Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

Bu videoda, biyofonksiyonelleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakalarının nasıl hazırlanacağını ve karakterize edileceğini göstereceğiz. Ayrıca, tek molekül tespit yeteneklerine sahip bir toplam iç yansıma mikroskobunun mimarisini ayrıntılı olarak açıklayacağız. Lipid tabakasının eksitasyon güç yoğunluğunu, akışkanlığını ve protein yoğunluğunu ölçeceğiz.

Planar cam destekli lipid çift tabakasına kısa bir girişle başlayalım. Küçük tek tabakalı veziküller temiz bir cam yüzeyle karşılaştıklarında, patlayarak yayılırlar ve sürekli bir lipid çift tabakası oluştururlar. Su yastığı üzerinde genellikle PALM materyali seçeriz.

Oleofosfokolin veya POPC, oda sıcaklığında ve 37 °C'de akışkan lipid çift tabakaları oluşturduğu için baskın lipid olarak kullanılır. Fonksiyonelleştirme için, polihistidin etiketli proteinlere bağlanan, nikel şelatlayıcı bir baş grubuna sahip sentetik bir lipid olan nikel antiox ekleriz. Örneğin, burada gösterildiği gibi ko-stimülatör molekül B7-1, adezyon molekülü ICAM-1 ve T-hücresi tanıma işlemi için floresan etiketli peptit yüklü MHC molekülü kullanılabilir; ancak bu çift tabaka sistemi, prensipte çeşitli biyolojik sistemlerde tamamen farklı süreçleri ele almak için de kullanılabilir.

Planar sistemin doğası gereği, floresan olayları, hücresel arka planı önemli ölçüde azaltan ve tek molekül floresan mikroskobisi için oldukça uygun olan toplam iç yansıma modunda izlenebilir. Lipid hazırlığı için POPC ve nikel lipidlerine, kloroforma ve temiz bir yuvarlak tabanlı balona ihtiyaç vardır; lipidleri istenen oranda kloroform içerisinde çözün ve burada gösterildiği gibi vakum altında kurutun. Gece boyunca uygulanan yüksek vakum işleminin ardından, lipidler balonun iç kısmında bir film tabakası oluşturur. Lipidlerin rehidratasyonu için degaze PBS kullanın ve kurutulmuş lipid karışımına 10 mL degaze PBS ekleyin.

Karıştırmayın. Lipit oksidasyonunu önlemek için erleni azot veya argon gibi inert bir gazla doldurup erleni döndürün. Lipitler sütlü bir süspansiyon oluşturur.

Bir sonraki adımda gaz değişimini önlemek için spektrofotometre için boş örnek (blank) olarak küçük bir numune alın. Lipid süspansiyonunu içeren balon jojenin düzgünce sızdırmaz hale getirilmesi çok önemlidir. Kapalı bir ultrasonik banyo kullanılarak fiziksel oluşum sırasında hava koruması sağlamak için ısıya dayanıklı bir yapışkan bant, örneğin otoklav bandı kullanın.

Balon जो mount edildikten sonra, sonikasyon işlemine 170 watt maksimum güçte başlayın. 60 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Fiziksel oluşum nedeniyle bulanıklık önemli ölçüde azalmıştır.

Bu durum, 550 nanometrede spektrofotometri ile doğrulanabilir. Sonikasyon öncesinde alınan alikotu kör olarak kullanın. Lipid miktarının göstergesi olan 230 nanometredeki optik yoğunluk sabit kalmalıdır.

Burada, küçük ultra santrifüj tüplerini bir mililitre visl süspansiyonu ile dolduruyoruz ve bunları bir masaüstü ultra santrifüjün sabit açılı rotoruna yerleştiriyoruz. Bilayer hazırlığı için yalnızca küçük tek katmanlı veziküllerin kullanılması çok önemlidir. Sonikasyon sırasında da oluşan daha büyük ve daha yoğun çok katmanlı veziküller, bilayer akışkanlığını bozar ve bu nedenle santrifüj yoluyla çöktürülüp uzaklaştırılmalıdır.

İlk olarak, oda sıcaklığında 150.000 G'de bir saat boyunca santrifüj yapıyoruz. Elde edilen snat daha sonra 4 °C'de 288.000 G'de sekiz saat daha santrifüj edilir. Lipid veziküllerinin üzerinde yayılarak kesintisiz ve akışkan bir çift katman oluşturabilmesi için cam lamların çok temiz olması gerekir.

Bunun için, lamelleri bir Teflon kalıba yerleştiririz ve ardından bunları bir cam kaba koyarız. Göz koruyucu, koruyucu eldiven ve laboratuvar önlüğü kullanarak, bir kimyasal çekmecesinde çalışırken büyük özen gösteriniz. Bir birim %30 hidrojen peroksit ve ardından, çok reaktif ve oksidatif olan perimono sülfürik asit oluşması için üç birim konsantre sülfürik asit ekleriz.

Bu karışım; cildiniz, gözleriniz ve giysilerinizdekiler de dahil olmak üzere organik maddelerle şiddetli bir şekilde reaksiyona girer. Anında ısınır. Lamları 30 dakika boyunca inkübe edin.

Lamelini bir penset yardımıyla tutun. Temiz lamelin her iki tarafındaki asidi, çift distile veya yüksek kaliteli iyonize edilmemiş su kullanarak iyice yıkayın. Ardından, aynı anda birkaç ayrı lipid çift katman üretmek için lameli bir Teflon standın üzerine yerleştirin ve 10 dakikadan fazla olmamak kaydıyla kurumaya bırakın. Kurutulmuş lamelleri hızlı donan yapıştırıcı ile yapıştırıyoruz.

Sekiz veya 16 kuyucuklu bir lab tech odasına iki bileşenli epoksi yapıştırıcı uygulayın. Öncelikle, orijinal lept lamını çerçevesinden dikkatlice çıkarın. İki yapıştırıcı bileşenini bir bölü bir oranında karıştırın.

Yapıştırıcıyı oda çerçevesinin alt kanallarına eşit şekilde yayın. Temiz lamel camını, oda çerçevesinin yapıştırıcıyla kaplanmış altına yerleştirin. Yapıştırıcının cam lam ile plastik çerçeve arasında eşit şekilde yayıldığından emin olun.

Yapıştırıcının 30 dakika boyunca sertleşmesini bekleyin. Lipid fiziksel süspansiyonunu PBS ile 1/10 oranında seyreltin ve 0,2 mikronluk bir filtreden süzün; bu seyreltiden sekiz kuyucuklu bir haznenin her bir kuyucuğuna 120 microliters veya 16 kuyucuklu bir haznenin her bir kuyucuğuna 60 microliters ekleyin. Tüm cam yüzeyin kaplandığından emin olun ve 20 dakika bekleyin.

Çift katman artık oluşmuştur. Artıkları gidermek için her bir kuyucuğu 30 milliliters PBS ile durulayın. Cam yüzeyin hava ile temas etmesinden kesinlikle kaçının; bu durum çift katmanı anında yok edecektir. Sonraki protein dekorasyonu adımı için, her bir kuyucuğun aynı tampon hacmine sahip olduğundan emin olmak amacıyla her kuyucuğu tamamen doldurun ve sıvı kubbeyi kaldırın.

330 µL alın. Bu işlem sonucunda her bir kuyucukta yaklaşık 350 µL kalacaktır. Çift tabakayı proteinlerle dekore etmek için, seçilen poli histidin etiketli proteinleri içeren bir ana karışım (master mix) hazırlayın ve her bir kuyucuğa bundan 50 µL ekleyin.

Tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için proteinler, koyu renkli lipidin nikel karşıt baş grubuna bağlanır; iyice ancak dikkatlice karıştırın ve bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için her zaman 60 dakika inkübe edin. 30 ml PBS ile tekrar yıkayın. Şimdi mikroskopi donanımına odaklanalım.

İlk olarak, objektif tabanlı TIRF mikroskopisi için toplam iç yansıma mikroskopisinin gereksinimlerini açıklayacağız. Yüksek nümerik açıklığa sahip bir yağ daldırma objektifi gereklidir. Gelen lazer eksitasyon ışını dikroik ayna tarafından yansıtılır ve iki veya üç lensten oluşan bir set aracılığıyla yalnızca objektifin arka odak düzlemine odaklanır.

Ardından lazer ışığı, objektife kaplanmış bir ışın olarak optik eksen boyunca iletilir. Bu sayede, floresan numune tüm derinliği boyunca aydınlatılır. Işını optik eksene dik olarak yer değiştirdiğinizde, ışın kolime kalmaya devam eder ancak objektiften eğik bir şekilde çıkar.

Translokasyona devam ederseniz, bir noktada ışının cam lamel ile numune arasındaki ara yüzeyde tamamen yansıdığı kritik açıya ulaşacaksınız. Ortaya çıkan evanesan dalganın yoğunluğu üstel olarak azalır ve yalnızca ara yüzeye birkaç yüz nanometreye kadar yakın olan zemin katları uyarılır. Şimdi, lazer ışınının objektifin arka odak düzlemine manuel olarak nasıl odaklanacağını göstereceğiz.

Üç veya iki mercek kullanıldığında, ilk iki mercek ile lazer ışınının çapı artırılır. Odak uzaklıklarının oranı, numune düzlemindeki aydınlatma noktasının boyutunu belirler. Işının kolime kalmasını sağlamak için, bu mercekler arasındaki mesafeyi her iki odak uzaklığının toplamına eşit olacak şekilde ayarlayın.

Üçüncü mercek, genişletilmiş demeti objektifin arka odak düzlemine odaklamak için kullanılır. Bu merceğin odak uzaklığının, mikroskop gövdesinin ve ilişkili bir periskobun boyutlarına uyum sağlaması gerektiğinden, bizim durumumuzda çok daha uzun, değişken olarak 75 santimetre olmalıdır. İkinci ve üçüncü mercek arasındaki mesafenin demet özellikleri üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.

Bu nedenle, aradaki sonsuz uzay, ışını bozulmalar olmadan tanımlı bir şekilde modifiye etmek için kullanılabilir. Örneğin, bir açıklık (aperture) yerleştirerek numune düzlemine hassas bir şekilde projeksiyon yapabilirsiniz. Esas itibarıyla, üç lens yerine iki lens kullanarak da aynı sonucu elde edebilirsiniz.

İki mercekli sistem daha az tanımlıdır ancak daha az mercek aberasyonuna yol açar. Diyafram gibi basit özellikler, zamansal modülasyon için hala çok iyi bir şekilde uygulanabilir. Gaz, demir veya katı hal lazeri; örneğin mekanik bir shutter veya optik bir modülatör gibi milisaniye aralığında çalışan bir shutter'ın önüne yerleştirilmelidir.

İyi bir alternatif, elektronik olarak modüle edilebilen ve harici bir kapatıcıya ihtiyaç duymayan diyot lazerdir. Işını herhangi bir yere ve herhangi bir yöne yönlendirmek için iki ayna yeterlidir. Daha önce tartışıldığı gibi, iki lens ışını genişletmek ve mikroskop objektifinin arka odak düzlemine odaklamak için kullanılır.

Periskobun alt aynasını bir optik ray üzerinde kaydırarak, turf konfigürasyonu için ışını translokasyonla taşıyabiliriz. Görüntü tespiti için yüksek hassasiyetli bir kamera kullanırız. Örneğin, elektron çarpan yüklü cihaz veya em CCD. Farklı dalga boyuna sahip ikinci bir lazer ışını, ışın yoluna hizalanabilir.

Aynaların ve dikroik bir kaplamanın kullanımıyla. Eş zamanlı iki renkli tespit için, emisyon yoluna ticari olarak mevcut bir ışın ayırma cihazı yerleştiriyoruz. Deneyler için, iki bağımsız eksitasyon ışını yolunun mevcut olması oldukça yararlıdır.

Örneğin, biri turf görüntüleme, ikincisi ise hedefli fotobezleme veya aktivasyon için kullanılabilir. Bu durum, bir dizi 2 adet 50 50 demet ayırıcı uygulanarak kolayca gerçekleştirilebilir. İllüstrasyonumuzda gösterildiği gibi, iki farklı lens ve ayna ayar sistemi, iki ayrı demet profili ve demet açısı oluşturacaktır.

Örneğin, çim alanlarda görüntüleme için genişletilmiş bir tane ve çim olmayan alanlarda ağartma veya aktivasyon için daha odaklanmış bir tane kullanılabilir. Ağartma veya aktivasyon noktasını hassas bir şekilde şekillendirmek için çim olmayan ışın yoluna bir diyafram yerleştirilebilir. Her bir ışın yolu için bir tane olmak üzere iki ek panjur, objektifi eğilmemiş düz bir yolda bırakarak lazer ışınının bağımsız kontrol anahtarını etkinleştirir.

Güç ölçeri açın ve ilgili lazer dalga boyuna ayarlayın. Objektifteki lazer ışığının gücünü ölçün ve not edin. Şimdi, lazer ışınının objektifteki açısını turf konumuna getirmek için mikroskobun arkasındaki aynayı kaydırın.

Lazer ışığına asla doğrudan bakmayın. Sağ alt köşede, floresan proteinlerle dekore edilmiş bir çift tabakanın emisyonu aracılığıyla görselleştirilen eksitasyon lazerinin yoğunluk profilini görüyorsunuz. Burada, farklı yoğunluktaki bölgeleri vurgulamak için yanlış renk temsilimi kullanıyoruz.

Yeterince büyük bir ilgi alanı (region of interest) içindeki arka planın ortalama yoğunluğunu ölçün. Bu değer, EM kazancı ve okuma hızı gibi spesifik kamera ayarlarına bağlıdır ve ölçülen tüm yoğunluklardan çıkarılması gerekecektir. Tüm aydınlatılmış alan içindeki ortalama yoğunluğu belirleyin.

Çevre kısımdaki yoğunluk değerleri, kamera arka plan değerlerine benzer olacak kadar büyük bir çap seçin ve merkezi alanın ortalama yoğunluğunu ölçün. Bu alan, daha sonra mikroskopi deneylerinin gerçekleştirileceği ilgi bölgesini tanımlar. Şimdi, hem elenmiş alanın hem de merkezi alanın yoğunluk değerlerinden ortalama arka plan yoğunluk değerini çıkarın.

Ardından, entegre yoğunluk değerlerine ulaşmak için arka plan düzeltmeli yoğunlukları, bölge boyutunun ilgili piksel sayısıyla çarpın. Aydınlatılmış alanın entegre yoğunluğunu bir olarak belirleyin ve merkezi alan için oranı hesaplayın. Güç, güç ölçer ile ölçülür.

Bizim durumumuzda beş milivat, aydınlatılan tüm alanın entegre yoğunluğuyla doğrudan orantılıdır. Merkezi alan içindeki gücü belirlemek için bu değeri, merkezi alanın güç oranıyla çarpın. Örneğimizde bu değer 1,15 milivattır; piksel sayısını kare mikrona dönüştürme faktörü, kamera çipinin gerçek piksel boyutuna ve emisyon yolunun büyütme oranına bağlıdır.

Bir mikrometre lam ile kolayca belirlenebilir. Örneğimizde, merkezi alan 170,8 kare mikrona tekabül etmektedir. Güç yoğunluğu, ölçülen gücün alana bölünmesini ifade eder ve böylece 1,15 milivatın 170,8 kare mikrona bölünmesine veya kare mikron başına 0,007 milivata eşittir.

Bu, santimetrekare başına 0,7 Kilowatt'tır. Çift katmanın akışkanlığını belirlemek için fotobleykleme sonrası floresans geri kazanımı deneyi gerçekleştiriyoruz. Sol alttaki videoda gösterildiği gibi, floresan çift katmanı düşük güç yoğunluğunda görüntülüyoruz.

Sağ alttaki videoda, mikroskop üzerindeki ilgili laboratuvar teknik odasını görebilirsiniz. Daha sonra, kısa yüksek güç yoğunluklu darbelerle dairesel bir alanı ağartır ve düşük güç yoğunluğunda geri kazanımı izleriz. Yine, montaj, sıfır zamanın ağartma darbeleri olduğu farklı zaman noktaları için deneyin genel bir görünümünü sunar.

İşaretli daire içindeki ortalama arka plan düzeltmeli floresans yoğunluğunu niceliklendiririz ve tüm ölçülen yoğunlukları deneyin başındaki yoğunluğa göre normalize ederiz. Ağartma darbeleri öncesindeki normalize edilmiş yoğunluk değerlerini zamana karşı grafiğe dökeriz. Doygunluk değeri, bizim durumumuzda %90'ın üzerindeki mobil fraksiyonu temsil eder. İlk olarak, düşük eksitasyon güç yoğunluğunda çift tabakanın bir görüntüsünü alın.

Örneğin, logaritmik zayıflatma değeri iki olan bir optik yoğunluk filtresi yerleştirilerek güç 100 kat oranında azaltılır. Pozlama süresi tüm prosedür boyunca sabit olmalı ve bizim durumumuzda zayıflatılmamış güç yoğunluğunda tek bir sıvı kuvvetini görüntülemek için yeterli olmalıdır: 0,7 kilowatt per square centimeter değerinde 10 milisaniye. Farklı yoğunluktaki alanları vurgulamak için yalancı renk temsilini kullanın.

Daha sonra tek molekül ölçümlerinin gerçekleştirileceği bir ilgi bölgesi ve aynı boyutta bir bölge seçin. Arka plan çıkarma işlemi için, arka planı çıkarılmış entegre yoğunluğu hesaplayın. Şimdi uyarım ışını yolundaki optik yoğunluk filtresini kaldırın, alanı ağartın ve bir görüntü alın.

Ağartılmış bölgede difüzyon halindeki tekil floresan güçleri göreceksiniz. Tekil floresan güçler, tipik olarak iki ila üç piksellik bir çapla kırınım sınırlıdır; her bir tek molekül sinyali etrafında yedi çarpı yedi piksellik bir bölge ve hemen yanında ikinci bir bölge alın. Arkaplan çıkarımı için, yalnızca tekil floresan gücün sinyalini nicelendirmek önemlidir.

Bu nedenle, proteinleri BI tabakasında görüntülemek için protein oranının birden küçük olması veya SAT için spesifik olarak işaretlenmiş proteinlerin kullanılması en iyisidir. Örneğimizde gösterildiği gibi protein oranı bir olduğunda, her iki bölge için entegre yoğunlukları ölçün ve sinyalden arka planı çıkarın; pozlama sırasında muhtemelen ağarma (bleaching) meydana geldiği için örneğimizde gösterilen son gözlemlenen olayı dikkate almayın. Buradaki düzeltilmiş sinyalleri, dokuz kare boyunca gözlemlediğimiz dört floresan birimi için hesaplarız.

Bununla birlikte, bu işlem en az birkaç yüz tek molekül olayı için gerçekleştirilmelidir. Zayıflatılmış uyarım güç yoğunluğunda gözlemlenen orijinal çift katman görüntümüze geri dönelim. Moleküler yoğunluk, ilgi bölgesinin düşük uyarım güç yoğunluğu için entegre yoğunluğunun yüz ile çarpılarak düzeltilmesi ve ardından ortalama tek molekül yoğunluğuna ve alana bölünmesiyle belirlenir.

Kare mikron başına 421,4 Flor kuvveti yoğunluğu ile karşı karşıyayız. Örneğimizde, bir olan diyet-protein oranında bu, kare mikron başına aynı sayıda moleküle karşılık gelir. Bu videoyu izledikten sonra, tek moleküllü floresan mikroskopi kullanarak proteinle fonksiyonelleştirilmiş bir lipid çift tabakası hazırlayabilmeli ve karakterize edebilmelisiniz.

Ayrıca, standart bir mikroskobu bu amaçla modifiye etmek ve geliştirmek için temel prensiplere aşina olmalısınız. Daha sonra bu metodolojiyi, çift katmana bağlı antijenin hücreye bağlı T-hücresi reseptörlerine bağlanma kinetiğini belirlemek için kullanacağız, ancak buna dayalı birçok başka uygulama da kesinlikle mümkündür.