Name: 16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Keşfedin MALDI-TOF MS ve 16S rRNA gen dizileme ile nadir bakteriyel patojenlerin hızlı tanımlanması. Bu yöntem Myroides odoratimimus gibi organizmaların tanısında maliyet etkin ve güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Prof. Enno Jacobs'a sürekli desteği için teşekkür eder.

Bakteriyel DNA 1. Ekstraksiyon <ol><li> PBS çözeltisi hazırlanması <ol><li> 1.65 g bir şişede 2 HPO 4 x 2H 2, O, 0.22 g NaH 2 PO 4 x 2H 2 O ve 8.80 g NaCI Na tartılır ve 1000 ml&#39;lik bir son hacme kadar damıtılmış su ile doldurun. PH 7.4 ayarlayın. son kullanım için bakteri geçirmez (0.22 um) aracılığıyla filtre çözelti süzülür. </li></ol></li><li> DNA ekstraksiyonu Gram-negatif bakteriler <ol><li> Streak uygun kültür ortamı (örneğin, Columbia kan ağar) hasta malzeme belirlemek ve potansiyel patojenleri izole. </li><li> Saf kültür hazırlayın ve sipariş Morfotip belirlemek ve saflığını teyit etmek ve kültür 49 Gram-boyama gerçekleştirin. </li><li> tek bir bakteriyel koloniden almak ve 1 ml PBS çözeltisi ihtiva eden bir steril 2.0 ml&#39;lik tepkime tüp içine 1 ul tek kullanımlık aşılama döngü ile aktarın. </li><li> Bir Thermomix&#39;in bu süspansiyon inkübe10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de er. İnkübasyondan sonra, oda sıcaklığına soğutun, bakteriyel ekstresi (çözünmüş DNA içeren) izin ve ya daha fazla kullanım (Şekil 1A) -20 ° C&#39;de amplifikasyonu veya saklamak için doğrudan kullanımı. </li></ol></li><li> DNA Ekstraksiyon Gram-pozitif bakteriler <ol><li> Streak uygun kültür ortamı (örneğin, Columbia kan ağar) hasta malzeme belirlemek ve potansiyel patojenleri izole. kültür Morfotip doğrulamak için Gram boyama gerçekleştirin. </li><li> Saf kültür hazırlayın ve sipariş Morfotip belirlemek ve kültür saflığını teyit etmek Gram-boyama gerçekleştirin. </li><li> steril 1 ul inokülasyon döngü ile tek bir bakteriyel koloniden almak ve 2.0 ml bir reaksiyon tüpünde 500 ul PBS çözeltisi içinde askıya. </li><li> 500 ul cam boncuk ilave edilir ve 5 dakika boyunca, yüksek frekans ve genlik (50 Hz) çalıştırılan bir salınım homojenleştirici, tüp aktarın. 1.0 mm çapında cam boncuklar kullanınbakteriyel hücre duvarlarının bozabilir. </li><li> 95 ° C de 10 dakika boyunca, bu tüp inkübe ve oda sıcaklığına soğutun. Daha fazla kullanım için -20 ° C &#39;de, PCR reaksiyonu veya deposu için özü doğrudan kullanın. </li></ol></li></ol> 2. 16S rDNA PCR <ol><li> Yükseltme primerlerinin hazırlanması <ol><li> primerler TPU1 kullanarak (5&#39;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 &#39;[M = A / C]) ters primer olarak ileri primer ve RTU4 (5&#39;-TAC CAG GGT ATC TAD TCC TGT T-3&#39;) halinde 25. , DNAz, ve RNaz içermeyen su ile bir primer stok çözelti hazırlayın 100 pmol / ul (100 uM) bir konsantrasyona sahiptir ve 10 pmol / ul bir çalışma çözeltisine daha da seyreltilmesi. -20 ° C&#39;de astar stok ve çalışma çözümü saklayın veya doğrudan kullanın. </li></ol></li><li> PCR reaksiyon karışımı hazırlanması <ol><li> Pipet 1 her bir primerden ul, 1 ul dNTP karışım (100 mM), DNA özü 2.5 uL, 25 mM Mg ihtiva eden 5 ul 10x PCR tamponu (Steril bir 200 ul reaksiyon tüpüne Cl 2), Taq-polimeraz ul 0.25 (5 adet / ul) ve 39.25 ul DNAse- ve RNAse ücretsiz PCR su. </li></ol></li><li> PCR Protokolü <ol><li> şu şekilde inşa PCR programı: İlk olarak, Taq polimerazı aktive etmek için gerekli olan 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de bir başlangıç ​​inkubasyon adımı. İkinci olarak, 35 amplifikasyon döngüsü, 1 dk ihtiva etmektedir. 95 ° C, 1 dakika denatürasyon adımı. 50 ° C &#39;de primer tavlama aşamasından ve 72 ° C&#39;de 1.5 dakika primer uzatma adımı. Üçüncü olarak, 72 ° C&#39;de 10 dakika boyunca son bir uzatmadan oluşmuştur. Son olarak, PCR reaksiyonu, 4 ° C&#39;ye kadar soğutulur. Not: Staphylococcus aureus ve H2O pozitif ve negatif kontrol görevi (Şekil 1b). </li><li> PCR PCR reaksiyon karışımı içeren tüp yerleştirin ve programı başlatın. </li></ol></li><li> PCR ürünün saflaştırılması Not: PCR ürünü saflaştırmak için çeşitli protokoller olarak daEnzim bazlı ya da bir silika yüzerme matris ile birlikte kullanılabilir. Burada kullanılan tek aşamalı PCR temizleme iki hidrolitik enzim reaksiyonları kullanır. Ekzonükleaz I (Exo I) tek sarmallı DNA kaldırır iken, karides alkalin fosfataz (SAP) tüzel kişiliği olmayan dNTP hidrolize. yıkayın - - düşük tuz yıkama döngüsü ikinci prosedür yüksek tuz hızlı bağlama ile bir silika membran adsorpsiyon tekniği dayanmaktadır. <ol><li> 25 ul PCR ürününe Exo ve Sap her ikisini de içeren bir enzimatik karışımı 1.5 ul ekleyin, iyice karıştırın ve 80 ° C&#39;de 15 dakika, ardından 37 ° C&#39;de, ilk 15 dakika içinde basit bir protokol uygulanarak bir PCR transfer. -20 ° C&#39;de saflaştınlmış PCR ürünü, ya saklayın veya PCR etiketlenmesi için hedef olarak doğrudan kullanımı. </li></ol></li></ol> 3. DNA Agaroz Jel Elektroforezi <ol><li> Elektroforez tamponu (TBE tampon) hazırlanması <ol><li> (10 54.0 g (445 mM) Tris baz, 27.5 g (445 mM), borik asit ve 0.5 M EDTA 20 ml titremM) bir şişe içinde NaOH ile pH 8.0 çözeltisi ve 1.000 ml&#39;lik toplam hacme kadar damıtılmış su ile doldurun. Sonra elektroforez için distile su (0.5x TBE) ile bu 5x tampon 01:10 sulandırmak. </li></ol></li><li> Yükleme Tamponu hazırlanması <ol><li> 250 mavi mg bromofenol, 250 mg ksilen cyanol FF ve bir balona polisükroz (Malzeme Tablosu) 15 g karıştırın. Daha sonra, 100 ml&#39;lik toplam hacme kadar 0.5x TBE tamponu ile doldurun. Daha fazla kullanım için -20 ° C &#39;de yükleme 1 ml&#39;lik kısımlar boyayı ve mağaza kısım. </li></ol></li><li> Agaroz Jel Döküm <ol><li> (Ağırlık / hacim) agaroz jel,% 2 hazırlamak için, agaroz bir şişede 300 mL 0.5x TBE tamponu (bkz 3.1.1) 6 g, standart elektroforezi tartılır. Daha sonra agaroz tamamen eriyene kadar ısıtın, bir mikro dalga fırın içinde yakın kaynama noktalı agaroz karışımı koymak ve çözelti berrak görünür. </li><li> Erimiş agaroz yeterince soğumasını bekleyin ve% 1 10 ul ekleyin etidyum bromür stok Solu (w / v)yon. bir döküm haline çözüm dökün ve döküm (30 kuyular için izin) bir jel tarağı yerleştirin. Jel tamamen katılaşmış olduğunda tarağı çıkarın ve 0.5x TBE tamponu içeren elektroforez odasına jel koydu. NOT: Etidyum bromür toksik ve mutajenik olduğunu. Bu nedenle dikkatli ele alınmalıdır. Nitril eldiven kullanılması tavsiye edilir. toksik olmayan bir alternatif olarak kullanılabilecek alternatif interkalasyon nükleik asit lekeler bulunmaktadır. </li></ol></li><li> PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi Not: PCR amplikonlarının doğru boyutu doğrulamak ve saflaştınlmış PCR ürünü, agaroz jeli içinde ayrılmış DNA konsantrasyonu tahmin etmek için. <ol><li> Pipet 2, bir PCR reaksiyon tüpüne yükleme tamponu ul PCR ürününün 8 ul ilave edin. jel kuyulara bu karışımı pipetle. PCR ürününün boyutunu tahmin etmek için, ayrı bir biçimde düzenlenmiş bir moleküler boyut işaretleyici (DNA merdiveni) 8 ul ekle. </li><li> Uygulamaksabit 10 V / cm voltaj ve Bromophenol Mavi işaretleyici yaklaşık ¾ jel toplam uzunluğunun ulaşmıştır en kısa sürede elektroforez durdurun. UV-transilluminator (dalga boyu 302 nm) kullanılarak ayrılır PCR parçaları görselleştirmek ve bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak belge. DNA merdiveni ile karşılaştırma yapılarak DNA miktarını tahmin edin. etiketleme PCR için hedef olarak yaklaşık 10 ng kullanın. </li></ol></li></ol> 4. Sanger dizileme <ol><li> Cycle Sequencing PCR NOT: ticari bir kit (Malzeme Tablosu) kullanarak 10 ul reaksiyon PCR etiketleme gerçekleştirin. <ol><li> 5x Reaksiyon master 2 ul DNA hazırlama 2 ul, TPU1 ya RTU4 çalışma çözeltisi (10 pmol / ul) ve DNAaz 4.5 ul, ve RNaz içermeyen su 1.5 ul ekle. </li><li> Bir termalcycler bu sıralama reaksiyon karışımı koyun ve başka PCR çalıştırın. Toplam olarak, 25 ile devir (96 ° C, bir sunileştirme aşamasından,10 saniye), bir tavlama aşaması (45-60 ° C, 5 saniye) ve bir uzatma aşamasından (60 ° C, 2 dakika). Son olarak, 4 ° C&#39;ye kadar reaksiyon soğutulur. </li></ol></li><li> Sekanslama reaksiyonu saflaştırılması <ol><li> PCR saflaştırma (Malzeme Tablosu) ticari dönüş sütunlarını kullanarak etiketleme reaksiyon karışımı arındırın. </li><li> Önceden hidratlanmış jel filtrasyon matris üzerine sıralama reaksiyonunun 10 ul yükleme ve 3 dakika boyunca 750 x g&#39;de bir santrifüjleme adımı gerçekleştirmek. Not: Birleşmemiş boya terminatörler jel matris içinde muhafaza edilir, bu prosedürün kullanımı ile. </li><li> Daha sonra, bir vakum yoğunlaştırıcısı sulu eluat kurutun. 40 ° C&#39;de 20 ila 30 dakika için 2500 x g&#39;de santrifüjleyin kurumanın tamamlanması. </li><li> yüksek deiyonize formamid 10 ul, daha sonra 2 dakika süre ile, 90 ° C&#39;de denatüre etmek ve buz karışımı soğumaya ekleyin. Pipet 96 oyuklu bir plaka üzerinde ul denatüre numunelerin 10 ul. Analiz ise -20 ° C de kurutulur ve temizlenmiş PCR ürünü Mağazadaha sonra yapılacak. </li></ol></li><li> 16S rRNA gen sıralamada ve DNA Sekans Analizi NOT: Otomatik bir sequencer (Malzeme Tablosu) üzerine dizi analizi yapın. Burada kullanılan Sequencer sıvı polimer 67 (Şekil 1 c) (50 cm 4-kapiller dizi) eş zamanlı olarak 4 örnekleri analiz otomatik bir flüoresan bazlı kapiler elektroforez sistemidir. <ol><li> sequencer mikrotiter plaka koyun. 2&#39;de düzenlendiği şekilde bir örnek levha (plaka kaydı) yaz, kaydetmek ve 1 de verilen adımları izleyerek sıralama çalıştırma / analiz başlar. NOT: Bir dizi çalışma süresi 2 saat ve 800 1000 bp veri sağlar. </li><li> Dizilim analizi yazılımı (Malzeme Tablosu) açın. Dizi verileri bir metin dosyasına (.seq) ve kalite değerleri (QV) de dahil olmak üzere Elektroferogram içeren bir dosya olarak verilmektedir (.ab1). NOT: Baz arama başına otomatik olarakdizi analizi yazılımı ile oluşturulur ve altta yatan elektroferogramıdır görsel olarak kontrol edilir (örneğin, pik yüksekliği, tepe ayrılması) sırayla önce daha fazla uygulamalar için kullanılır. </li><li> NCBI nr veritabanı kullanılarak BLAST algoritması (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide) saklanan DNA dizisi dosyasını karşılaştırın. </li></ol></li></ol> 5. MALDI-TOF MS NOT: kütle spektrometresi bir 337 nm N2 lazer kullanan ve belirli bir kontrol yazılımı (Malzeme Tablosu) tarafından işletilmektedir. Spektrumlar, doğrusal modda 2.000 ila 20.000 Da kaplıdır arasında bir kütle aralığı kaydedilir. Örnekler puanları veri yorumlama ve tahsisi bir analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) (Şekil 1d) tarafından gerçek zamanlı olarak yürütülmektedir. <ol><li> MALDI-TOF MS analizi için Bakteri hazırlanması <ol><li> Col (örn, Myroides odoratimimus) ilgi bakterileri büyürbakteri suşu (Şekil 2a) bağlı olarak, 18 ila 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de% 5 at kanı içeren Umbia Kan agar. kültür soruşturma altında organizmanın Morfotip yanı sıra saflığını doğrulamak için Gram boyama gerçekleştirin. </li><li> 96 oyuklu bir çelik, hedef bir kuyucuğuna tek bir bakteriyel koloniden aktarmak için bir kürdan (Resim 2b ve 2c). Noktası 1 çelik hedef hava ile kurutulmuş organizma üzerine% 70 formik asit ul, yaklaşık 2-3 dakika boyunca kurumaya bırakın. </li><li> Daha sonra, bir organik çözücü (% 50 asetonitril,% 2.5 trifloroasetik asit,% 47.5 H2O) &#39;de 50 mg / mL CHCA (α-siyano-4-hidroksisinamik asit) ihtiva eden, 1 ul matrisi çözeltisi ile yer kaplaması. Not: (kalıp hazırlama yöntemi ile) asit bindirme yöntemi kütle spektrumları kalitesini artırmak için kullanılabilir. Gram-pozitif bakteriler için gösterilmiştir böyle bir &quot;asit saldırısı&quot; skor va artırırÖlçülen spektrumları 45 frengi. Not: Alternatif olarak, bir otomatik örnek hazırlama sistemi (Malzeme Tablosu) olan bir birinci kurutma döngüsünden sonra 1 | il% 70 formik asit solüsyonu ve temas bilgilerini lekeler, 1 ul matrisi çözeltisi bakteriyel yayma uygulanır kullanılabilmektedir. Örnekler daha sonra% 60 nispi nemde standart koşullar altında kurutuldu ve analiz için kullanılacak hazırdır. </li><li> matrisi ile smear bir kaputu yaklaşık 5 dakika süreyle tekrar hava kuru üst üste edelim. uygulanan matris ile bu bakteri yayma artık birçok saat boyunca stabildir. NOT: matris olmadan Bakteriyel smear nedeniyle protein yıkımı stabil olmayabilir. </li></ol></li><li> -TOF MS Analizi Sahne <ol><li> numune tanıtımı <ol><li> Bizim MMIS (Malzeme Tablo) kontrol yazılımı açın. </li><li> enstrümanın IN / OUT düğmesine basarak kütle spektrometresi örnek yükleme noktasını havalandırınız. </li><li> Bir tıklama sonra yükleme noktasını açın ve kurutulmuş bakteriyel smear artı matris ile MALDI-TOF MS hedef plakası yerleştirin. </li><li> port kapatın ve tekrar tahliye. Vakum gözlemleyin ve ulaştığında 4.5 x 10 -6 mbar ölçümü başlatın. </li></ol></li><li> numune Analizi <ol><li> Bizim MMIS (Malzeme Tablo) analiz yazılımı açın ve &quot;Dosya&quot; menüsünü tıklatın. &quot;Yeni sınıflandırma&quot; ve yeni bir pencere &quot;MALDI biotyper gerçek zamanlı sınıflandırma sihirbazı&quot; Seç açılır. Proje adı &quot;alanına, Myroides ölçüm project_1&quot; örnek için, proje adını yazın &quot;ve düğmesine basın,&quot; Yeni bir proje &quot;olarak adlandırılan yeni bir diyalog kutusu altında.&quot; Yeni &quot;onay proje adı ve düğmesine basarak devam&quot; Tamam &quot;. </li><li> &quot;MALDI biotyper gerçek zamanlı sınıflandırma sihirbazı&quot; açık &quot;analit yerleştirme&quot; penceresini gözlemlemek. Hedef seç pozisyonları (örneğin, A1, A2, A3 ...), sağ-click seçilen herhangi bir (mavi kare ile gösterilir) pozisyonu ve &quot;örnekleri Ekle&quot; seçeneğini seçin. Örnek adı, örnek kimliği ve isteğe bağlı olarak bir yorumda otomatik olarak açılır tablo görünümü türü. Devam etmek için lütfen &quot;Next&quot; tıklayın. </li><li> &quot;MALDI biotyper gerçek zamanlı sınıflandırma sihirbazı&quot; açık &quot;Seçim MALDI ve biotyper yöntemleri&quot; penceresini gözlemlemek. dan &quot;Bruker Taksonomisi&quot; &quot;sınıflandırma ağaçlarından MSP&#39;ler&quot; ı seçin ve devam etmek için &quot;İleri&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> &quot;MALDI biotyper gerçek zamanlı sınıflandırma sihirbazı&quot; açık &quot;Proje özeti&quot; penceresini gözlemlemek. Gerçek sınıflandırma projesi için yukarıda verilen eklenen girişleri kontrol edin. Lütfen &quot;Finish&quot; tuşuna basarak çalıştırın sınıflandırma başlatın (Şekil 2d - f). Uygun vakum ulaşıldığında Ölçüm otomatik olarak başlar. </li><li> Ölçüm başarıyla tamamlanana kadar sınıflandırma çalışmasını izleyin. t sonuçlar tablo görüntüleO &quot;MALDI Biotyper Gerçek Zamanlı Sınıflandırma Projesi Myroides ölçüm project_1&quot; menüsü &quot;Görünüm&quot; açın ve &quot;Sonuçlar&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> varsayılan web tarayıcısında HTML dosyası olarak &quot;Bruker Daltonics MALDI Biotyper Sınıflandırma Sonuçları&quot; görüntüleyin. Yazdırın ve sonuçları kaydedin. </li></ol></li><li> Cihazı kalibre ve enstrüman doğrulama haftalık (enstrüman kendi kendini sınama) gerçekleştirmek için analiz örnek günlük öncesinde bir test standardı ölçün. NOT: Ölçüm MALDI-TOF spektrumları sırasında analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) tarafından gerçek zamanlı olarak analiz edilmektedir. kendi puanlarıyla on türlerinin listesi verilmiştir ve raporlama için laboratuvar bilgi sistemi (LIS) beslenir. </li><li> Kritik MALDI-TOF MS sonuçları (Örnek sonuçlara bakınız) ve, uygun olduğunda, bu için gerekli olan Gram boyama durumunda biochemical- ve antibiyotik duyarlılık profilleri veya 16S rRNA gen dizilimi ve diğer testler arasında, değerlendirilmesimikrobiyolojik raporuna bakteri türlerini atama. </li></ol></li></ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

-TOF MS ve 16S rRNA gen sıralama Hem farklı bakteri çok sayıda tespit imkanı sunuyoruz. MALDI-TOF MS kolu ve bakteriyel kütle spektrumları büyük veri tabanları kullanılabilir kolay, hızlı ve ucuz bir yöntemdir. Bu nedenle, MALDI-TOF MS nadir bakteriyel patojenler 17,20,39,51 odaklanmış tarama çalışmaları yapmak için hızlı, uygun maliyetli ve güvenilir bir yöntemdir. Diğer fenotipik tanımlama yöntemleri, Seng ve ark. Göstermiştir maliyet etkinliği ve MALDI-TOF MS 59 ve Tan hızı ile MALDI-TO...

Rutin teşhis nadir patojenlerin güvenli kimlik klasik kültürel ve biyokimyasal yöntemler hantal ve bazen tartışmalı olduğu gerçeği ile engellenmektedir. Bundan başka, bir teşhis mikrobiyoloji laboratuar otomatik sistemlerin kullanılmasını gerektirir günlük olarak birkaç bin birkaç yüz kadar patojenlerin çok sayıda, işleme alır. Bir günlük yüksek verim yönetiminde ek olarak, bakteri türleri kesin tanımlanması gereklidir. Onların antibiyotik duyarlılık paterni farklı ve bu nedenle doğru tanımlama, uygun antibiyotik seçmek için gerekli bilgileri (örneğin, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43 ile klinisyene sağlar çünkü bu garanti edilir. Otomatik mikrobiyal tanıma sistemleri (Amis) bakteriyel izolatların metabolik özelliklerini karakterize etmek için enzimatik reaksiyonların standart setleri uygulamak <sup&gt; 13,15,16,26,27. Bu sistemlerde kullanılan kartuşlar farklı biyokimyasal reaksiyonların çok sayıda, örneğin, bu çalışmada 52 kullanılan Amis GN kartı 47, sadece bakterilerin sınırlı kümesi için bu strateji izin güvenli kimlik kullanmak rağmen. Ayrıca, veritabanı, gelişmiş bir uzman sistem, açıkça tıbbi önemi 13,15,16,36 ilgili ve son derece alakalı bakterilerin saptanması üzerine odaklanmıştır. yaygın laboratuarlarda kullanılan iki başka sistemler de bakteriyel tanımlama için biyokimyasal bir yaklaşım geçerlidir. Türler 35 level üzerinde 3. Amis sadece% 82.4 bir kimlik doğruluğunu sahipken Son çalışmalar, bu çalışmada kullanılan Amis ve rakiplerinden biri (% 93.7 ve sırasıyla% 93.0) arasında bir mukayese kimlik doğruluğunu göstermektedir. Bu tür farklılıklar altta yatan kimlik verileri referanslar, kitler ve yazılım METABO farklılıklar versiyonları kalitesi ile açıklanabilirtutumların ve teknik personel 35,36 yeterlilik. İki otomatik -TOF MS sistemleri (-TOF mikrobik tanımlama sistemi, MMIS) çoğunlukla kullanılır. Bu sistemler, protein, parmak izi kütle spektrumları göre bakteri türlerinin çok sayıda tespiti için verir. Örneğin, kullanılan MMİS veritabanı 6000, referans spektrumları içerir. Kütle spektrometresi dayalı tanımlama sistemleri nadir patojenler 11,48,51 dahil mikroorganizmaların büyük bir çeşitlilik hızlı ve güvenilir şekilde algılanmasını sunuyoruz. Bugüne kadar sadece bir kaç doğrudan karşılaştırmalar bu çalışmada kullanılan MMIS ve rakiplerinin 19,33 arasında mevcuttur. Dæk göre ve ark., Her iki sistem de tanımlama doğruluğu benzer yüksek oranda sağlar, ancak bu çalışmada kullanılan MMİS türlerin belirlenmesi 19 daha güvenilir olduğu görülmektedir. Benzer bir şekilde, moleküler teknikler de, aynı zamanda korunmuş ama adresleme ayrı genler ( <em&gt; örneğin, 16S rDNA veya rpoB) berrak tür kimlik 3,22,61 izin verir. Bunlar arasında, 16S rDNA çünkü tüm bakteriler 34 varlığını en yaygın olarak kullanılan temizlik gendir. Bunun işlevi, biyo-bilişim 14,34 için müsait olması için yeterince uzun olan, yaklaşık 1500 bp ile değişmeden ve son olarak kalır. Birçok araştırmacı bakteri tanımlama 21 &quot;altın standart&quot; olarak 16S rRNA gen analizi görüyoruz. Bu az laboratuar az ya da yeni bakteri 14,34 tanımlanması için bugüne kadar DNA-DNA hibridizasyon teknikleri kullanmak olmasından kaynaklanmaktadır. Buna ek olarak, daha fazla veri tabanı 16S rRNA gen analizinde 50 için kullanılabilir temin edilebilmektedir. Bununla birlikte, 16S rDNA bazlı algılama sistemleri, standart PCR protokollerine göre sınırlı bir duyarlılığa sahip olduğu dikkate alınmalıdır. Dahası, moleküler yaklaşım zaman alıcı, sofistike ve yüksek eğitimli personel yanı sıra gerektirirözel laboratuvar olanakları ve, bu nedenle, kolayca rutin teşhis 55 içine uygulanmadı. Bundan başka, bakteri kimlik, en az iki farklı yöntem kombinasyonu son derece hassas soy tanımlanmasına neden olduğu gösterilmiştir. MALDI-TOF MS ile 16S rDNA sekanslama kombinasyonu, yüksek hassasiyetle farklı bakteri türlerinin çok sayıda tanımlanmasına izin verir. Son zamanlarda -TOF MS ve 16S rRNA gen analizinin kombinasyonu epidemiyolojik soruları ve nadir patojenler 56 okuyan bakteri tanımlama için sunuldu.

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV, HPLC sınıfı su, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Almanya</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Doku Lizörü LT</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>85600</td><td>Salınımlı homojenizatör</td></tr><tr><td>Cam boncuklar 1.0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Almanya</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer 5436</td><td>Eppendorf, Hamburg, Almanya</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kiti (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Taq PCR Çekirdek Kiti (1.000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>İleri Primer TPU1 (5&akut;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')</td><td>biomers.net, Ulm, Almanya&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ters Astar RTU4 (5&akut;-TAC, CAG, GGT, ATC, TAA, TCC, TGT, T-3&akut;)</td><td>biomers.net, Ulm, Almanya&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Almanya</td><td>-&nbsp;</td><td>Termosilindir</td></tr><tr><td>Reaksiyon tüpü 1.5 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>72.692</td><td></td></tr><tr><td>Reaksiyon tüpü 2 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>72,693,005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Almanya</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Almanya</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11&nbsp;</td><td>Sharp Electronics, Hamburg,</td> <td>Almanya-Mikrodalga</td><td></td></tr> <tr><td>Titriplex III (EDTA Na2-tuz dehidrat; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Almanya</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - 100 ila 1.000 bp</td><td>Eurogentec, L&uuml; ttich, Belçika</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Almanya</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen siyanol FF (10 g)</td> <td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Almanya</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi&nbsp;</td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf,</td> <td>Almanya-Etidyum</td><td></td></tr> <tr><td>bromür çözeltisi %1 (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, M&uuml; nchen,</td> <td>Almanya-Jel-dokümantasyon</td> <td>sistemi&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 reaksiyon)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Birleşik Krallık</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>Tampon (10x) EDTA&nbsp ile;</td><td>Yaşam Teknolojileri, Darmstadt, Almanya</td><td>402824</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminatör Kiti v1.1</td><td>Yaşam Teknolojileri, Darmstadt, Almanya</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di formamid (25 ml)</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Almanya</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>DyeEx 2.0 Spin Kiti (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetik Analiz Cihazı</td><td>Yaşam Teknolojileri, Darmstadt, Almanya</td><td>-</td><td>Sequencer</td></tr><tr><td>MicroAmp barkodlu optik 96 kuyulu reaksiyon plakası</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Almanya</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetik Analiz Cihazı, plaka tabanı 96 kuyulu</td><td>Yaşam Teknolojileri, Darmstadt, Almanya</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetik Analiz Cihazı, plaka tutucu 96 kuyulu</td><td>Yaşam Teknolojileri, Darmstadt, Almanya</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetik Analiz Cihazı, kuyu plaka septa</td><td>Yaşam Teknolojileri, Darmstadt, Almanya</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetik Analiz Cihazı, POP-7 Polimer, 7 ml</td><td>Yaşam Teknolojileri, Darmstadt, Almanya</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetik Analiz Cihazı, 4 Kılcal Dizi, 50 cm</td><td>Yaşam Teknolojileri, Darmstadt, Almanya</td><td>4333466</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Analiz Yazılımı 5.4</td><td>Yaşam Teknolojileri, Darmstadt, Almanya</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td><td></td> <td>Almanya-mMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Almanya&nbsp;</td><td></td><td>2nd mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Almanya-Cihaz</td> <td>kontrol yazılımı</td></tr><tr><td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Almanya-Analiz</td> <td>yazılımı</td></tr> <tr><td>alfa;-siyano-4-hidroksisinnamik asit, HCCA, 1&nbsp; g</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Almanya</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>Peptit Kalibrasyon Standardı II</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Almanya</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 hedef cilalı çelik</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Almanya</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab&nbsp;</td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper Gökadası&nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Almanya</td><td>Parça No. 1836007&nbsp;</td><td>Otomatik numune hazırlama sistemi</td></tr><tr><td>Vitek 2&nbsp;</td><td>bioM ve eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Almanya&nbsp;</td><td></td><td>aMIS</td></tr><tr><td>MicroScan&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Krefeld, Almanya</td><td></td><td>2nd aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix & trade; Otomatik Mikrobiyoloji Sistemi</td><td>BD, Heidelberg, Almanya</td><td></td><td>3rd aMIS</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;subsp.&nbsp; aureus&nbsp; Rosenbach (ATCC&reg; &nbsp; 25923&ticaret;)</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC), LGC Standartları, Molsheim, Fransa</td><td></td><td>PCR için pozitif kontrol&nbsp;</td></tr></tbody></table>

16s rrna gen sıralama ve maldi-tof ms tarafından nadir bakteriyel patojenlerin tanımlanması

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda ciddi enfeksiyonlara neden bildirilmiştir nedenle, yetersiz tarif, nadir ve bakteriyel patojenler bir dizi vardır. Çoğunlukla olgu sunumları olarak yayınlanan çoğu durumda sadece birkaç veri, içinde, bir enfeksiyöz ajan gibi patojenlerin rolünü araştırmak hangi mevcuttur. Bu nedenle, bu tür mikroorganizmaların patojenik karakterini açıklamak için, bakterilerin büyük sayılardan epidemiyolojik çalışmalar yapmak gerekmektedir. suşlarının tanımlanması, bunlar rutin tanı, (sağlamlık) işlemek için kolay, ekonomik olmalıdır geçerli terminolojisine göre doğru olmalı ve onlar karşılaştırılabilir üretmek zorunda: Böyle bir sürveyans çalışmasında kullanılan yöntemler aşağıdaki kriterleri karşılamak için var laboratuvarlar arası sonuçları. Genellikle rutin bir ortamda bakteri suşları tanımlamak için üç strateji vardır: Bıochemıca karakterize 1) fenotipik tanımlamaBakterilerin l ve metabolik özellikleri, 2) bu tür yeni bir proteom göre bir yaklaşım olarak 16S rRNA gen dizilimi ve 3) kütle spektrometrisi gibi moleküler teknikler. kütle spektrometrisi ve moleküler yaklaşımların bakteriyel türlerinin büyük bir çeşitlilik belirlemek için en umut verici olduğu için, bu iki yöntem tarif edilmiştir. Bu teknikler kullanılarak Gelişmeler, sınırlamalar ve potansiyel problemler tartışılmıştır.

-TOF MS bir roman, mikrobiyolojik rutin teşhis için hızlı ve ucuz bir yöntemdir. MALDI-TOF MS tarafından bakteri türleri tanımlama özellikle ribozomal proteinler, aynı zamanda diğer &quot;çevre koşullarından en az bir ölçüde etkilenen ev tutma işlevleri ile çok korunmuş protein&quot; oluşan spektrumları üreten bu MMİS 17 .bir veritabanı başvurusu spektrumları büyük bir kümesini içerir ve genelde klinik izolatlarda bulunan bile bakteri güvenli 7,56,57 tespit edilebil...

Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) ve moleküler teknikler (16S rRNA gen dizilimi), rutin teşhiste nadir görülen bakteriyel patojenlerin tanımlanmasına izin verir. Bu protokolün amacı, daha doğru ve güvenilir verilere yol açan her iki tekniğin kombinasyonunda yatmaktadır.

16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Bu MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi protokolünün genel amacı, hızlı ve maliyet etkin bir prosedür aracılığıyla nadir patojenlerin tanımlamasını geliştirmektir. Bu yöntem, tanısal mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve nadir bakteriyel patojenlerin hızlıca tanımlanmasına olanak tanır. Bugün, odoratimimus ve Myroides cinsi bakteriler hakkında konuşmak istiyoruz.Yöntemi göstermek ve sonuçların yorumlanması hakkında konuşmak için. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler; bakterilerin aktarılması, metriklerle kaplama ve sonuçların yorumlanması teknik beceri ve mikrobiyolojik uzmanlık gerektirdiğinden bunu zor bulabilirler. MALDI-TOF MS'yi nadir bakterileri taramak için kullanma fikri ilk olarak, hastanemizde myroides odoratimus kaynaklı diyabetik ayak enfeksiyonu yaşayan bir hastamız olduğunda ortaya çıktı.Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı şekilde bakteriyel DNA ekstraksiyonu, 16S ribozomal DNA PCR ve Sanger dizileme ile başlayın. Tek bir bakteri kolonisini 96 kuyucuklu çelik hedefin bir kuyucuğuna aktarmak için ahşap bir kürdan kullanın. Çelik hedef üzerindeki hava ile kurutulmuş organizmanın üzerine bir mikrolitre %70 formik asit daml

identification-rare-bacterial-pathogens-16s-rrna-gene-sequencing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Uçuşu (MALDI-TOF) kütle spektrometresi (MS), doğrudan kan kültür çorbasına matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman uygulanması bakteri tanımlanmasını hızlandırır. Sunulan yöntemi doğrudan kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin tanımlanması için hızlı ve güvenilir bir yöntemdir.

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

Bu çalışma, MALDI-TOF MS kullanarak bakterilerin hızlı bir şekilde tanımlanması için prosedürleri detaylandırır. Tanımlama prosedürleri, spektrum toplama, veri tabanı oluşturma ve takip analizlerini içerir. Benzerlik katsayısına dayalı ve biyobelirteç tabanlı yöntemler olmak üzere iki tanımlama yöntemi sunulmuştur.

MALDI-TOF Kütle Spektrometresi ve Özel Veritabanı kullanımı Benzersiz Mağarası Çevre (Kartchner mağaraları, AZ, ABD) Yerli Bakteriler niteleyin için

Kütle spektrometresi tabanlı phyloproteomics (MSPP) Campylobacter jejuni ssp bir koleksiyon yazın kullanıldı. Doylei multilokus dizisi yazarak (MLST) kıyasla gerilme seviyesinde izole eder.

alt türlerinin<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Kütle Spektrometre tabanlı PhyloProteomics kullanma izolatlar (MSPP)

Bu el yazması yüksek üretilen iş 16S rRNA amplicon sıralama, detaylı bir standart protokolünü açıklar. Protokol dışkı örneği koleksiyonu veri analizleri ile başlayarak bir entegre, üniformalı, uygun ve ucuz protokol tanıttı. Bu protokol analiz örnekleri titiz standartları ile çok sayıda ve çeşitli denetimler sağlar.

16S rRNA Amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı

IDBac, bakteriyel kolonilerden kazınmış hücre malzemesinde toplanan, hem bozulmamış protein hem de özel metabolit spektrumlu verileri birleştiren açık kaynaklı Kütle Spektrometrisi bazlı Biyoinformatik boru hattıdır. Boru hattı araştırmacılar hızlı bir şekilde on binlerce bakteriyel koloniler Putatif taksonom gruplara düzenlemek için izin verir ve daha fazla özel metaboliti üretimi dayalı ayırt.

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

Burada açıklanan serbestçe kullanılabilir araçları kullanarak 16S rRNA metagenomik sıralama ve analiz kullanarak mikrobiyom profilleme için basitleştirilmiş bir standart işletim prosedürüdür. Bu protokol mikrobiyom alanında yeni araştırmacılar yanı sıra daha yüksek bir çözünürlükte bakteriyel profilleme elde etmek için yöntemler güncellemeleri gerektiren yardımcı olacaktır.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

Burada, maldi-TOF-TOF tandem kütle spektrometresi ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz kullanılarak genomik olarak sıralanmış patojenik bakteriler tarafından üretilen proteinlerin şirket içinde geliştirilen yazılımla hızlı tanımlanması için bir protokol sunuyoruz. Metastable protein iyonları, aspartik asit etkisi nedeniyle parçalanır ve bu özgüllük protein tanımlaması için yararlanılmıştır.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak Escherichia coli'de Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması

Bu protokol, kültür ürünlerini MALDI-TOF MS ile birleştirerek süt ürünlerindeki mikrobiyal bileşimin hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Geleneksel kültür yöntemlerinden daha kısa bir geri dönüş süresi ile 16S rRNA dizilimi ile karşılaştırılabilir taksonomi sonuçları sunar.

MALDI Yaklaşımı ile Bakteriyel Proteomik Profilleme Kullanılarak Süt Ürünlerinin Mikrobiyal Güvenliğinin Değerlendirilmesi

Öncelikli bakteriyel patojenlerin tespiti için basit bir yöntem, genetiği muhabiri faj kullanmaktır. Kendi özel konak türe özgü Bu muhabir faj, konak hücreleri için bioluminescent sinyal yanıt hızla uyum sağlama yeteneğine sahiptir. Burada, biz tespiti için muhabir faj kullanımını...

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri,...

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Keşfedin MALDI-TOF MS ve 16S rRNA gen dizileme ile nadir bakteriyel patojenlerin hızlı tanımlanması. Bu yöntem Myroides odoratimimus gibi organizmaların tanısında maliyet etkin ve güvenilir sonuçlar sağlar.

16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

Daha fazla video keşfet