi 12 bu ihtiyaca hizmet ama cam slaytlar fonksiyonalizasyonunu gerektirir. Kısmen reconstitutive yaklaşımın diğer bir avantajı, rekombinant bilayeri yerleşik FRET ortakları çok m olabilir olduğunuKolayca küçük ve parlak fluorophores ile kantitatif site-spesifik ve akılcı etiketlenmiş cevher hücre yüzey proteinleri ifade ile mümkün olacağını daha. Daha önce 2 test gibi TCR&#39;ler rekombinant SCF V s, T-hücre tanıma etkisi yoktur hangi ile etiketlenmiş. Ayrıca, SLB protein bileşimi, örneğin, pMHCs yoğunluk ve aksesuar faktörler seçimi birinin spesifik ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Biz daha önce uyarıcı pMHCs yoğunluklarını değişen deneyler, ama kapalı 2D-k ve 2D-K D 2 önemli farklılıklar tespit değil. Şimdiye kadar Burada MHC sınıf II molekülleri tanıma esas olarak her iki ucu açık olan kendi peptit bağlanma yarığı, doğası gereği, yalnızca ele alınmıştır ve bu nedenle fluorofor bağlanması için bir bağlayıcı içeren daha büyük bir peptitler barındırmaktadır. Bazı durumlarda bu tür bir yaklaşım, aynı zamanda etiketleme MHC cla için işe yarayabilecekss Ben 16 molekülleri ama büyük dikkat deneylerde kullanılmasını doğrulamak için alınmalıdır. Yüzey plazmon rezonansı ile, in vitro olarak ölçülen T hücresi çoğalma tahlillerinde, hem de kinetik bağlanma pMHC-TCR ile ölçülebilir antijenlere karşı T-hücreleri, duyarlılığı bağlayıcı ve florofora ilavesiyle etkilenmemelidir peptit. Seçenek olarak ise, I molekülleri kendilerini MHC sınıf, ağır zincirin (yayınlanmamış gözlemler) dizisi içinde, bir bozulmamış sistein giriş ile bir site-spesifik bir tarzda etiketlenebilir. Uygun moleküler probların kullanımı ile, herhangi bir sinaptik protein-protein etkileşimi, ilke olarak, burada tarif edilen bir şekilde, incelenebilir. Örneğin bu tür sondalar, SCF V s veya tasarlanan Ankirin tekrarlayın Proteinler (DARPins) 17, tek değerli olmalı ve ilgi etkileşimini etkilemeden stabil hedeflerini bağlamak gerekir. Tabii ki, yapısal information, rasyonel Sonda tasarımı için yüksek ölçüde istenir fakat mutlaka gerekli değildir. FRET ortakları yeni bir çift kurarken, bu kayıt ve ilk toplu FRET analiz etmek önerilir. Etiket eki Yer FRET sinyalini maksimize etmek için önemli ölçüde değişebilir ve aynı zamanda FRET ölçülen verimleri arası boya mesafeye göre farklılık doğrulamak için. Sistem optimize sonra, tek bir molekül sinyalleri% 10-30 yüksek bolluk FRET ortağı etiketleme sınırlandırılması ve tek moleküller aydınlatma alanında çözülebilir kadar düşük bolluk FRET ortağı beyazlatma tarafından kaydedilen olabilir FRET. Son ama en az o SLBs bazı yaklaştığı dikkat ama edilmelidir değil fizyolojik plazma zarı tüm yönleriyle. Membran kavis ve esneklik, alan bölümlendirme ile, iskelet yeniden düzenlemeleri ve hücre hareketi gibi yüzey olarak eksprese edilen membran proteinlerinin yüksek çeşitli gibi nitelikleri SLBs ile temsil değildir, ancak t etkileyebilirO soruşturma altında işlem. Çok çaba TIRF görüntüleme erişilemez fizyolojik sinaps, tek bir molekül çözünürlüğü ile protein-protein etkileşimleri izleme izin görüntüleme yöntemlerini kurmak için yatırım gerekecektir.

T hücreleri antijenleri tanıyan nasıl daha temel bir anlayış T-hücresi ve APC arasında oluşan immunolojik sinaps içinde, yani, doğru yere bakarak gerektirir. Burada moleküler bağlanma kinetiği, sadece selüler kuvvetleri, membran mimari ve zar proteinleri arasındaki yanal etkileşimleri gibi sinaps spesifik geometrik kısıtlamaları bulunmaktadır hücre parametreleri hakkında büyük ölçüde bağlıdır ancak ilgili etkileşme partnerleriyle doğal biyokimyasal özellikleri tarafından belirlenmez 3. Biyokimyasal yaklaşımlar dahil sinaptik membranların en az birinin bozulması gerektirecek gücü çözümünde sınırlıdır. Bu nedenle, bir FRET tabanlı görüntü metodolojisi antijenik pMHCs 2 TCR&#39;nin bağlanmasına izlemek için geliştirilmiştir. İşte T-hücrelerinin bir rekombinant süslenmiştir ve site özellikle TCRβ-reaktif tek zincir antikor fragmanı (SCF V) etiketli ve planı ile karşı karşıya<html> MHC sınıf II flüoresan şekilde etiketlenmiş bir antijenik peptit ile yüklü molekülleri, birlikte uyaran moleküller ve yapışma proteinleri liman ar cam-destekli ikili lipid tabakalarıdır (SLBs). Synaptic Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi bir dökme ve tek bir molekül düzeyinde izlenebilir FRET boya etiketli TCR ve boya etiketli pMHC sonuçları arasında bağlayıcı. Bu makalede, T-hücresi sinaps tahlil için SLBs kullanmak fonksiyonel T hücre kalsiyum akı tahlil yoluyla kendi bütünlüğünü doğrulamak için nasıl ayrıntılı olarak açıklanmıştır, davranış toplu olarak ve tek bir molekül hassasiyeti ile ölçüm FRET ve elde edilen verileri analiz eder. Öneriler iki tabakalı işlevsellik için gerekli düzgün conformed proteinleri üreten sunulmaktadır. Iki tabakalı oluşumu ve uygun bir TIRF mikroskop 4 arka arkaya yayınlanan bir ek kamu erişim vallahi yayına bakınız kurulumu ile ilgili daha özel bilgiler için. çadır &quot;&gt; SLBs Doğası Fonksiyonalitesine SLBs hali hazırda iki lipidler 1-palmitoil-2-oleoil-sn-gylcero-3-fosfokolin ihtiva eden tek katmanlı veziküller (SUV) elde edilebilir (kısaca: POPC,% 90-99) ve 1,2-dioleoil-sn - glisero-3 - {[N- (5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit] süksinil} (kısaca: DGS NTA-Ni, 1-10%). Temiz cam slaytlar yayılan SUV bitişik düzlemsel bilayeri 4 oluşturmak için. DGS-NTA-Ni sentetik NTA-Ni içeren kafa grubu (Şekil 1A) ile polihistidin aracılı karmaşık oluşumu yoluyla polihistidin-etiketli proteinler demirlemek için hizmet vermektedir. Dengeli birleşiminde, bir için, tipik olarak yapışma proteini ICAM-1 ve on iki histidin (ICAM-1-12H, B7-1 -12H) ihtiva eden bir etiket ile birlikte uyaran molekül B7-1 doğal zar-ötesi domen ve sitoplazmik kuyruk yerine (Şekil 1B) . Peptid-yüklenmiş sınıf II molekülü IE k iki membran gömülü (α ve β) polipeptit zincirini içerens. Her iki zincir transmembran / veya sitoplazmik alan içerecek altı histidini her birinin (IE k α 6H β 6H veya IE k -2x6H) ihtiva eden bir etiket ile değiştirilmesi gerekir. Bir alternatif olarak, on iki histidin ile α-zinciri olarak uzanan ve etiketsiz (12H β 0H veya IE k -12H α IE k sebebiyet veren) β-zinciri hücre-dışı alanını terk olarak tatmin edici sonuçlar (Şekil 1B) yol açar. PMHCs Site özel etiketleme Bu anlamlı denge bağlanma sabitleri içine FRET ölçülen verim dönüştürmek mümkün olması için stokiyometrik ve site özellikle pMHC etiketlemek için önemlidir. Bu yeniden birleştirici Histidin ile-etiketlenmiş MHC sınıf II molekülleri 2,5 peptit bağlayıcı yarık içine yüklenen bir sentetik peptidin kimyasal etiketlenmesi sureti ile elde edilebilir. Peptid w T-hücresi epitopunun her edildiği gibi olduğuell sistein ardından kısa bir C-terminal bağlayıcı (GGS) olarak (örn güve sitokrom c (MCC) peptit ANERADLIAYLKQATK- GGSC içinde, bağlayıcı kalın işaretlenir). Bu sistein maleimid-boya türevlerinin kullanımı ile stoikiometrik peptidi etiketlemek için kullanılır. Bu noktada ekstra bakım sistein içeren peptide kantitatif boya-kaplin doğrulayarak tahsis edilmelidir. Peptid-boya adüktü HPLC-temizlemesi tavsiye edilir elektrosprey iyonizasyon kütle spektroskopisi ile takip edilecek olan. (Boya olmadan) peptid Edükt tekabül Herhangi kaydedilmiş kitleler eksik etiketleme yansıtmaktadır. Bu doğru ise, markalama sayısal olarak kabul edilinceye kadar, HPLC ile saflaştırılmış peptid boya etiketleme ardışık mermi tabi tutulmalıdır. Bu yöntem, Örnek iyonizasyon için lazer radyasyonu karıştırmak gibi MALDI-TOF Kütle Spektroskopisi kaçınılması gerektiğini not edin. Peptid kütle böylece underrepre okunur ve önce bu tedavi ekli hassas fluorophores parçalanır<html> boya olan konjügasyon yaratabilecek derece. Tek değerli tek zincirli F V parçalarının kullanımı ile hücre bağlı TCRlerin Dolaylı henüz sahaya özel etiketleme Hala bir site-spesifik bir şekilde yaşayan hücrelerin yüzey ilişkili proteinleri hücre boyaların eklemek zordur. Yüzey maruz TCRler için bu engeli aşmak için, TCRβ-reaktif monoklonal antikor H57-197 2 genleri bir tek-değerli tek zincirli versiyonu (scFv) inşa edilmiştir. TCR ile kompleks, bu antikorun kristal yapısı rasyonel (ilgili FRET, ortak olarak, boya bağlı olduğu), MHC bağlantılı peptit, C-terminaline yakın bir yerde bir serin artık madde ile ikame edildiği bir versiyonu, tasarımı sağlar sistein kalıntısı. Bu mutant sistein daha sonra boya konjugasyon (Şekil 2) için bir alıcı görevi görür. Metodolojileri FRET kaydetmek için nt &quot;&gt; Toplu FRET değerleri seçilen arası boya mesafeler arasındaki ilişkiyi doğrulamak için en uygun olan ve sistem 2 bağlayıcı bu TCR-pMHC ölçülen verimlilik FRET. Buna ek olarak, toplu FRET ölçümler sinaptik TCR-pMHC afiniteleri niteliksel ve niceliksel farklar (ortaya aşağıya bakınız) ve protokol bölüm 3.2. Literatürde 6 girmiştir FRET verimliliği ölçülmesi için çeşitli yaklaşımlar. Bu yazı FRET aracılığıyla kaydedilir In (a) donör kazanım alıcı kasar sonrası ve üzeri (b) FRET alıcı emisyon duyarlı. İlk yöntem (a) kolay photobleached edilebilir FRET alıcı ve oldukça ışığa olan bir verici, kullanımını gerektirir. Buna ek olarak, photobleached alıcı artık verici floresan söndürme kapasitesine sahip olduğundan emin olmak için önemlidir. Aynı tespit kanalı (donör) ölçümü için kullanıldığı gibi, herhangi bir düzeltme, bir faktörlerid hiçbir renk sapmalarını bu metodoloji basit ve güvenilir kılar, hangi dikkate alınması gerekir. Ancak, kantitatif ölçümler aynı numune yerinde tekrar edilemez ve FRET değişiklikler zamanla kaydedilemez. (Alıcı ağartma öncesi) ilk FRET donör ve (FRET alıcı ağartma sonra) ikinci FRET donör görüntü alımı arasında geçen süreyi en aza indirir moleküler difüzyon ya da hızlı bir ağartma aşaması için hedeflenmelidir hücresel hareketlilik, neden etkilerini önlemek için. Bu aydınlatma ve ağartma sürelerini en aza indirmek için FRET alıcı dalgaboyu güçlü bir lazer ışık kaynağı istihdam önerilir. Buna karşılık, (b) sensitize FRET emisyon ölçümü yaklaşımda FRET donör heyecan ve FRET alıcı emisyon FRET alıcı kanal görülmektedir. FRET alıcı sinyali değişiklikler kırmızı kaymıştır alıcı kanalı içine zaman ama FRET donör emisyon üzerine kaydedilebilir (tERMED bleedthrough) ve doğru bir şekilde tespit edilir ve kaydedilir FRET alıcı kanalından çıkartılır gereken donör ile alıcı uyarım çapraz uyarma FRET. Bunun için FRET donör gelen ve FRET alıcı görüntüleri uzamsal uyumlu olması gerekir. Tek bir molekülün Algılama (sm) olayları FRET Uyarım kaynağı, hassas kamera ve gürültü zayıflatılmış TIRF mikroskopi olarak lazerlerin kullanımı ile tek fluorophores floresan kolaylıkla zamanla izlenebilmektedir. Benzer moleküller smFRET etkinlikleri tespiti için de geçerlidir. Bununla birlikte, komplikasyonlar FRET donör bleedthrough ve FRET alıcısının çapraz uyarma neden olduğu ve bu nedenle büyük bir dikkatle smFRET deneyde flüorofor yoğunlukları ayarlarken alınmalıdır olabilir. Aşağıda verilen protokolü (protokol bölüm 4) TCR düşük bolluk içinde FRET alıcı olarak yüksek bolluk ve pMHC de FRET donör olarak seçildi. FR azaltmak içinYeterince floresan SCF V ve floresan olmayan SCF V TCRlerin 90-70 ile% TCRlerin% 10-30 süslemeleri bleedthrough ET verici. O tek molekül ile konfokal kanal FRET olduğundan burada FRET alıcı kanalı tek bir molekül kanalı olarak seçildi. Bu smFRET doğrulama temelidir FRET alıcıları tek bir molekülün, ile smFRET olayları hizalamak için yardımcı olur. SmFRET ölçümlerle sinaptik off-oranları ayıklanıyor Hem photobleaching donör FRET ve alıcı tek bir molekülün gelen etkileşimler izleri FRET yarı ömrünü çıkarılırken hesaba gerekir FRET. Tek verici-alıcı çifti olarak onların görünüm N başında gözlemlenebilir FRET sinyal sayısı (0) reseptör-ligand kompleksi ve photobleaching hem unbinding zaman içinde azalır. Aşağıdaki gibi belirli bir zaman N (t) de kompleksleri hayatta sayısı matematiksel olarak ifade edilebilir: Photobleaching dönem exp (-t / τ çamaşır suyu), zaman t, yani ağartma sadece aydınlatma sırasında meydana gözlem sayısının n ürünü ve (çünkü sürekli olmayan, ayrık gözlem modunda kötü aydınlatma süresi t açıklanan ). Kinetik dönem exp- (t / τ kapalı) zaman t gözlem sayısının n ürün ve tek FRET gözlem (yani kinetik unbinding sürekli olur) zaman t gecikmesi olduğu içinde. Denklem 1 olarak ifade edilebilir: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> Vadeli τ ağartıcı / τ hasta desağartma oluşur ve beklenti değeri &lt;n bleach&gt; olarak üstel fonksiyonu tanımlanır kadar gözlem sayısını cribes. Aşağıdaki gibi Denklem 2 basitleştirilmiş olabilir: <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> T zaman sonra gözlemlenebilir FRET olayları ile kare sayısı N (t) beklenti değeri &lt;n (t gecikme)&gt; doğrudan deney belirlenir. Bu deneyde seçilen gözlemler (t gecikme) ve τ kapalı (off k off-oranının tersi) bilinmeyen değerleri arasında ayarlanabilir süresine bağlıdır ve ağartma oluşmadan önce, gözlem sayısının beklenti değerini &lt;n ağartmak&gt; . Böylece, t, en az iki değeri için beklenen değeri &lt;n (t gecikme)&gt; hesaplanması <sub&gt; lag &lt;n bleach&gt; ve kapatma τ deneysel belirlenmesini sağlar. FRET tabanlı ölçümlerde aracılığıyla sinaptik 2D-K D değerleri ayıklanıyor TCR doluluk yani a, bağlı TCRlerin toplam TCRler arasındaki oranı Ölçme, sinaptik 2D-K D değerlerinin tespiti için merkezi. Sürece TCRleri FRET donörler ve pMHCs FRET alıcıları olarak hizmet olarak elde FRET ölçülen denklem 4&#39;e göre, bu terim ile doğru orantılıdır. <img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> a = TCR doluluk ile, C = dönüşüm faktörü C FRET sistemine bağlıdır ve flüoroforlar kullandığı, bir sabittir. Aşağıda gösterildiği gibi, deneysel olarak tespit edilebilir. Eşitlik 5 uyarınca bir 2D-K, D dönüştürülebilir olduğundaÖnceki iki tabakalı T-hücrelerinin eklenmesinden TCR ligandlarının başlangıç ​​yoğunluğu bilinmektedir. Bunun nedeni SLB bağlı proteinlerin yüksek hareketlilik ve aynı zamanda SLBs ligandlar 2 neredeyse tükenmez haznesini sağlamak çünkü. <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> [pMHC başlangıç] öncesi T-hücrelerinin eklenmesinden pMHC başlangıç ​​yoğunluğu vardır ile Denklemler ile 4 ve 5, bir artık kolayca TCR ve pMHC arasındaki sinaptik 2D-K D belirleyebilirsiniz. Bu en güvenilir bir kabul edici ağartma (protokol bölümü 3.1) sonra donör geri göre FRET ölçümleri yapılır. Ancak, Cl ben FRET FRET yoğunluğu arasındaki ilişkiyi ölçmek ve TCR doluluk bir belirlenmelidir (arka plan için düzeltilmiş, FRET donör bleedthrough ve alıcı çapraz uyarma FRET). Bunun için, tek birBen donör FRET ve tek bir molekülün ortalama yoğunluk olayları ben FRET sm FRET tek TCR-ilişkili FRET donör fluorophores (örneğin Cy3 veya AF555) sm ortalama floresan yoğunluğu arasındaki oran R bilmesi gerekir. R floresan tespiti için kullanılan soru, emisyon filtreleri ve kamerada FRET sistemine bağlıdır. TCR a daha sonra doğrudan denklem 6&#39;ya göre belirlenebilir doluluk. <img alt="Denklem 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> R = sm ile ben FRET donör / sm FRET R neden H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 sistemi için 1.45 olarak belirlendi: a = toplu I 1.45 • / toplu I TCR-Cy3 FRET TCR doluluk a ve FRET verimi arasındaki ilişki FRET donör ile tespit edilebilir kurtarmakalıcı beyazlatma sonrası y. Doğrusal uyum Şekil 4A hayranlarıyla eğimi de gösterildiği gibi bu iki parametre bir sayı TCR microclusters için birbirlerine karşı çizilir için (denklemi 4 itibaren) dönüşüm faktörü C gösterir. 1.995 kadar Cy3 / pMHC-Cy5 FRET sistemi ve (b) uygulanan mikroskop sistem konfigürasyonuna - Şekil 4A gösterildiği gibi, C (a) H57 SCF V tutarlar. TCR aşağıdaki gibi bir kolaylıkla çıkarılabilir Kişiler: TCR doluluk a = 1.995 • verim FRET

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>10000713 bakteri ekspresyonu</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10227402</td><td>Baculo virüsü üretimi için böcek hücre ortamı</td></tr><tr><td>L-glutaminli Insect-XPRESS (Lonza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10564038</td><td>baculo virüsü ekspresyonu için böcek hücresi ortamı</td></tr><tr><td>Sf9 hücreleri</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11496-015</td><td>virüs için hücreler Üretim ve Genişleme</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td><td>Potein ekspresyonu için</td><td>B855-02</td> hücreleri</tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bakteri ekspresyonu</td></tr><tr><td>Centramate System</td><td>Pall</td><td></td><td>protein konsantrasyonu büyük hacimlerden</td></tr><tr><td>Centramate kaset 10kDa kesme</td><td>Pall</td><td>OS010T12</td><td>büyük hacimlerden protein konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>protein konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Üniteleri</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>protein konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Amicon Karıştırılmış Ultrafiltrasyon Hücre Modeli 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>protein konsantrasyonu</td></tr> <tr><td>ve Auml; kta saf 25L</td><td>GE Sağlık</td><td>29-0182-24</td><td>protein saflaştırma</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Sağlık</td><td>17-5175-01</td><td>protein saflaştırma</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Sağlık</td><td>17-5174-01</td><td>protein saflaştırma</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Sağlık</td><td>17-5166-01</td><td>protein saflaştırma</td></tr><tr><td>Ni Sefaroz 6 Hızlı</td><td>Akış GE Sağlık</td><td>17-5318-01</td><td>protein saflaştırması</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 sütun</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>protein saflaştırması</td></tr><tr><td>Gilson HPLC sistemi</td><td>Florokrom bağlı peptitlerin</td><td>Gilson</td><td></td> saflaştırılması</tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 ve mikro; m parçacık boyutu, 21.2 * 250mm sütun boyutu</td><td>Florokrom bağlı peptitlerin saflaştırılması</td><td>A6000250X212</td><td>Agilent</td></tr><tr><td>XRs C18, 5 & m partikül boyutu, 21.2*50 mm kolon boyutu</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>florokrom bağlı peptitlerin saflaştırılması</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 kolon&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>protein saflaştırması</td></tr><tr><td>Gilson HPLC sistemi</td><td>Florokrom bağlı peptitlerin</td><td>Gilson</td><td></td> saflaştırılması</tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 ve mikro; m parçacık boyutu, 21.2 * 250mm sütun boyutu</td><td>Florokrom bağlı peptitlerin saflaştırılması</td><td>A6000250X212</td><td>Agilent</td></tr><tr><td>XRs C18, 5 & m partikül boyutu, 21.2 * 50 mm kolon boyutu</td><td>Florokrom bağlı peptitlerin saflaştırılması</td><td>A6000050G212</td><td>agilent</td></tr><tr><td>Cy3 maleimid</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>mutant eşleşmemiş sisteinler aracılığıyla bölgeye özgü protein etiketlemesi</td></tr><tr><td>Cy5 maleimid</td><td>GE Healthcare</td><td>,</td><td>mutant eşleşmemiş sisteinler aracılığıyla bölgeye özgü protein etiketleme</td></tr><tr><td>PA25031 Alexa Fluor 555 C2 Maleimid</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-20346</td><td>mutant eşleşmemiş sisteinler aracılığıyla bölgeye özgü protein etiketleme</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-20347</td><td>mutant eşleşmemiş sisteinler aracılığıyla bölgeye özgü protein etiketleme</td></tr><tr><td>Fura-2,, hücre bazlı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td> Hücre etiketleme için <td>F-1221</td><td>kalsiyuma duyarlı boya</td></tr><tr>Fura-2 <td>'yi</td> çözmek için<td>dimetil</td><td>sülfoksit Sigma Aldrich</td> 151874 <td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi artı kalsiyum/magnezyum</td><td>Fisher Scientific</td><td>10225362</td><td>görüntüleme tamponu</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin liyofilize toz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>görüntüleme tamponu</td></tr><tr><td>14-4-4S antikor</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td> <td>için ekH2-I-Ek için bloke edici antikor (5c.c7, 2B4 ve AND TCR tarafından tanınır)</td></tr> <tr><td>5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüp</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & mu; m Ultrafree-MC santrifüj filtre ünitesi</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi 0.2 & mikro; m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Mikrokürecikler, 0.1 & m, floresan mavi/yeşil/turuncu/koyu kırmızı</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 bazlı kalsiyum ölçümleri için mikroskop&nbsp;</td><td>LEICA</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>(Tek moleküllü) FRET ölçümleri için</td> mikroskop <td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>ayrıntılar için lütfen Axmann ve arkadaşlarının paralel JoVE katkısına bakın.</td><td></td></tr><tr><td>düzlemsel destekli lipid çift katmanları</td><td></td><td>ayrıntılar için lütfen Axmann ve arkadaşlarının paralel JoVE katkısına bakın.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, L-Glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11554416</td><td>T hücresi ortamı</td></tr><tr><td>esansiyel olmayan amino asit 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>T hücresi medya takviyesi</td></tr><tr><td>penisilin/streptomisin/L-glutamin 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>T hücresi medya takviyesi</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>T hücresi medya takviyesi</td></tr><tr><td>fare interlökin-2 rekombinant protein</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>T hücresi medya takviyesi</td></tr><tr><td>Araştırma Sınıfı Fetal Sığır Serumu</td><td>Hiklonu</td><td>SV30160.03</td><td>T hücresi medya</td></tr><tr><td>takviyesi Menşei (analiz programı)</td> <td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td> <td>iki parametrenin doğrusal olmayan uydurması (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

tcr-pmhc bağlama Ölçüm<em&gt; in situ</em&gt; bir fret tabanlı mikroskopi assay kullanılarak

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T hücreleri, Antijen Sunan Hücrelerin (APC'ler) yüzeyindeki MHC moleküllerine (pMHC) gömülü peptitler formundaki antijenleri tanırken oldukça spesifik ve etkilidir. Bu, bağlanma in vitro1 ölçüldüğünde antijene genellikle orta derecede bir afinite (μM aralığı) uygulayan T hücresi antijen reseptörlerine (TCR'ler) rağmendir. T hücresi antijen duyarlılığına katkıda bulunan moleküler ve hücresel parametreler göz önüne alındığında, canlı bir T hücresinin sinapsı ve bir Antijen sunan Hücrenin (APC) hücre zarını taklit eden yapay ve işlevselleştirilmiş cam destekli düzlemsel lipid çift tabakası (SLB) içinde meydana geldiği için TCR-pMHC bağlanmasını yerinde izlemek için bir araç olarak mikroskopi tabanlı bir metodoloji geliştirilmiştir. Ölçümler, TCR ve pMHC'ye bağlı mavi ve kırmızıya kaymış floresan boya arasındaki Förster Rezonans Enerji Transferine (FRET) dayanmaktadır. FRET'in verimliliği, boyalar arası mesafenin altıncı kuvveti ile ters orantılı olduğundan, sinaptik TCR-pMHC bağlanmasını görselleştirmek için FRET sinyalleri kullanılabilir. Mikroskopi yaklaşımının hassas olması, tek moleküllü FRET olaylarının tespitini destekler. Bu, sinaptik TCR-pMHC etkileşimlerinin afinitesini ve kapalı oranını belirlemeye ve buna bağlı olarak bağlanma oranını enterpolasyona izin verir. Benzer tahliller, doğal ortamlarındaki diğer reseptör-ligand etkileşimlerini ölçmek için uygulanabilir.

Fura-2 kalsiyum boya ile hücre içi kalsiyum kayıt hem de sonraki hücre analizi uyarıcı güç ve Şekil 4&#39;te gösterilmiştir SLBs dolayısıyla özelliğe doğrulamak için. Belirgin hale gibi, kalsiyum düzeyi olarak ifade edilen (T-hücreleri artış Bazal hemen en kısa sürede uyarıcı SLBs üzerine yerleşmek gibi) 1 olmak normalize fura-2 340nm / 380nm oranı. Kalsiyum seviyesi kısa TCR bağlanmasına olan ve blok pMHCs T-hücresi aktivasyonunu sona erdiren bir antikor ilave edildikten sonra taban çizgisi düzeylerine geri döner. Şekil 6, (Şekil 4&#39;te gösterilen) FRET verim ölçülmesi için kullanılır ve 2D-KD değerleri hesaplamak için hizmet eder akseptor ağartma sonra FRET donör iyileşme söz konusu eden tipik bir deney tasvir etmektedir. FRET a hızlı ve tam ablasyonu sonrası AF555 aracılığıyla etiketli TCR temsil FRET donör yoğunluğu artışı, unutmayıncceptor türleri (burada: pMHCs ile ilişkili AF647). Ayrıca belirgin FRET kanalında güçlü azalması, yani FRET alıcı beyazlatma sonra FRET donör uyarma altında FRET alıcı kanalı. Zor görünür kalan sinyal verici bleedthrough FRET karşılık gelir. Bireysel TCR microclusters veya tüm sinaps içinde FRET verimleri hesaplanmış belirtilen ölçülen yoğunluk değerleri (Şekil 6B) dayanmaktadır. Şekil 7, iki zaman dilimlerinde görebilir tek bir molekülün FRET olayının bir yörünge ve zaman atlamalı tasvir etmektedir. Girişte Yukarıda belirtildiği gibi bu tür davranışlar hem bağlayıcı sinaptik TCR-pMHC çürüme ve photobleaching neden olur. Bu iki katılım ayırt etmek için, deneysel kazanım zaman çerçeveleri süresi değişebilir gerekir: photobleaching sabit kalırken, FRET olay yörünge uzunluğu değişiklikler sadece bağlayıcı kinetik kaynaklanır. Tracelengths bir kantitatif w<html> hich Şekil 7&#39;de gösterilen kapanma hızları ve ağartma hesaplanması için temel oluşturur, 3 tablolarda 1 verilmiştir. 2D-K, D s belirlenmesi dökme kayıt FRET verici etiketli TCRler için verim FRET gerektirir. Deneysel olarak çıkarılmış C sabiti (Şekil 4) kullanımı ile, bir TCR microcluster veya bütün bir sinaps için ölçülen FRET verimi TCR içine doluluk dönüştürülebilir bir örneğin, pMHC-yapan ve toplam TCRlerin oranı (Şekil 4C) . Önceden T-hücresi ilavesinden SLB üzerinde mevcut olan, bilinen pMHC yoğunlukları ile, değerlerin sinaptik 2D-Kd değerleri (Şekil 4D) belirlemek için uygulanabilir. On-oranları kitle eylemi yasası ile hesaplanabilir (2D-k = 2D-k / 2D-K D off) tespit sinaptik off-hızı ve 2D-KD değerlerinin. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. düzlemsel cam destekli çift katlı lipid (SLB) sistemin şematik anahat. (A) SLBs gelen lipidler oluşan POPC (% 90-99) ve sentetik yağ DGS Ni-NTA (% 1-10) oluşan ve temiz cam yüzeyler küçük tek tabakalı veziküller (SUV&#39;lar) ile şarj olduğunda kendiliğinden oluşturur. (B) Bir kere oluştuktan sonra, bu SLBs T-hücreleri için APC &#39;lere olarak hizmet etmek için çözünür polihistidin-etiketli hücre dışı pMHCs türetilen kısımlar, birlikte uyaran B7-1 proteinlerinin ve ICAM-1 yapışma proteinleri ile fonksiyonalize edilebilir. SLBs hazırlama hakkında daha fazla bilgi için AXMANN ve ark. 4 bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> 2. Förster Rezonans Enerji Transferi yeniden bazlı analiz TCR-pMHC yerinde bağlayıcı ölçmek için. (A) pMHC çekici bir H57 tek zincirli fragmanı ile kompleks bir TCR&#39;nin bir kompozit yapısı, burada tarif edilen FRET dayalı bir yaklaşım görüntülemektedir. Yaklaşık 41A FRET geçiren iki mukabil fluorophores ayıran kısa mesafe unutmayın. Florofor maleimidler için kabul eden siteler yeşil ve kırmızı belirtilmiştir. (B) in situ TCR-pMHC etkileşimlerinin saptanmasında prensibi gösterilmektedir. Sadece SCF V spesifik kompleksler oluşturan TCRler ve pMHCs (burada IE k), -dekore, ölçülebilir bir sinyal FRET doğuran. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> &quot;/&gt; Şekil SCF V s monomerik ve peptid-yüklü IE k -2x6H moleküllere son jel filtrasyon aşaması veren yükselişi 3. Kromatogramlar. X-eksen ml tutma hacmini temsil Y eksenleri keyfi birimlerinde 280 nm (AU) absorbansı gösterir (A). H57 scFv site spesifik Alexa Fluor 555 maleimid proteini (aşama 1.2.5), reaksiyona girmemiş boya ayırmak için S75 kromatografiye tabi tutuldu ile etiketlenmiş. Tutma aralığı 14 to15 ml (kesik çizgiler) karşılık gelen fraksiyonlar monomerik H57 SCF V etiketli temsil eder. UV parçalanabilen ANP-uzay tutucu peptide ile kompleks (B) IE k -2x6H molekülleri, UV-ışınlanmış edilmiş site, özellikle Alex ile kuluçkaya vardı 647 maleimid-etiketli peptid ve son olarak serbest peptid (aşama 1.1.2.4) proteini ayırmak için S200 kromatografiye tabi tutulmuştur. Içeren uygun bir şekilde katlanmış kesik çizgiler ve monomerik pMHCs arasındaki aralık. (A, B) </strong&gt; 0,7 ml&#39;lik bir numune ROM (0 mi noktası) başlangıcında kolonuna uygulandı. Toplanan fraksiyonlar konsantre edilmiştir. Protein-boya oranı önceki PBS /% 50 gliserol karşı diyalize photospectrometry tespit edildi (-20 ° saklama için). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Şekil 4. belirlenmesi 2D-K D s ve s 2D-k. (A) alıcı beyazlatma ve TCR doluluk deneysel ölçüldü sonra donör iyileşme tarafından belirlenen FRET verimi arasındaki korelasyon. Bölüm 4.2&#39;de açıklandığı gibi TCR doluluk bağımsız TCR ​​microclusters için tespit edilebilir. Verilerin doğrusal bir uygunluğu hattı ile gösterilir, eğimi TCR arasındaki oran C eşittirdoluluk ve FRET verimi. C FRET sistemi ve istihdam floroforlar (burada Cy3 ve Cy5) için sürekli özeldir. Bu örnekte (B). 1.988 vermiştir verim verileri tek tek TCR microclusters belirlenmiştir FRET (N = 187, sıcaklık = 24 ° C) alıcı ağartma verici kurtarma yoluyla. Histogram bar altındaki rakamlar, aralığı içinde, üst sınırını gösterir. Ölçülen çarpılarak (B) &#39;de gösterilen veri (C) dönüştürme (A) C tespit sabit olan verimleri FRET. Barlar altında Sayılar aralığında üst sınırı gösterir. (D) Histogram (yarı-logaritmik taban = 4) Bireysel TCR microclusters için ölçülen 2D-K D s dağılımını gösteren. Medyan 2D-K D mavi gösterilir. Çubuklar altındaki rakamlar, (E) (D) &#39;de gösterilen histogram. Aralığı içinde, üst sınırını gösterir int dönüştürüldüoa 2D-k 24 ° C kapalı sinaptik k istihdam -histogram (yarı-logaritmik, üs = 4) üzerine (0.41 s -1). Değeri belirlenen medyan 2D-k mavi gösterilir. Veriler aslen Huppa ve ark., 2 yayınlandı ve yeni bir formatta burada görselleştirilmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> SLBs Şekil 5. Fonksiyonel doğrulama T-hücresi uyarılması ve görüntüleme için kullanılır. Fura-2 yüklü (A) TCR-transgenik T hücre blastları antijenik pMHCs, ICAM-1 ve B-7 barındıran uyarıcı ile SLB karşıya. Hücresel 340 nm ve 380 nm heyecanlı fura-2 emisyonu yanı sıra DIC görüntüleri kaydedildi. Belirtildiği gibi, emisyon yoğunluklarının oranı değerleri, 34 ° C&#39;de uyarılan0 ve 380 nm sağ panelde gösterilir. Uyarıcı SLBs temas pMHC deneysel çalışma halinde antikorların 14 dakika bloke eklenmesi T hücrelerinin dinlenme karşılaştırılabilir hücre içi kalsiyum seviyelerinde bir azalmaya neden olmuştur. (B) ortalama fura-2 oranlar tipik bir zaman profilini, T-hücreleri, özelliği, antikor aracılı bloke edildikten sonra, antigenin yoksun olmayan, aktive edilmiş T-hücreleri veya T-hücreleri ile karşılaştırıldığında 2 ila 4 kat daha fazla hücre içi kalsiyumda bir ilk artış ile. Yeşil çevreler (A) &#39;da gösterildiği zaman noktalarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> FRET alıcı kasar sonra FRET donör kurtarma yoluyla ölçülen Şekil 6. Toplu verimlerini FRET. <strOng&gt; gösterilir (A), tipik bir sinaptik FRET ölçüm bir örnektir. Soldaki ve üstünde gösterildiği gibi görüntüleri bir dizi, bir FRET donör ve alıcı FRET kanalına sebebiyet veren bir emisyon ışın ayırıcı kullanımı ile elde edilmiştir (ışın bölücülerin ilgili daha ayrıntılı bilgi için AXMANN bakın ark 4). Sol DIC resimde gösterilen hat T-hücresi sinaps sınırını gösterir. (B). Da FRET akseptör ağartma (aşama 4) sonra, FRET verici kanal yoğunluğunda bir artış olduğunu FRET alıcı kanalı içinde yoğunluğu kaybı Not bağımsız sinaptik bölgelere ya da tüm sinaps için belirtildiği gibi verimleri nicelendirilebilir FRET. Muayene için önce ve FRET alıcı kasar sonrası görüntüleri iki arama tabloları (LUT, yeşil ve fizik) kullanımı ile gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </p&gt; <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Şekil 7. Tek molekül olaylar görünür ve insingle adımları kaybolur ve mükemmel bir tek FRET alıcı fluorofor ile hizalanmış FRET. Tek bir molekülün FRET olayı time lapse gösterilir. Görüntüler arka aydınlatmalı EMCCD kamera kullanılarak elde edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Τ kapalı belirlenmesi Şekil 8. = 1 / ölçülen smFRET yörüngeleri kapalı k. (A) 5c.c7 TCR transgenik T hücre patlamaların IE &lt;tanıyan dekore H57 SCF V -AF555 türetilmiş gözlemlenebilir FRET sinyallerinin (normalize kümülatif toplamlarısup&gt; / K3-AF647 dört farklı zaman gecikmelerinin (42 ms, 490 ms, 1007 msn, 1989 msn) 24 ° C) toplam gözlem sayısının bir fonksiyonu olarak çizilmiştir k. Mono-üstel uyum fonksiyonlar. Beklenti değerlerine &lt;n (t gecikme)&gt; olumsuz tersini karşılık doğuran (B) Beklenen değerler gecikmeler t lag karşı çizildi ve &lt;n (t lag)&gt; denklemi kullanılarak monte = τ kapalı / {(&lt;n bleach&gt; / kapalı τ) + t gecikmesi} τ kapalı verim ve &lt;n ağartıcı&gt;. için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Bu el yazması, işlevselleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakası ile temas halinde olan bir T hücresinin immünolojik sinapsı içinde meydana gelirken, T hücresi antijen reseptörü (TCR) ile antijenik peptit yüklü MHC molekülleri arasındaki bağlanma dinamiklerini ölçmek için (tek moleküllü) Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı testlerin nasıl yapılacağını açıklar.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Bu videoda, bir T hücresi ile düzlemsel destekli lipid tabaka arasındaki immünolojik sinaps içerisinde, T hücresi antijen reseptörü ile peptit yüklü majör histokompatibilite kompleksi (pMHC) arasındaki kinetiğin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Protein üretimi ve kalsiyum akışı ölçümleri yoluyla lipid tabakanın fonksiyonel bütünlüğünün doğrulanmasıyla ilgili önemli yönler hakkında size kısa bir rehberlik sunacağız. Lipid tabakanın nasıl hazırlanacağı ve tek molekül floresan mikroskobunun nasıl kurulacağı hakkında daha ayrıntılı bilgi için lütfen Journal of Visualized Experiments'taki paralel katkımıza başvurun. Daha sonra, toplu (bulk) ve tek molekül düzeyinde floresan rezonans enerji transferi ölçümlerinin nasıl gerçekleştirileceğini ve analiz edileceğini ayrıntılı olarak açıklayacağız.Genel yaklaşımımızda kullandığımız FRET tabanlı stratejimizi açıklamak için sinaptik T-hücre reseptörü PMHC bağlanma kinetiğini belirlemek amacıyla, burada mavi renkle gösterilen T-hücre reseptörünün veya TCR'nin, antijeni olan peptid yüklü MHC molekülü veya sarı ve kırmızı ile gösterilen PMHC ile bağlanmış kristal yapısıyla başlıyoruz. Ayrıca, age 57 olarak adlandırılan, T-hücre reseptörü betasına reaktif bir antikorun değişken domenlerinden oluşan tek zincirli bir fragmanı ekliyoruz. Kantitatif FRET tabanlı ölçümler için, hem FRET donörünün (bizim durumumuzda tek zincirli fragman) hem de FRET akseptörünün (PMHC) bölgeye özgü bir şekilde etiketlenmesi zorunludur.Bu işlem, ardından maleimid konjuge Floresen boyaya kovalent olarak bağlanabilen bir sistein kalıntısının eklenmesi yoluyla rekombinant proteinler için gerçekleştirilebilir. Gösterildiği gibi, FRET donörü olan Alexa Fluor 555 veya SI3'ü tek zincirli fragmana ve FRET akseptörü olan Alexa Fluor 647 veya SI5'i MHC'ye bağlı peptidin C-terminusuna bağlıyoruz.Bu kompozit yapıda gösterilen Indy mesafesi yaklaşık 41 angstrumdur ve bu mesafe, iki boya arasındaki yarı maksimal enerji transferi mesafesi olan ilk yarıçaptan bile daha küçüktür. Deneylerimizde, sürveyan antijen sunan hücreler olarak düzlemsel cam destekli lipid çift tabakaları kullanıyoruz. Bunlar PMXC, atory molekül B yedi bir ve adhezyon molekülü I chem bir ile fonksiyonelleştirilmiştir.Bu sayede, arayüze çok yakın konumdaki Flor kuvvetini aydınlatan ve böylece hücresel arka planı önemli ölçüde azaltan toplam iç yansıma floresan modunda görüntüleme yapılabilir. Fret, yalnızca tek zincir fragmanı ile işaretlenmiş TCR'ler katmana gömülü PM hcs ile etkileşime girdiğinde tespit edilebilir. Bu, T-C-R-P-M-H-C bağlanmasını görselleştirmemize ve ardından C iki düzgün katlanmış histo gene Tact içindeki bağlanma kinetiğini hesaplamamıza olanak tanır.P71 ve Ichem1'in hücre dışı kısımları, ilgili BUC virüsü ile enfekte edilmiş böcek hücresi kültürlerinin süpernatanlarından saflaştırılır. Saflaştırma; nikel NTA afinite kromatografisi ile başlayan, ardından iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisinin izlediği üç adımda gerçekleştirilir. His-tagli MHC Sınıf II heterodimerleri, e coli'de inklüzyon cisimcikleri olarak eksprese edilir ve redoks tamponu içinde hızlı dilüsyon yoluyla, 4 °C'de bir yer tutucu peptit varlığında in vitro olarak yeniden katlanır.Yer tutucu peptit, daha sonra UV ışığına maruz bırakılarak parçalanacaktır. Doğru katlanmış PMHC kompleksleri, yer tutucu madde saflaştırılarak ve konsantre edilerek elde edilir. Peptit, pH 5.2'de parçalanır ve floresan peptit ile yer değiştirilir.Nihai ürün boyutla saflaştırılmıştır. Tek zincirli fragman, E. coli'de inklüzyon cisimcikleri olarak serbest bir sistein ile eksprese edilmiş, ardından basamaklı diyaliz yoluyla in vitro refolde edilmiş ve boyutla saflaştırılmıştır. Daha sonra, serbest sisteini üzerinden maleimid konjuge bir boya ile işaretlenmiş ve tekrar boyutla saflaştırılmıştır.Tüm rekombinant proteinler, son olarak 50% gliserol içeren PBS ile diyalize edilerek mililitre başına bir miligram protein olacak şekilde konsantre edilir ve -20 °C'de uzun süreli olarak saklanır. Lipid tabakasının stimülatuar gücünü doğrulamak amacıyla, T hücrelerindeki hücre içi kalsiyum seviyelerini ölçmek için rasyometrik URA iki boyası kullanın. T-hücre blastlarını URA 2:00 AM esteri ile yükleyin.Bu bileşik hücrelere AM grubu aracılığıyla girer, ancak daha sonra AM kısmını koparan esterazların etkisiyle hücre içinde hapsolur. Yaklaşık 3 milyon T hücresine, litre başına beş mikromolar nihai konsantrasyonda fira 2:00 AM ekleyin. Hücreleri 24 kuyucuklu plakadan yeni bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Hücreleri, kalsiyum ve magnezyum içeren Hanks dengeli tuz çözeltisi ve %1 albümin içeren görüntüleme tamponu ile bir kez yıkayın. Hücre içi kalsiyumu izlemek için UV kapasiteli otomatik bir ters mikroskop sistemi kullanın. Zamanlama protokolünü başlatın ve mikroskop tablasında odaklanmış durumda olan fonksiyonelleştirilmiş lipid çift tabakasına iki yüklü T hücresinden daha azını ekleyerek düzenli zaman aralıklarında bir DIC görüntüsü ile 340 ve 380 nanometre UV ışığı ile uyarılan iki floresan görüntü alın.Çift katman teması kurulduktan hemen sonra, çalışmanın 15. dakikasındaki URA iki oran okumasına göre T hücreleri yüksek kalsiyum seviyeleri sergiler. Tüm PMHC antijenlerini doyuracak bir bloklama antikoru hücrelere ekleyin. Bunun sonucunda, hücre içi kalsiyum seviyeleri, daha sonra referans olarak kullanılacak olan aktive edilmemiş durum seviyelerine düşer.Bloke edici antikor seviyeleri, FRET ölçümleri için bir olarak normalize ettiğimiz ve nonaktif durumu yansıtan bir değere düştüğünde, her deney için T hücrelerinin TCR reaktif tek zincirli fragman FRET probu ile boyanması gerekir; yaklaşık 1 milyon hücreyi bir tüpe aktarın ve 400 G'de çöktürün. Besiyerini dökün ve iç duvarlara yapışmış kalan besiyeri damlacıklarını bir kağıt havlu ile temizleyin. Bu işlem, daha önce belirttiğim yaklaşık 30 µL'lik minimum inkübasyon hacmini sağlar.FRET probu, 1 mg/mL konsantrasyonda ve %50 gliserol ile -20 °C'de saklanır. Prob, hücrelere 0,3 µL oranında eklendiğinde, protein başına bir oranla ya Alexa Fluor 555 ya da Alexa Fluor 647 ile bölgeye özgü olarak işaretlenmiştir. Peleti birkaç kez dikkatlice hafifçe sallayın ve hücreleri 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Hücreleri buz gibi soğuk görüntüleme tamponu ile yıkayın. Bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. İnkübasyon, santrifügasyon ve düşük sıcaklıkta saklama işlemleri, T hücrelerinin floresan proba maruz kaldıkları sırada probu internalize etmemelerini sağlar.Bu durum, arka plan floresansının artmasına neden olur. Ayrıca, T hücreleri, kamarayı içeren bilar mikroskop sahne değişimine yerleştirilmeden önce yapılan yıkama ve saklama işlemleri sırasında soğukta probu kaybetmezler. PBS'in sırayla görüntüleme tamponu ile değiştirilmesi, çift katmanın havayla temasını her ne pahasına olursa olsun önler; çünkü bu temas katmana zarar verir.Hücresel arka planı azaltmak için turf aydınlatma yöntemini kullanıyoruz. Bunun için, eksitasyon ışınını toplam iç yansımanın gerçekleştiği kritik açıya konumlandırıyoruz. Eksitasyonu kapatın, geniş alan ışığını açın, T-hücresini ltec haznesine ekleyin ve lipid tabakası üzerine çökmelerini bekleyin.Uyarılmayı açın ve turf dışı bir aydınlatmaya odaklayın. Hücre membranı, her odak düzleminde optik eksen boyunca bir halka şeklinde gözlenir; turf'ta ise sadece bilayer ile temas halindeki bazal membran gözlemlenebilir. Üstteki odak düzlemleri artık uyarılmaz ve bu nedenle görünür değildir.Zamanlama protokolü, PMHC ve TCR görüntülemesi için kırmızı ve yeşil eksitasyon darbeleriyle başlar ve ardından P-M-H-C-F akseptörünü yok etmek için bir kırmızı ağartma darbesiyle devam eder. F yağ akseptörü ağartmasından sonra TCR'yi görüntülemek için bir yeşil darbe ve F akseptörü yok etme deneylerini doğrulamak için bir kırmızı darbe, birinci ve ikinci yeşil darbeler arasındaki mümkün olan en kısa gecikme ile saniyenin altında bir zaman ölçeğinde gerçekleştirilir. Opsiyonel olarak, başlangıçta bir DIC görüntüsü elde edilebilir; iki renkli görüntü ayırma, donör ve akseptör kanallarının eş zamanlı olarak tespit edilmesine olanak tanır.Beslenen akseptör eksitasyonu, T hücresi sinapsındaki P HCS birikimini göstermektedir. Bu ön görüntü, pmcs varlığını doğrular ve halihazırda TCR aracılı PMHC bağlanmasını gösterir. Heyecan verici. Beslenen donör, her iki kanalda da görüntüler oluşturur.Beslenen donör kanalının sinyali, F akseptör kanalına enerji transferi nedeniyle bir dereceye kadar şiddette azalma gösterir. FRET akseptör kanalının sinyali, beslenen donörün FRET sızıntısından (bleed through) ve FRET akseptörünün çapraz uyarılmasından oluşur. Her halükarda, bu görüntü analiz için kullanılmayacaktır.Mevcut protokolde, hızlı bir ağartma işlemi uygulanarak tüm kabul edilen floroforlar ortadan kaldırılır. Fret kabul ağartması sonrası F donör görüntüsünün yoğunluğu, fret kanalında herhangi bir yoğunluk kaybı olmaksızın yeniden daha yüksek seviyelere çıkarılır.Aşağıdaki FRET akseptör beklentisi, tam F fat akseptör ağartmasını doğrular. FRET donör geri kazanımını nicelendirmek için sinapsa yakınlaşalım. FRET akseptöründen bağımsız olarak sabit olan ortalama arka plan yoğunluğunu belirleyin.Ardından fotobloklama (photobleaching) yapılır ve sinapsın ortalama yoğunluğu ile temsili bir TCR kümesinin yoğunluğu belirlenir. FRET verimi, f akseptör ablasyonu öncesi ve sonrası fark normalize edilerek hesaplanır. Örneğimizde, tüm sinaps için %16 FRET ve temsili küme için %26 FRET ölçüyoruz.TCR küme fret verimleri daha sonra, iki boyutlu sinaptik Disosiyasyon sabiti tek molekül verilerini oluşturan TCR doluluk oranlarına dönüştürülecektir. Bu, tek molekül FRET deneyleri için sinaptik TCR peptid MHC bağlanma kinetiğini belirlememize yardımcı olur. Daha önce kullanılan reaktiflerin ve etiketleme stratejisinin aynısını kullanıyoruz.Bununla birlikte, gerçekten tek bir TCR ile tek bir peptid MHC arasındaki etkileşimi gözlemlediğimizden emin olmak için aşağıdaki kriteri karşılamayı tercih ediyoruz. Tek moleküllü bir FRET olayı için aday bir olayın, tek bir FRET akseptör veya FRET donör molekülü ile örtüşmesi gerekir. Burada, gözlemlenen FRET olayının tek moleküllü doğasını doğrulamak için tek bir pMHC'yi FRET akseptör molekülü olarak kullanıyoruz, ancak aynı mantık tersi için de geçerlidir.Üst bölgelerde fed akseptörlerin ve alt bölgelerde Fred donörlerin kullanılması kesinlikle bir seçenektir. Genellikle, uyarıcı bir lipid tabakasıyla temas eden T hücrelerini 514 ve 647 nanometre eksitasyon ile inceliyoruz; bir milisaniyelik minimum zaman gecikmesiyle takip edilen sıralı ve tekrarlayan donör ve akseptör eksitasyonundan sonra bekleme süresi gelir. Bu süre, deneyin gereksinimlerine göre değiştirilebilir.Uyarılmadan sonraki milisaniyeler içinde tek bir boya tespiti için yeterince güçlü bir floresan sinyali elde etmek amacıyla, santimetrekare başına bir ile beş kilowatt arasında değişen yüksek uyarım güç yoğunlukları uygulamamız gerekir. Fotobeyazlama nedeniyle, görünür PMHC fret akseptör moleküllerinin sayısı, kare mikron başına 30 veya daha fazla etiketli PMCS içeren bir çift katmanda tekil fret akseptör fluro kuvvetlerinin ayırt edilebileceği bir seviyeye hızla düşer. Toplam 42 milisaniyelik bir zaman gecikmesi için bir örnek burada gösterilmiştir.Kırmızı daire ile işaretlenen tek bir FRET olayı, ikinci ve üçüncü zaman noktalarında görünür hale gelir. Bu olay, yeşil daire ile işaretlenmiş tek bir S5 molekülü ile ko-lokalize olur. Bu örnekte, gözlemlenebilir FRET olayının iz uzunluğu ikidir; "some 128 traces" tablosunda gösterildiği gibi daha fazla tek molekül FRET izi toplayın.Ardından, yeşil sayılarla gösterildiği gibi izlerin tamamlayıcı kümülatif toplamını hesaplayın ve bunları gösterildiği gibi normalize ederek normalize edilmiş değerleri grafiğe dökün ve tek bir eksponansiyel fonksiyonla uydurun. Beklenen değer 1,5 zaman diliminden biraz fazladır. Bu değer TCR peptidine, MHC bağlanmasına ve fotobeyazlamaya bağlıdır; bu iki katkıyı ayırt edebilmek için beklenen değerin en az üç farklı zaman için hesaplanması gerekir.Şimdi tüm beklenen değerleri ilgili zaman gecikmelerine karşı grafiğe dökün ve veri noktalarını, burada ömrü içeren gösterilen fonksiyona uydurun. 2,12 saniye ve PHOTOBLEACHING için beklenen değer f Fred. Burada ve daha öncesinde daha detaylı olarak gösterildiği gibi, F Fred kabul edilebilir ağartma sonrası donör geri kazanımı, immünolojik sinaps içinde etkili oldukları haliyle iki boyutlu disosiyasyon sabitlerinin sadece birkaç adımda belirlenmesi için kullanılabilir.Burada analizimizi, TCR etkileşimine ve TCR-pMHC bağlanmasının en belirgin olduğu TCR kümelerine odaklıyoruz. Gösterilen ölçümlerden anlaşıldığı üzere, F FRED değerleri önemli ölçüde farklılık göstermektedir. Münferit TCR kümeleri için.F fred değerinin C orantı faktörü ile çarpılması, PMHC'ye bağlı TCR'lerin sayısının toplam sayıya oranını tanımlayan bir terim olan TCR doluluğunu ortaya çıkarır. C faktörü, belirli bir set fre çifti ve kullanılan FRE sistemi için bir kez belirlenmelidir. Bu sunumun sonunda, örneğin, özellikle TCR R reaktif tek zincirli antikor fragmanı ve MHC'ye bağlı peptidin C terminusuna yerleştirilmiş SI üç ve SI beş'i içeren C'nin nasıl belirleneceğini daha ayrıntılı olarak açıklayacağız. Yaklaşık iki sinaptik, iki boyutlu disosiyasyon sabiti, TCR doluluğu olarak adlandırılan A'dan ve lipid tabakada bulunan başlangıç pMHC yoğunluğundan hesaplanabilir.Gösterilen ilişki, kütle etki yasasından türetilmiştir ve bu videoya eşlik eden makalede daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Örneğimizde, pmc'lerin başlangıç yoğunluğu kare mikron başına 30 moleküldür. T-hücresi sinapsında etkili olan 2D kd'lerin, kare mikron başına yaklaşık 34 molekül medyan değerine sahip bir dağılımına ulaşıyoruz.Açılma hızı (on rate) dağılımı, sinaptik 2D KD dağılımından ve buna karşılık gelen, 24 °C'de tek molekül FRET iz analizi yoluyla belirlenen saniyede 0,41'lik kapanma hızıyla (off rate) hesaplanabilir. Medyan değer yaklaşık olarak molekül başına saniyede 0,01 kare mikrondur. Özetle, TCR ve peptit MHC arasındaki FRET ölçümleri, C2'deki reaksiyon dinamiklerini tanımlayan tüm kinetik parametrelerin kapsamlı bir şekilde analiz edilmesine olanak tanır.Bu metodoloji, prensipte, hücre hücre tanıması için bütünsel olabilecek diğer reseptör ligand etkileşimlerinin analizine de genelenebilir. Son olarak, yağ verimlerini TCR doluluk oranlarına dönüştürmek için gerekli olan C sabitinin deneysel olarak nasıl elde edileceğini tartışıyoruz. Bu prosedürün yalnızca bir kez gerçekleştirilmesi yeterlidir.Belirlenen C sabiti, aynı floroforlara sahip aynı FRET sisteminin uygulandığı sonraki tüm deneyler için kullanılabilir. Bu prosedürde, temelde, akseptör fotoblokaj sonrası donör geri kazanımı yoluyla tekil TCR kümelerinde ölçülen FRET verimlerini, sensitize edilmiş FRET kanalında saptanan ilgili yoğunluk değerlerine ilişkilendirdik. Daha önce tartışıldığı üzere, FRET verimi, FRET akseptör ablasyonu öncesi ve sonrası arka planı düzeltilmiş FRET donör kanalı görüntülerinden belirlenir.Hassaslaştırılmış FRET kanalı, F donör kanalı ile X ve Y eksenlerinde hizalanmalı ve arka plan düzeltmesi yapılmalıdır. Burada gösterildiği gibi FRET donör sızıntısı (bleed-through) ve FRET akseptör çapraz uyarımı düzeltilmelidir. FRET donör sızıntısı ve FRET akseptör çapraz uyarımının nasıl düzeltileceğine dair ayrıntılı bir açıklama makalede sunulmuştur.Bu videoyu takip ederek, şimdi her bir TCR kümesi için düzeltilmiş fret görüntüsünün bug sinyalinin, karşılık gelen düzeltilmiş fret donör görüntüsüne oranını hesaplayın. Tekil fret donörleri ve tek moleküllü fret olayları için düzeltilmiş ortalama sinyali belirleyin ve oranı hesaplayın. TCR doluluk oranı, ardından her iki oranın çarpılmasıyla elde edilir.Şimdi, bireysel TCR kümeleri için belirlenen FRET verimlerini, TCR doluluk oranlarına karşı grafiğe dökün. C değeri daha sonra burada gösterildiği gibi lineer regresyon aracılığıyla belirlenir. Bizim örneğimizde, bu değer yaklaşık olarak ikiye tekabül etmektedir.Bu videoyu izledikten sonra, PMHC ve TCR arasındaki sinaptik bağlanma kinetiğini ölçmek için tek molekül floresan mikroskopisi ile kombinlenmiş protein fonksiyonelleştirilmiş bir lipid çift katmanını kullanabilmeniz gerekir. Protein üretimi, T hücresi işaretlemesi ve nihai FRET ölçümlerini içeren tüm gerekli adımlar tartışılmıştır. Ayrıca, T hücresi aktivasyon eğrileri ve FRET değerleri sağlayan görüntü analizi ayrıntılı olarak gösterilmiştir.Son olarak, kinetik açma-kapama hızlarının belirlenmesinin temelindeki metodoloji gösterilmiştir. Prensipte, uygun modifikasyonların gerekli olabileceği durumlar olsa da, benzer bir yaklaşım diğer sinaptik reseptör ligand etkileşimlerini belirlemek için de kullanılabilir.

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Bağışıklık hücrelerinde fizyolojik olarak ilgili substrat konsantrasyonları altında mitokondriyal biyoenerjetik çalışma yöntemleri sınırlıdır. İnsan T hücrelerinde, monositlerde ve periferik mononükleer hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin enerji talebine tepkisindeki değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri kullanan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan bağışıklık hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyelindeki dinamik değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri

Öğrenin, FRET tabanlı mikroskopi kullanarak TCR-pMHC bağlanma kinetiğini immunolojik sinaps içinde ölçme yöntemini. Tek molekül çözünürlüğünde afinite ve kinetik parametreleri belirleyin.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm

Daha fazla video keşfet