Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

Bu videoda, biyofonksiyonelleştirilmiş düzlemsel destekli lipid biların nasıl hazırlanacağını ve karakterize edileceğini göstereceğiz. Ayrıca, tek molekül algılama yeteneklerine sahip bir toplam iç yansıma mikroskobunun mimarisini ayrıntılı olarak açıklayacağız. Lipid kilinin uyarma gücü yoğunluğunu, akışkanlığını ve protein yoğunluğunu ölçeceğiz.

Kısa bir girişle başlayalım: Düzlemsel cam destekli lipid kil. Küçük uni lanar veziküller temiz bir cam yüzeyle karşılaştıklarında, bitişik bir lipid çift tabakası oluşturmak için patlar ve yayılırlar. Bir su yastığında genellikle avuç içi malzemesini seçeriz.

Ole fosfokolin veya POPC, oda sıcaklığında ve 37 santigrat derecede sıvı lipid çift katmanlarına yol açtığı için baskın lipide sahiptir. İşlevselleştirme için, poli histamin etiket proteinlerini bağlayan nikel şelatlama kafa grubuna sahip sentetik bir lipit olan nikel antioks ekliyoruz. Örneğin, burada gösterildiği gibi T hücresinin tanınması için ko-uyarıcı molekül B yedi bir, adezyon molekülü, ICAM molekülü ve floresan etiketli peptit yüklü MHC molekülü, ancak bu çift katmanlı sistem prensip olarak çeşitli biyolojik sistemlerde tamamen farklı süreçleri ele almak için kullanılabilir.

Düzlemsel sistemin doğası gereği, floresan olayları, hücresel arka planı önemli ölçüde azaltan ve eller tek moleküllü floresan mikroskobu için çok uygun olan toplam iç yansıma modunda izlenebilir Lipid hazırlama için, lipitlere, POPC'ye ve nikel antioks kloroforma ihtiyaç duyulur ve temiz bir yuvarlak tabanlı şişe, lipitleri istenen oranda çözer ve kloroform yapar ve burada gösterildiği gibi vakum altında kurutur. Gece boyunca yüksek vakum işleminden sonra, lipitler şişenin içinde bir film oluşturur. Lipid rehidrasyonu için, kurutulmuş lipid Karışımına 10 mililitre Degas PBS'de Degas PBS kullanın.

Karıştırmayın. Şimdi lipid oksidasyonunu önlemek için, şişeyi nitrojen veya argon gibi inert bir gazla doldurun, şişeyi döndürün. Lipitler sütlü bir süspansiyon oluşturur.

Bir sonraki adımda gaz değişimini önlemek için spektrofotometre için boş olarak küçük bir numune alın. Lipid süspansiyonunu içeren şişenin uygun şekilde kapatılması çok önemlidir. Isıya dayanıklı bir yapışkan bant kullanın, örneğin, kapalı bir ultrasonik banyo kullanarak fiziksel oluşum sırasında hava korumasının olduğu otoklav bandı.

Şişeyi monte ettikten sonra, sonikasyon prosedürünü maksimum 170 watt güçte başlatın. 60 dakika boyunca Sonic Cade. Fiziksel oluşum nedeniyle, bulanıklık önemli ölçüde azaldı.

Bu, 550 nanometrede spektro fotometri ile doğrulanabilir. Sonikasyondan önce alınan alikotu boş olarak kullanın. Lipid Miktarının göstergesi olan 230 nanometredeki optik yoğunluk sabit kalmalıdır.

Burada küçük ultra santrifüj tüplerini bir mililitre visl süspansiyon ile dolduruyoruz ve bunları bir masa üstü ultrasantrifüjün sabit açılı bir rotoruna yerleştiriyoruz. İki katmanlı hazırlık için sadece küçük uni laina veziküllerinin kullanılması çok önemlidir. Sonikasyon sırasında da oluşan daha büyük ve daha yoğun çoklu laina vezikülleri, iki katmanlı akışkanlığa müdahale eder ve bu nedenle soluklanmalı ve santrifüjleme ile uzaklaştırılmalıdır.

İlk olarak, oda sıcaklığında 150.000 G'de bir saat boyunca döneriz. Elde edilen snat daha sonra dört santigrat derecede 288.000 G'de sekiz saat daha santrifüjlenir. Cam ışıklar, bitişik ve akışkan bir çift tabaka oluşturmak için lipid veziküller üzerlerine yayılmadan önce çok temiz olmalıdır.

Bunun için örtü fişlerini bir Teflon höyüğün içine yerleştiriyoruz, Daha sonra bir cam kap egzersizine koyuyoruz. Göz koruması, koruyucu eldivenler ve laboratuvar önlüğü ve kimyasal bir dolapta çalışırken çok dikkatli olun. Çok reaktif ve oksidatif perio mono sülfürik asit elde etmek için bir kısım% 30 hidrojen peroksit ve daha sonra üç kısım konsantre sülfürik asit ekliyoruz.

Bu karışım cildiniz, gözleriniz ve giysileriniz de dahil olmak üzere organik maddelerle şiddetli reaksiyona girer. Hemen ısınır. Slaytları 30 dakika inkübe edin.

Kapak fişini forvet ile tutun Temiz kapak fişinin her iki tarafındaki asidi W damıtılmış veya yüksek kaliteli birleşmiş su kullanarak iyice yıkayın. Daha sonra slaytı bir Teflon standa yerleştirin ve aynı anda birkaç ayrı lipit çift tabakası üretebilmek için 10 dakikadan fazla kurumaya bırakın. Kurutulmuş kapak fişlerini hızlı sertleşme ile yapıştırıyoruz.

Sekiz kuyulu veya 16 kuyulu laboratuvar teknoloji odasına iki bileşenli epoksi yapıştırıcı. İlk olarak, orijinal lept cam sürgüyü çerçevesinden dikkatlice çıkarın. İki tutkal bileşenini bire bir oranında karıştırın.

Hazne çerçevesinin alt oluklarına eşit şekilde yayın. Temiz kapak sürgüsünü hazne çerçevesinin tutkalla kaplı altına yerleştirin. Yapıştırıcının cam sürgü ile plastik çerçeve arasına eşit şekilde yayıldığından emin olun.

Tutkalın 30 dakika sertleşmesine izin verin. PBS'deki lipid fiziksel süspansiyonunu bir ila 10 oranında seyreltin ve bu seyreltmenin 120 mikrolitresinde 0.2 mikronluk bir filtreden sekiz kuyulu bir odanın her bir oyuğuna veya 16 oyuklu bir odanın her bir oyuğuna 60 mikrolitre süzün. Tüm cam yüzeyin kapalı olduğundan emin olun ve 20 dakika bekleyin.

Çift tabaka şimdi oluştu: Kalıntılardan kurtulmak için, her birini 30 mililitre PBS ile durulayın. Ne pahasına olursa olsun cam yüzeyin havaya maruz kalmasını önleyin. Bu, her kuyunun aynı hacimde tampon içerdiğinden emin olmak için çift tabakayı anında yok eder Bir sonraki protein dekorasyon adımı için, her bir kuyuyu tamamen doldurun ve sıvı kubbeyi çıkarın.

330 mikrolitre çıkarın. Bu, her birinin içinde yaklaşık 350 mikrolitre bırakacaktır. İki tabakayı proteinlerle süslemek için, tercih edilen poli histamin teknoloji proteinlerini içeren bir ana karışım hazırlayın ve her bir oyuğa 50 mikrolitre ekleyin.

Proteinler, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için koyu lipidin nikel anti kafa grubuna bağlanır, iyice ancak dikkatli bir şekilde karıştırılır ve bağlanmamış proteinleri çıkarmak için her zaman 60 dakika inkübe edilir. 30 mililitre PBS ile tekrar yıkayın. Şimdi mikroskopi donanımına odaklanalım.

İlk olarak, objektif tabanlı çim mikroskobu için toplam iç yansıma mikroskobunun gerekliliklerini göstereceğiz. Yüksek sayısal açıklığa sahip bir yağa daldırma hedefine ihtiyaç vardır. Gelen lazer uyarma ışını, dikroik ayna tarafından yansıtılır ve iki veya üç mercekten oluşan bir set aracılığıyla yalnızca objektifin arka odak düzlemine odaklanır.

Daha sonra lazer ışığı, optik eksen boyunca kaplanmış bir ışın olarak objektifi yönlendirir. Bu şekilde, floresan numune tüm derinliği ile aydınlatılır. Işını optik eksene dik olarak yer değiştirdiğinizde, ışın harmanlanmış halde kalır, ancak objektifi eğik bir şekilde terk eder.

Yer değiştirmeye devam ederseniz, bir noktada ışının cam örtü kayması ile numune arasındaki arayüzde tamamen yansıtıldığı kritik açıya ulaşacaksınız. Ortaya çıkan buharlaşan dalganın yoğunluğu katlanarak azalır ve sadece arayüzün yakınında birkaç yüz nanometreye kadar olan dördüncü kat uyarılır. Şimdi, lazer ışınının objektifin arka odak düzlemine manuel olarak nasıl odaklanacağını gösteriyoruz.

İlk iki mercekle birlikte üç veya iki mercek kullanılarak lazer ışınının çapı arttırılır. Odak uzunluklarının oranı, numune düzlemindeki aydınlatma noktasının boyutunu belirler. Işının bir arada kalmasını sağlamak için, bu lensler arasındaki mesafeyi her iki odak uzaklığının toplamına eşit olacak şekilde ayarlayın.

Üçüncü mercek, genişleyen ışını objektifin arka odak düzlemine odaklamak için kullanılır. Bu merceğin odak uzaklığının mikroskop gövdesinin ve ilgili bir periskopun boyutlarına uyması gerektiğinden, bizim durumumuzda çok daha uzun olmalı, 75 santimetre değişiyor. İkinci ve üç lens arasındaki mesafenin ışın özellikleri üzerinde hiçbir etkisi yoktur.

Bu nedenle, aradaki sonsuzluk alanı, ışını bozulma olmadan tanımlanmış bir şekilde değiştirmek için kullanılabilir. Örneğin, bir açıklık ekleyebilir ve numune düzlemine tam olarak yansıtabilirsiniz. Özünde, üç yerine iki lens kullanarak aynı şeyi başarabilirsiniz.

İki lens sistemi daha az tanımlanmıştır ancak daha az lens sapmasına neden olur. Diyafram açıklığı gibi basit özellikler Zamansal Modülasyon için hala çok iyi uygulanabilir. Bir gaz, demir veya katı hal lazeri, örneğin mekanik bir deklanşör veya bir al optik modülatör gibi milisaniye aralıklı bir deklanşörün önüne yerleştirilmelidir.

İyi bir alternatif, elektronik olarak modüle edilebilen ve harici kapatmaya ihtiyaç duymayan bir diyot lazerdir. Işını herhangi bir yere ve herhangi bir yöne hedeflemek için iki ayna yeterlidir. Daha önce tartışıldığı gibi, iki mercek ışını genişletmek ve mikroskobun arka odak düzlemine odaklamak için kullanılır. Nesnel.

Periskopun alt aynasını optik bir ray üzerinde kaydırarak çim konfigürasyonu için ışının yerini değiştirebiliriz. Görüntü algılama için son derece hassas bir kamera kullanıyoruz. Örneğin, bir elektron çarpım yükü birleştirilmiş cihaz veya farklı bir dalga boyuna sahip em CCDA ikinci lazer ışını, ışın yoluna hizalanabilir.

Ayna kullanımı ve dikroik bir kaplama ile. Eşzamanlı iki renk algılama için, emisyon yoluna ticari olarak temin edilebilen bir ışın bölme cihazı yerleştiriyoruz. Deneyler için, iki bağımsız uyarma ışını yolunun yerinde olması çok yararlıdır.

Örneğin, biri çim görüntüleme için ve ikincisi hedefli foto ağartma veya aktivasyon için. Bu, 2 50 50 ışın ayırıcıdan oluşan bir set uygulanarak kolayca elde edilebilir. Çizimimizde gösterildiği gibi, iki farklı mercek ve ayna ayar sistemi, iki ayrı ışın profili ve ışın açısına yol açacaktır.

Örneğin, çimde görüntüleme için genişletilmiş bir tane ve çim olmayan çimde ağartma veya aktivasyon için daha odaklanmış bir tane. Ağartma veya aktivasyon noktasını hassas bir şekilde şekillendirmek için çim olmayan kirişe bir açıklık yerleştirilebilir. Her ışın yolu için bir tane olmak üzere iki ek deklanşör Lazer ışını üzerinde bağımsız kontrol anahtarını etkinleştirin ve objektifi düz, eğik olmayan bir yolda bırakın.

Güç ölçeri açın ve ilgili Lazer dalga boyuna ayarlayın. Lazer ışığının objektifteki gücünü ölçün ve not edin. Şimdi, objektifteki lazer ışınını çim konumuna eğmek için aynayı mikroskobun arkasına yerleştirin.

Asla doğrudan lazer ışığına bakmayın. Sağ alt köşede, floresan proteinlerle süslenmiş bir çift katmanın emisyonu ile görselleştirilen uyarma lazerinin yoğunluk profilini görüyorsunuz. Burada, farklı yoğunluktaki bölgeleri vurgulamak için sahte bir renk temsili kullanıyoruz.

Yeterince geniş bir ilgi alanı içindeki arka planın ortalama yoğunluğunu ölçün. Bu değer, EM kazancı ve okuma hızı gibi belirli kamera ayarlarına bağlıdır ve ölçülen tüm yoğunluklardan çıkarılması gerekir. Aydınlatılan alanın tamamındaki ortalama yoğunluğu belirleyin.

Çevredeki yoğunluk değerleri kamera arka planınınkine benzer olacak şekilde yeterince büyük bir çap seçin, böylece merkezi alanın ortalama yoğunluğunu ölçün. Bu alan, mikroskopi deneylerinin daha sonra gerçekleştirileceği ilgi alanını tanımlar. Şimdi, ortalama arka plan yoğunluğu değerini hem ortadan kaldırılan hem de merkezi alanın yoğunluklarından çıkarın.

Ardından, entegre yoğunluklara ulaşmak için arka plan düzeltilmiş yoğunlukları bölge boyutunun karşılık gelen piksel numarasıyla çarpın. Aydınlatılan alanın entegre yoğunluğunu bir olarak ayarlayın ve merkezi alan için kesri hesaplayın. Güç ölçer ile ölçülen güç.

Bizim durumumuzda, beş miliwatt, tüm aydınlatılmış alanın entegre yoğunluğu ile doğru orantılıdır. Merkez alan içindeki gücü belirlemek için bu değeri merkezi alanın güç fraksiyonu ile çarpın. Örneğimizde, 1.15 miliwatt, piksel sayısını kare mikrona dönüştürme faktörü, kamera çipinin gerçek piksel boyutuna ve emisyon yolunun büyütmesine bağlıdır.

Mikrometre lamı ile kolayca belirlenebilir. Örneğimizde, merkezi alan 170.8 mikron kareye karşılık gelir. Güç yoğunluğu, ölçülen gücün alana bölünmesini ifade eder ve bu nedenle 1.15 miliwatt bölü 170.8 mikron kare veya mikron kare başına 0.007 miliwatt'a eşittir.

Yani santimetre kare başına 0.7 Kilowatt. Çift tabakanın akışkanlığını belirlemek için, sargı deneyinin fotoağartılmasından sonra bir floresan geri kazanımı gerçekleştiriyoruz. Sol alttaki filmde gösterildiği gibi, floresan çift tabakayı düşük güç yoğunluğunda görüntülüyoruz.

Sağ alttaki filmde, mikroskopta ilgili laboratuvar teknoloji odasını görebilirsiniz. Daha sonra kısa yüksek güç yoğunluğu darbeleri ile dairesel bir alanı ağartıyoruz ve düşük güç yoğunluğunda geri kazanımı izliyoruz. Yine montaj, sıfır zaman ağartıcı darbeleri olmak üzere farklı zaman noktaları için deneye genel bir bakış sağlar.

İşaret çemberi içindeki ortalama arka plan düzeltilmiş floresan yoğunluğunu nicelleştiriyoruz ve ölçülen tüm yoğunlukları deneyin başındaki yoğunluğa göre normalleştiriyoruz. Ağartma darbelerinden önce, normalleştirilmiş yoğunluk değerlerini zamana karşı çizeriz. Doygunluk değeri, bizim durumumuzda %90'ın üzerindeki mobil Fraksiyonu temsil ederİlk olarak, düşük uyarma gücü yoğunluğunda çift katmanın bir görüntüsünü alın.

Örneğin, logaritmik zayıflama değeri iki olan bir optik yoğunluk filtresi yerleştirerek, bu, gücü 100 kat azaltır. Maruz kalma süresi tüm prosedür boyunca sabit olmalı ve bizim durumumuzda zayıflamamış güç yoğunluğunda, santimetre kare başına 0,7 kilovatta 10 milisaniyede tek bir sıvı kuvvetini görüntülemek için yeterli olmalıdır. Farklı yoğunluktaki alanları vurgulamak için sahte renk gösterimi kullanın.

Tek molekül ölçümlerinin daha sonra gerçekleştirileceği bir ilgi alanı ve aynı boyutta bir bölge seçin. Arka plan çıkarma işlemi için, arka plan çıkarılan entegre yoğunluğunu hesaplayın. Şimdi optik yoğunluk filtresini uyarma ışını yolundan çıkarın, alanı ağartın ve bir görüntü alın.

Ağartılmış alanda yayılan bireysel grip kuvvetini göreceksiniz. Tek grip kuvveti, iki ila üç piksellik tipik bir çap ile sınırlı kırınımdır, her bir tek molekül sinyalinin etrafında yedi x yedi piksellik bir bölge ve yakın olan ikinci bölge alır. Arka plan çıkarma işlemi için, yalnızca tek Fluor kuvvetinin sinyalini ölçmek önemlidir.

Bu nedenle, BI katmanındaki proteinleri birden az protein oranına sahip veya SAT için özel olarak etiketlenmiş proteinler olarak görüntülemek en iyisidir. Örneğimizde gösterildiği gibi bir diyet-protein oranı daha da fazla, her iki bölge için entegre yoğunlukları ölçün ve örneğimizde gösterilen son gözlemlenen olayı almamak için arka planı sinyalden çıkarın, çünkü ağartma muhtemelen maruziyet ortalaması sırasında meydana gelmiştir. Buradaki düzeltilmiş sinyaller, bunu dokuz karede gözlemlediğimiz dört gripten biri için yapıyoruz.

Bununla birlikte, bu prosedür en az birkaç yüz tek molekül olayı için yapılmalıdır. Zayıflatılmış uyarma gücü yoğunluğunda gözlemlenen orijinal iki katmanlı görüntümüze geri dönelim. Moleküler yoğunluk, düşük uyarma gücü yoğunluğu için ilgilenilen bölgenin entegre yoğunluğunun yüz ile çarpılarak düzeltilmesi ve bunun ortalama tek molekül yoğunluğuna ve alana bölünmesiyle belirlenir.

Mikron kare başına 421.4 Fluor kuvveti yoğunluğu ile uğraşıyoruz. Örneğimizde, bir diyet-protein oranı ile bu, Mikron kare başına aynı sayıda moleküle eşittir. Bu videoyu izledikten sonra, tek moleküllü floresan mikroskobu kullanarak protein işlevselleştirilmiş bir lipid çift tabakası hazırlayabilmeli ve karakterize edebilmelisiniz.

Ayrıca, bu amaç için standart bir mikroskobu değiştirmek ve yükseltmek için temel ilkeler hakkında bilgi sahibi olmalısınız. Daha sonra bu metodolojiyi, iki katmanlı bağlı antijenin hücreye bağlı T hücresi reseptörlerine bağlanma kinetiğini belirlemek için kullanacağız, ancak buna dayanan diğer birçok uygulama kesinlikle Uygulanabilir.