16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

Bu MALDI-TOF Kütle Spektrometresi protokolünün genel amacı, hızlı ve uygun maliyetli bir prosedürle nadir patojenlerin tiplendirilmesini iyileştirmektir. Bu yöntem, tanısal mikrobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, nadir bakteriyel patojenlerin hızlı bir şekilde düzenlenmesine izin verir. Bugün, Myroides cinsinin odoratimimus ve bakterileri hakkında konuşmak istiyoruz.

Yöntemi göstermek ve sonuçların yorumlanması hakkında konuşmak. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bakteri transferi, metriklerle örtüşme ve sonuçların yorumlanması teknik beceri ve mikrobiyolojik uzmanlık gerektirdiğinden zor bulabilirler. Nadir bakterileri taramak için MALD-TOF MS'yi kullanma fikri ilk olarak, hastanemizde myroides odoratimus'un neden olduğu diyabetik gıda enfeksiyonundan muzdarip bir hastamız olduğunda aklımıza geldi.

Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı gibi bakteri DNA'sının ekstraksiyonu, 16S ribozomal DNA PCR ve Sanger dizilimi ile başlayın. Tek bir bakteri kolonisini 96 kuyulu çelik hedefin kuyusuna aktarmak için tahta bir kürdan kullanın. Çelik hedef üzerindeki havayla kurutulmuş organizmanın üzerine bir mikrolitre %70 formik asit yerleştirin ve yaklaşık iki ila üç dakika kurumaya bırakın.

Lekeyi% 50 asetonitril, 2.5 trifloroasetik asit ve% 47.5 sudan oluşan organik bir çözücü içinde 50 mg / ml CHCA içeren bir mikrolitre matris çözeltisi ile kaplayın. Leke ve üst üste binen matrisi bir başlıkta yaklaşık beş dakika kurumaya bırakın. Numuneleri tanıtmak için, cihazın giriş/çıkış düğmesine basarak kütle spektrometresinin numune yükleme portunu havalandırın.

Yükleme portunu açın ve kurutulmuş bakteri yayması artı matrisi ile MALDI-TOF MS hedef plakasını yerleştirin. Limanı kapatın ve tekrar boşaltın. Vakumu gözlemleyin ve 4,5 milyon milibara ulaştığında ölçüme başlayın.

MMIS analiz yazılımını açın ve dosya menüsüne tıklayın. Yeni Sınıflandırmayı Seç" ve "MALDI Biotyper Gerçek Zamanlı Sınıflandırma Sihirbazı" adlı yeni bir pencere açılmalıdır. "Proje Adı" alanına proje adını yazın ve Yeni'ye tıklayın, Yeni Proje adlı yeni diyalog kutusunun altında proje adını kontrol edin ve Tamam" butonuna tıklayarak ilerleyin.

MALDI Biotyper Gerçek Zamanlı Sınıflandırma Sihirbazı'nda, Analit yerleştirme penceresini gözlemleyin. Hedef konumları seçin, seçilen herhangi bir konuma sağ tıklayın ve Örnek ekle'yi seçin. Otomatik olarak açılan tablo görünümünde, örnek adını, örnek kimliğini ve isteğe bağlı olarak bir açıklama yazın.

Devam etmek için İleri" düğmesine tıklayın. Ardından, MALDI Biotyper yöntemleri penceresinin seçimini gözlemleyin. Taksonomi Ağaçları'ndan MSP'lerden "Bruker Taksonomisi"ni seçin ve devam etmek için İleri"ye tıklayın.

Ardından, proje özeti penceresine bakın. Gerçek sınıflandırma projesi için yukarıda verilen eklenen girişleri kontrol edin. "Finish" butonuna tıklayarak sınıflandırma çalıştırmasını başlatın.

Uygun vakuma ulaşıldığında ölçümler otomatik olarak başlar. Ölçüm başarıyla tamamlanana kadar sınıflandırma çalıştırmasını takip edin. Ölçüm tamamlandıktan sonra, menüyü açın Görünüm"ve Sonuçlar"a tıklayınview MALDI Biotyper Gerçek Zamanlı Sınıflandırma Projesi Bir'deki sonuç tablosunu görüntülemek için.

Bruker-Daltonik MALDI Biotyper sınıflandırma sonuçlarını varsayılan web tarayıcısında bir html dosyası olarak görüntüleyin. Sonuçları yazdırın ve kaydedin. Burada, gerçek zamanlı olarak ölçülen ve sınıflandırılan MALDI-TOF MS tarafından elde edilen spektrumlar gösterilmiştir.

Spektrumlara bir tür adı ve ölçümün kalitesini yansıtan bir puan değeri atanır. 2.300'ün üzerindeki puanlar, yüksek olasılıkla bir tür tanımlamasını temsil eder. 2.000 ile 2.300 arasındaki bir puan, güvenli bir tür tanımlamasını gösterir.

1.700 ve 2.000'in altındaki bir puan, olası bir tür tanımlamasını belirtir. Ve 1.700'ün altındaki bir puan güvenilir değildir. Katı bir ortamda saf bir kültürde yetiştirilen bakteriyel patojenlerin tanımlanması iki ila üç dakika sürer.

Nadir bakteri patojenlerinin MALDI-TOF MS ile yalnızca cihazlar uygun spektrumları güvenilir bir şekilde içerdiğinde bulunabileceğini unutmamak önemlidir. Aksi takdirde, karakterize edilmiş izolatlarının tiplendirilmiş suşlarından MaSDA spektrumları entegre edilerek çıkarılması gerekir. Skor sonuçlarının kesin bir suş tanımlamasına yol açmadığı durumda, biyokimyasal profilleme veya 16S rDNA dizilimi gibi başka yöntemler uygulanabilir.

Bu yöntem bakteri tespiti hakkında bilgi sağlayabilse de, mantarlar veya anaeroblar gibi diğer mikroorganizmalara da uygulanabilir. Ayrıca, bakteri direnci ölçülebilir. Tehlikeli bir madde olan bir matrisle çalışmayı, eldiven, koruyucu gözlük takmayı ve kapüşon altında çalışmayı unutmayın.

Ayrıca, analiz odasında sıçramaları önlemek için matrisi kurutmak ve iyice lekelemek kesinlikle gereklidir.