Akciğer tümör hücre işe alım tahlil
26 Şubat 2019
Bu el yazması tümör hücresi birikimi Akciğerlerde tümör metastazı, bir hayvan modeli ölçmek için bir yöntem açıklanır.
Bu yöntem, tümör biyolojisi alanında metastazın moleküler mekanizmaları ile ilgili anahtar soruların cevaplatını yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, uzak bir organ içinde tümör hücrelerinin işe quantitate olabilir. Floresan protein ifade Lewis akciğer karsinomu kaldırmak için bir enzimatik olmayan hücre dissosiasyon reaktifi kullanarak başlayın, veya LLC, standart protokollere göre kendi kültür konteyner hücreleri.
Ortaya çıkan hücre çözeltisini santrifüjden önce 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve santrifüj peletleri yıkama başına beş mililitre PBS'de iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra hücreleri 40 mikrometrelik gözenek hücresi süzgecinden geçirin ve süspansiyonu mililitre konsantrasyonu başına altı hücreye kadar bir kez 10'a kadar seyreltin. Sonra hücreleri 29 kalibrelik bir iğneyle donatılmış bir mililitrelik şırıngaya yükleyin ve her sekiz ila 10 haftalık C57-Black-6 erkek farenin kuyruk damarına 100 mikrolitre hücre enjekte edin.
Uygun deneysel uç noktada, her farenin ventral yüzeyinden deri kaldırmak için makas kullanın ve göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için kaburga ve diyafram kesti. Sağ ventrikül aracılığıyla PBS 15 mililitre floş ve kalp ve timus kaldırmak için 25-gauge kanatlı infüzyon iğne ve tüp kullanın. Nefes borusunu forceplarla tutarak, yukarı çekin, trakeanın etrafındaki bağ dokularını parçalayarak akciğerleri hasat edin.
Sonra PBS akciğerleri yıkayın, ve floresan mikroskop altında yerinde floresan hücrelerin görselleştirilmesi için bir lob ayırmak. Akciğer dokusunu sindirmek için, önce makasla kaudal loba zar atve akciğer parçalarını 10 mililitrelik şırıngaya yerleştirin. Şırıngayı pistonla kapatın ve beş mililitre sindirim çözeltisini şırınganın içine aspire edin, akciğer dokusu çözelti boyunca yayılana kadar şırınga şaftına girip çıkar.
Akciğer bulamacını 50 mililitrelik bir tüpe dağıtın ve 37 santigrat derece ve 150 rpm'de 15 dakika boyunca karşılıklı bir çalkalayıcıda dokuyu sindirin. Kuluçka sonunda, akciğer hücreleri tamamen dağılına kadar kalan doku triturate, ve ek bir 30 dakika için shaker tüp dönmek. Daha sonra hücreleri 40 mikrometrelik gözenek süzgecinden geçirin ve santrifüj ile hücreleri toplayın.
Akış sitometri ile izole akciğer hücrelerini analiz etmek için, oda sıcaklığında bir dakika için kırmızı kan hücre lisis tampon iki mililitre pelet resuspend, ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Sonra taze PBS beş mililitre pelet iki kez santrifüj yıkama başına% 1 sığır serum albumin ile takviye. İkinci santrifüjden sonra, taze PBS artı BSA bir mililitre pelet resuspend, ve akış sitometri ile tümör hücrelerinin sayısallaştırılması için yeni bir 40 mikrometre gözenek süzgeci ile hücreleri filtre.
Akciğerler enjeksiyondan iki saat sonra birçok GFP-LLC hücresi sunar, hücrelerin büyük çoğunluğu 24 saat içinde akciğerlerden kaybolur. Kırmızı filtre içinde algılanan floresan lekelerin hücre sayısından çıkarılması gerektiğini unutmayın. Akciğerlerdeki GFP-LLC sayısını doğrulamak için loblardan biri gösterildiği gibi akış sitometrik analizi için kullanılabilir.
Bu prosedürü çalışırken, dondurulmuş bir kesit prosedürü tümör hücrelerinin tam yerini gözlemlemek için daha doğru bir yöntem olduğunu hatırlamak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, tümör metastazının bir hayvan modelinde akciğerlerdeki tümör hücresi birikimini nicelleştirmek için kullanılan bir yöntemi açıklamaktadır. Bu teknik, uzak bir organ içindeki tümör hücresi göçünün nicelleştirilmesine olanak tanıyarak metastazın moleküler mekanizmalarına dair içgörüler sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Tümör metastazını anlamak, kanser araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- Tümör hücresi birikiminin nicelleştirilmesi, önemli biyolojik içgörüler sağlayabilir.
- Kanser ilerlemesinin incelenmesinde hayvan modellerinin kullanımı yaygındır.
- Floresan protein eksprese eden hücreler, izlemeyi ve nicelleştirmeyi kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- Akciğerlerdeki tümör hücresi birikimini nicelleştirmek için bir yöntem geliştirmek.
- Metastatik bir modelde tümör hücrelerinin göçünü incelemek.
- Metastazın altında yatan moleküler mekanizmalara dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Enzimatik olmayan bir hücre ayrıştırma reaktifinin kullanımı.
- Hücre peletlerinin santrifüjlenmesi ve PBS ile yıkanması.
- Hücrelerin 40 µm gözenekli bir hücre süzgecinden filtrelenmesi.
- Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun farelerin kuyruk venine enjekte edilmesi.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, tümör hücresi birikiminin etkili bir şekilde miktarının belirlenmesine olanak tanır.
- Tümör hücrelerinin in vivo izlenmesinin uygulanabilirliği gösterilmiştir.
- Tümör hücresi göçü dinamikleri hakkında bilgiler sağlanmıştır.
- Metastatik süreçlerin anlaşılmasına katkıda bulunulmuştur.
Sonuçlar
- Bu yöntem, tümör biyolojisini incelemek için değerli bir araçtır.
- Hayvan modellerinde metastazı araştırma yeteneğini geliştirir.
- Gelecekteki çalışmalar, terapötik hedefleri keşfetmek için bu tekniği temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektördeki Uygulama Alanları
Bu analiz, tümör hücrelerinin uzak organlara göçünün kantitatif değerlendirmesini sağlayarak, metastaz hedefli ilaç keşfinde mekanistik risk azaltma sürecini destekler. Primer tümör invazyon basamaklarını devre dışı bırakarak, preklinik hedef doğrulaması için kritik olan stromal etkileşimlere ve ekstravazasyon olaylarına odaklanır. Yöntem, anti-metastatik bileşiklerin in vivo değerlendirilmesi için tekrarlanabilir ve ölçeklendirilebilir bir okuma sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Uzak organlardaki metastaza stromal katkılara ilişkin terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Enjeksiyon sonrası akciğerlerdeki tümör hücresi birikimini nicelleştirerek fonksiyonel hedef doğrulamasına olanak tanır.
- Öngörücü Değer: Bileşiklerin tümör hücresi göç dinamikleri üzerindeki etkilerini ölçerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Bileşik tarama kampanyaları için akış sitometrisi aracılığıyla standardize, kantitatif çıktılar üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Tutarlı metastaz modellemesi sağlamak için tanımlanmış hücre konsantrasyonları ve enjeksiyon hacimleri kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: Hedef riskini azaltma amacıyla çok kuyucuklu işlemeye ve yüksek içerikli analize uygundur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Organa özgü kolonizasyon mekanizmalarını incelemek için akciğer mikrometastazını modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Keşif bulgularını, anti-metastatik ajanların preklinik doğrulamasına bağlar.
- Riskten Arındırılmış Kararlar: İşaretli tümör hücresi sayılarındaki azalmaya dayalı olarak go/no-go kriterlerini belirler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Hedef hipotez testinden öncü bileşik optimizasyonuna kadar keşif sürekliliği içindeki konumlarda, metastazı modüle eden bileşiklerin kantitatif değerlendirmesine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Metastatik nişlerdeki tümör-stroma etkileşimlerinin mekanistik sorgulamasını destekler.
- Tarama: Metastaz analizlerinde hit doğrulaması için floresan tabanlı kantitatif okumalar sağlar.
- Analitik: Doz-yanıt ve istatistiksel analizler için akış sitometrisi aracılığıyla sayılabilir tümör hücresi verileri üretir.
- Translasyonel Araştırma: İn vivo ortamda işaretli hücre yayılımını takip ederek biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler arası metastaz mekanizması çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nicelikleştirilebilir organa özgü göç yoluyla metastaz yolaklarındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar arası tekrarlanabilir karşılaştırmalar için tümör hücresi iletimini ve doku işlemeyi standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Metastaz hedefli terapötiklerin erken aşamada riskten arındırılmasını sağlayarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Preklinik metastaz baskılama verilerine dayalı, riske göre ayarlanmış geliştirme kararlarını kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Fare kuyruk ven enjeksiyonu ve doku disosiasyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Akış sitometrisi cihazına ve floresan kompanzasyon kontrollerine bağımlıdır.
- Araştırma ekipleri arasında standartlaştırılmış hücre hazırlama protokollerini gerektirir.
- Aşırı akciğer birikiminden kaynaklanan yanıltıcı sinyalleri önlemek için hücre dozajının optimizasyonunu içerir.
- Sadece akciğer birikiminin miktar tayini ile sınırlıdır; primer tümör invazyonunu veya daha sonraki metastatik büyümeyi yakalamaz.
