Toplam Lignin, lignin Monomer ve enzimatik Şeker Yayın: Lignocellulosic Biyokütle rekalsitrantların Varyasyonları yüksek verimlilik Taraması

Bu prosedürün genel amacı, ilgili biyokütle varyantları arasındaki termokimyasal ön işlem ve enzim hidrolizi dirençlerini ölçmektir. Bu, öncelikle biyokütle örneklerinin boyut küçültme ve nişasta ile çözünür şekerlerin ekstraksiyonu yoluyla test için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, biyokütlenin termokimyasal olarak uyumlu yüksek kapasiteli reaktör plakalarına yüksek hassasiyetle dağıtılmasıdır.

Numuneler bir buhar reaktöründe ön işlemden geçirilir. Ardından, selüloz ve hemiselülozu hidrolize etmek için numuneler standart ticari bir selülaz ile üç gün boyunca sindirilir. Son adım, GO pod ve XDH analizleri kullanılarak enzim hidrolizi sırasında açığa çıkan glukoz ve ksilozun belirlenmesidir.

Nihayetinde, yüksek verimli glukoz ve ksiloz miktar tayini, örnekler arasındaki göreceli şeker salınımını, gram başlangıç biyokütlesi başına gram şeker bazında belirlemek için kullanılır. Bu tekniğin; laboratuvar ölçekli ön işlem ve enzimatik hidroliz gibi diğer laboratuvar ölçekli yöntemlere göre temel avantajı, yüzlerce hatta binlerce örneğe aynı anda uygulanabilmesidir. Bu yöntem, hangi kültivarların veya varyantların şekerlere ve ardından gelen ürünlere dönüştürülmeye daha yatkın olduğu gibi, biyokütle dönüşüm alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Dolayısıyla, bu tekniğin etkileri hücre duvarı yapısının ve işlevinin anlaşılmasına yönelik genişletilebilir; çünkü hücre duvarı biyosentez yolunda oluşturduğumuz mutasyonlar, yapısal kimyasal değişiklikler açısından taranabilir. Bu yöntem, bitki hücre duvarı dirençliliği hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, enzim aktivitesi ve sinerji çalışmaları gibi biyokütle dönüşümünün diğer bileşenlerine de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, miligram ölçeğinde özdeş ve eş zamanlı olarak işlenmesi gereken geniş biyokütle varyantı örnek setlerini içerdiği için zorluk yaşayacaklardır. Bu nedenle, özel robotik sistemler ve ekipmanlar gereklidir. İşleme başlamak için, barkodlu antistatik bir torbadan numaralandırılmış bir çay poşetine yaklaşık 250 mg önceden öğütülmüş biyokütle aktarın; nişastanın giderilmesi ve ekstraksiyon sırasında kayıpları önlemek için uçlarını biyokütlenin üzerine katladığınızdan emin olarak çay poşetini dikkatlice rulo yapın. Ardından, her bir çay poşetini kalay kaplı bakır tel kullanarak kapatın ve her barkodlu örnek için çay poşeti numarasını kaydedin.

Plastik bir kaba önceden hazırlanmış 500 mililitre nişak giderme enzimi çözeltisi ekleyin. Ardından, toplu işleme protokolü için tampon enzim çözeltisine 120 adet çay poşeti ekleyin. Çalkalayıcıda inkübasyonun ardından, nişakçılığı giderilmiş biyokütlenin kapsamlı şekilde durulanmasını takiben, biyokütleyi birkaç litre deiyonize suda 30 dakika boyunca durulayın ve bekletin.

Tampon tuzlarını uzaklaştırmak için çay poşetlerini ekstraksiyon amacıyla bir çorap tipi kolona yerleştirin. %95 ethanol kullanarak çorap tipi reflüks düzeneğini kurun ve numuneleri 24 saat boyunca ekstrakte edin. Ekstraksiyon tamamlandığında, çay poşetlerini açın ve kurutulmuş biyokütleyi orijinal barkodlu tüplere geri aktarın.

Antistatik torbalardan kurutulmuş biyokütlenin en az 50 miligramını barkodlu bir hazneye aktarın. Doğru numune takibi sağlamak için antistatik torbaların ve alıcı haznenin barkodlarını tarayın. Hazneler hassas bir tartım robotuna yüklendikten sonra, kurutulmuş numunelerin beş miligramını asit dirençli paslanmaz çelik kaplara robotik olarak tartın.

96 kuyucuklu plaklarda, yerel varyasyonları en aza indirmek için her örneğin üç tekrarını plaka geneline dağıtarak tartın. Ardından, her kuyucuğa 250 µL deiyonize su ekleyin ve plakaları silikon yapışkanlı POLYTETRAFLUOROETHYLENE veya PTFE bant ile mühürleyin. Seyeklikle bir sekizlik inçlik bir havya ucu kullanarak, her buhar portundaki PTFE bandı delin.

Her bir plaka için, plakaları aralarına 0,031 inç kalınlığında cam takviyeli PTFE contalar ve yığının üst ve alt kısmına boş plakalar yerleştirerek sıkıca kenetleyin. Numuneleri, 180 °C'ye ayarlanmış bir buhar reaktörü kullanarak 17,5 dakika boyunca ön işleme tabi tutun. İşlem tamamlandığında, reaktör plakalarını deiyonize su ile doldurarak 50 °C'ye soğutun.

Plakalar soğuduğunda, bunları salınımlı kovalı bir santrifüjde merkezden geçirin. Rotoru 1700 GS'de 20 dakika boyunca çalıştırın. Ardından tavan filmini çıkarın.

Yeni PTFE bant ile yeniden mühürledikten sonra, her bir kuyucuğa önceden hazırlanmış %8'lik enzim stok çözeltisinden 40 microliters ekleyin ve mühürlenmiş plakayı manyetik bir plaka klembine yerleştirin. Örnekleri en az 15 kez ters çevirerek nazikçe karıştırın ve 50 degrees Celsius'de 70 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, reaktör plakaları karıştırılır ve santrifüj edilir.

Ardından, glikoz ve ksiloza ait nicel analizleri gerçekleştirmek için sıvı taşıma robotu kullanılır; ksiloza yönelik olarak enzimle bağlantılı kolorimetrik assayler, ksiloz dehidrojenaz (XDH) ve glikoza yönelik olarak glikoz oksidaz, peroksidaz (go pod) kullanılır. Platform, GO POD ve XDH reaktif rezervuarlarının yanı sıra dilüsyon için su ve her reaktif için 96 kanallı 200 µL uç raflarıyla düzenlenir. Bu uçlar birden fazla reaktör plakası için yeniden kullanılır.

Platform ayrıca su giderme ve şeker standart hazırlama için tek kullanımlık, 200 mikrolitrelik uçların yanı sıra önceden hazırlanmış şeker standartlarını da içerir. Robot, depolama karuselindeki HPLC şişelerinden üç adet şeffaf mikro titer plağı getirir; bunlardan biri hidroliz karışımının seyreltilmesini yapmak için, diğer ikisi ise sırasıyla XDH ve GoPod analizleri içindir. Tutucu, dört plağın tamamını platform üzerindeki konumlarına taşır.

Reaktörden seyreltme plakasına ve seyreltmeden XDH ve go pod plakalarına transfer işlemlerinde kullanılmak üzere, tek kullanımlık 96 kanallı 100 microliter uçlar karuselden güverteye getirilir. Seyreltme plakasına bulaşmayı önlemek için, değişken aralıklı sekiz kanallı pipet kullanılarak, reaktör plakasının her köşesindeki üç kuyucuğa ön işlemden önce eklenen su uzaklaştırılır. Bu 12 kuyucuk, 96 kanallı pipetleme başlığı kullanılarak şeker standartları için kullanılır.

Her köşeden üç uç çıkarıldıktan sonra, dilüsyon plakasının kuyucuklarına 180 µL su eklenir. Uçlar değiştirildikten sonra; XD, H ve go pod reaktifleri, kendi rezervuarlarından ilgili analiz plakalarına aktarılır. Bu işlem için 96 kanallı pipetleme başlığı kullanılır.

Bu işlem gerçekleşirken, şeker standartları dilüsyon plakasının her köşesindeki üç kuyucuğa eklenir. Daha küçük uçlara geçildikten sonra, sekiz kanallı pipetleme başlığı kullanılarak 96 kanallı pipetleme başlığı ile 20 µL hidroliz süpernatanı dilüsyon plakasına aktarılır ve plaka üç kez karıştırılır. Uçların biyokütle partikülleri nedeniyle kirlenmesini sınırlamak için örnek, sıvının üst kısmına yakın bir yerden aspire edilmelidir.

Karıştırma işleminden sonra, 96 kanallı pipetleme başlığı kullanılarak sırasıyla 20 µL, XDH ve go pod plakalarına aktarılır. Her biri triyer ile karıştırıldıktan sonra, numune uçları reaktör ve dilüsyon plakaları karuseldeki atık rafına geri yerleştirilir; XDH ve go pod plakaları ise ayrı bir karusel rafına alınır ve ultraviyole-görünür 96 kuyucuklu plaka okuyucu spektrofotometre ile okunmadan önce bir saat bekletilir.

Ölçülen dalga boyunu 510 nanometreye ayarlayın ve bir reaktif körüne karşı absorbansı kaydedin. Bunun ardından, plaka okuyucudaki ölçülen dalga boyunu 340 nanometreye ayarlayın ve küçük bir spatula kullanarak absorbansı kaydedin. Hazırlanan biyokütleden yaklaşık dört miligramı, kütle spektrometresinin otomatik örnekleyici için tasarlanmış 80 microliter paslanmaz çelik bir kaba aktarın.

Standart bir delgeç kullanarak, bağlayıcı içermeyen tip ad cam fiber levhalardan manuel olarak cam filtre diskleri hazırlayın; numuneleri cımbız yardımıyla otomatik örnekleyici raflarına yerleştirin; spektrometre zamanla meydana gelen kayma nedeniyle oluşabilecek yanlılığı önlemek için numuneleri kaplara rastgele yükleyin. Kalibrasyonu gerçekleştirdikten ve kütle spektrometresine uygun parametreleri girdikten sonra veri toplamaya başlayın ve arka plan spektrumlarının toplanması için yeterli veriyi elde etmek üzere en az 60 saniye bekleyin. Son olarak, 0,9 liters per minute helyum taşıyıcı gaz akış hızı kullanarak otomatik örnekleyici yöntemini başlatın.

Eğilimlere bir örnek, Pasifik Kuzeybatı'dan örneklenen 755 doğal kavak varyantının dirençliliğine ilişkin bir incelemedir. Sonuçlar, şırınga-guil oranı arttıkça, oran yaklaşık ikiye ulaşana veya dirençlilik iyileşmesi durağanlaşana kadar dirençliliğin azaldığını göstermektedir. PT four CL one geninin baskılandığı noktalarda burada uç değerler görülebilmektedir.

Kavakta, taranan yüzlerce kültivardan birçoğunda, azalan şeker salınımıyla kanıtlandığı üzere rekalsitranlarda belirgin bir artış görülmüştür. Çeşitli bölgelerde yetiştirilen ve farklı büyüme koşulları altında hasat edilen farklı buğday samanı varyeteleri, yukarıdaki değişkenlerin kombinasyonlarına dayalı olarak 20 farklı popülasyonla sonuçlanmıştır. Bu örnek setleri kolayca ayırt edilebilmekte olup pozitif ve negatif değişkenlere işaret etmektedir.

İnatçı maddelerin pirolizi için, hücre duvarı bileşimindeki değişimleri değerlendirmek amacıyla moleküler demet kütle spektrometrisi kullanılabilir. Kütle spektral fragmanlar, farklı lignin monomerlerine atanır. Yüksek lignin içeren bir örnek ile yüksek karbonhidrat içeriğine sahip bir örnek karşılaştırıldığında, spektral verilerdeki farklılıklar belirgin hale gelir.

Kütle spektrometrisi verilerinin, temel bileşen analizi ile birlikte kullanımı burada örneklendirilmektedir. Temel bileşen yükleme grafiği, skor sınıflandırma grafiğinde hangi kimyasal özelliklerin açıklandığının belirlenmesine ve örnek kümeleri arasında hangi özelliklerin değiştiğinin aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde haftada binlerce örneğin taranması için kullanılabilir. Bu prosedürü uygularken, mümkün olduğunca tutarlı olmak ve yalnızca birbiriyle ilişkili bir set içindeki örnekleri karşılaştırmak önemlidir.

Bu teknik geliştirildikten sonra, iyonik sıvılar ve alkali ön işlem gibi yöntemleri kullanarak, diğer araştırmacıların yüksek kapasiteli tarama yöntemleri ve bitki hücre duvarı dirençliliğine dair diğer alanlar üzerinde çalışmasının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra; boyut küçültme ve ekstraksiyon, termokimyasal ön işlem ve enzim hidrolizi kullanarak, biyokütlenin büyük örnek setlerinin mikro ölçekte dirençlilik farkları açısından nasıl doğru şekilde hazırlanacağı, işleneceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Lütfen yüksek basınç, buhar ve otomatik ekipmanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve bu prosedürler uygulanırken kişisel koruyucu donanım giymek ve tüm ekipmanlarda güvenlik kilitlerinin bulunması gibi tüm güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.