16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması
July 11th, 2016
Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) ve moleküler teknikler (16S rRNA gen dizilimi), rutin teşhiste nadir görülen bakteriyel patojenlerin tanımlanmasına izin verir. Bu protokolün amacı, daha doğru ve güvenilir verilere yol açan her iki tekniğin kombinasyonunda yatmaktadır.
Bu MALDI-TOF Kütle Spektrometresi protokolünün genel amacı, hızlı ve uygun maliyetli bir prosedürle nadir patojenlerin tiplendirilmesini iyileştirmektir. Bu yöntem, tanısal mikrobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, nadir bakteriyel patojenlerin hızlı bir şekilde düzenlenmesine izin verir. Bugün, Myroides cinsinin odoratimimus ve bakterileri hakkında konuşmak istiyoruz.
Yöntemi göstermek ve sonuçların yorumlanması hakkında konuşmak. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bakteri transferi, metriklerle örtüşme ve sonuçların yorumlanması teknik beceri ve mikrobiyolojik uzmanlık gerektirdiğinden zor bulabilirler. Nadir bakterileri taramak için MALD-TOF MS'yi kullanma fikri ilk olarak, hastanemizde myroides odoratimus'un neden olduğu diyabetik gıda enfeksiyonundan muzdarip bir hastamız olduğunda aklımıza geldi.
Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı gibi bakteri DNA'sının ekstraksiyonu, 16S ribozomal DNA PCR ve Sanger dizilimi ile başlayın. Tek bir bakteri kolonisini 96 kuyulu çelik hedefin kuyusuna aktarmak için tahta bir kürdan kullanın. Çelik hedef üzerindeki havayla kurutulmuş organizmanın üzerine bir mikrolitre %70 formik asit yerleştirin ve yaklaşık iki ila üç dakika kurumaya bırakın.
Lekeyi% 50 asetonitril, 2.5 trifloroasetik asit ve% 47.5 sudan oluşan organik bir çözücü içinde 50 mg / ml CHCA içeren bir mikrolitre matris çözeltisi ile kaplayın. Leke ve üst üste binen matrisi bir başlıkta yaklaşık beş dakika kurumaya bırakın. Numuneleri tanıtmak için, cihazın giriş/çıkış düğmesine basarak kütle spektrometresinin numune yükleme portunu havalandırın.
Yükleme portunu açın ve kurutulmuş bakteri yayması artı matrisi ile MALDI-TOF MS hedef plakasını yerleştirin. Limanı kapatın ve tekrar boşaltın. Vakumu gözlemleyin ve 4,5 milyon milibara ulaştığında ölçüme başlayın.
MMIS analiz yazılımını açın ve dosya menüsüne tıklayın. Yeni Sınıflandırmayı Seç" ve "MALDI Biotyper Gerçek Zamanlı Sınıflandırma Sihirbazı" adlı yeni bir pencere açılmalıdır. "Proje Adı" alanına proje adını yazın ve Yeni'ye tıklayın, Yeni Proje adlı yeni diyalog kutusunun altında proje adını kontrol edin ve Tamam" butonuna tıklayarak ilerleyin.
MALDI Biotyper Gerçek Zamanlı Sınıflandırma Sihirbazı'nda, Analit yerleştirme penceresini gözlemleyin. Hedef konumları seçin, seçilen herhangi bir konuma sağ tıklayın ve Örnek ekle'yi seçin. Otomatik olarak açılan tablo görünümünde, örnek adını, örnek kimliğini ve isteğe bağlı olarak bir açıklama yazın.
Devam etmek için İleri" düğmesine tıklayın. Ardından, MALDI Biotyper yöntemleri penceresinin seçimini gözlemleyin. Taksonomi Ağaçları'ndan MSP'lerden "Bruker Taksonomisi"ni seçin ve devam etmek için İleri"ye tıklayın.
Ardından, proje özeti penceresine bakın. Gerçek sınıflandırma projesi için yukarıda verilen eklenen girişleri kontrol edin. "Finish" butonuna tıklayarak sınıflandırma çalıştırmasını başlatın.
Uygun vakuma ulaşıldığında ölçümler otomatik olarak başlar. Ölçüm başarıyla tamamlanana kadar sınıflandırma çalıştırmasını takip edin. Ölçüm tamamlandıktan sonra, menüyü açın Görünüm"ve Sonuçlar"a tıklayınview MALDI Biotyper Gerçek Zamanlı Sınıflandırma Projesi Bir'deki sonuç tablosunu görüntülemek için.
Bruker-Daltonik MALDI Biotyper sınıflandırma sonuçlarını varsayılan web tarayıcısında bir html dosyası olarak görüntüleyin. Sonuçları yazdırın ve kaydedin. Burada, gerçek zamanlı olarak ölçülen ve sınıflandırılan MALDI-TOF MS tarafından elde edilen spektrumlar gösterilmiştir.
Spektrumlara bir tür adı ve ölçümün kalitesini yansıtan bir puan değeri atanır. 2.300'ün üzerindeki puanlar, yüksek olasılıkla bir tür tanımlamasını temsil eder. 2.000 ile 2.300 arasındaki bir puan, güvenli bir tür tanımlamasını gösterir.
1.700 ve 2.000'in altındaki bir puan, olası bir tür tanımlamasını belirtir. Ve 1.700'ün altındaki bir puan güvenilir değildir. Katı bir ortamda saf bir kültürde yetiştirilen bakteriyel patojenlerin tanımlanması iki ila üç dakika sürer.
Nadir bakteri patojenlerinin MALDI-TOF MS ile yalnızca cihazlar uygun spektrumları güvenilir bir şekilde içerdiğinde bulunabileceğini unutmamak önemlidir. Aksi takdirde, karakterize edilmiş izolatlarının tiplendirilmiş suşlarından MaSDA spektrumları entegre edilerek çıkarılması gerekir. Skor sonuçlarının kesin bir suş tanımlamasına yol açmadığı durumda, biyokimyasal profilleme veya 16S rDNA dizilimi gibi başka yöntemler uygulanabilir.
Bu yöntem bakteri tespiti hakkında bilgi sağlayabilse de, mantarlar veya anaeroblar gibi diğer mikroorganizmalara da uygulanabilir. Ayrıca, bakteri direnci ölçülebilir. Tehlikeli bir madde olan bir matrisle çalışmayı, eldiven, koruyucu gözlük takmayı ve kapüşon altında çalışmayı unutmayın.
Ayrıca, analiz odasında sıçramaları önlemek için matrisi kurutmak ve iyice lekelemek kesinlikle gereklidir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, nadir bakteriyel patojenlerin tanımlanmasını geliştirmek için MALDI-TOF Kütle Spektrometresi kullanımını taslak halinde sunmaktadır. Bu yöntemi moleküler tekniklerle entegre ederek, araştırmacılar mikrobiyolojide daha doğru teşhisler elde edebilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Tanı Teknikleri
- Patogen Tanımlama
Arka Plan
- MALDI-TOF MS, patogen tiplemesi için güçlü bir araçtır.
- Nadir bakteriyel patojenlerde rutin teşhislerde zorluklar mevcuttur.
- Geleneksel yöntemlerin sınırlarının anlaşılması kritik öneme sahiptir.
- Etkili uygulama için teknik beceriler gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Nadir patojenlerin tiplemesini geliştirmek.
- Hızlı ve maliyet-etkili bir tanı prosedürü sağlamak.
- Yöntemi belirli bakteriyel örneklerle göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Patogen taraması için MALDI-TOF Kütle Spektrometresi.
- Moleküler tanımlama için 16S rRNA gen sekanslaması.
- Bakteri transferi ve kaplama için teknik prosedürler.
- Kütle spektrometrisi sonuçlarının yorumlanması.
Ana Sonuçlar
- Myroides odoratimimus'un başarılı tanımlanması.
- Nadir patojenlerde hızlı teşhisin gösterilmesi.
- Teknik uzmanlığın öneminin vurgulanması.
- Yöntemin klinik ortamlarda uygulanabilirliği hakkında bilgilerin sağlanması.
Sonuçlar
- MALDI-TOF MS, moleküler tekniklerle birleştiğinde teşhisleri geliştirir.
- Yöntemin etkili kullanımı için eğitim esastır.
- Gelecekteki uygulamalar patogen tanımlama kapsamını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate identification of rare bacterial pathogens is critical for diagnostic microbiology in biopharma R&D, particularly for immunocompromised patient populations. Integrating MALDI-TOF MS with 16S rRNA sequencing enables rapid, cost-effective species-level identification, supporting mechanistic de-risking in antimicrobial target validation. This combined approach improves predictive confidence in preclinical models by reducing false negatives in pathogen detection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by confirming rare pathogen identity in infection models.
- Operational Value: Provides robust, nomenclature-compliant strain identification essential for reproducible target de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage through accurate pathogen characterization in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative score outputs (e.g., >2.300 for highly probable ID) that enable standardized hit confirmation in antimicrobial screens.
- Operational Value: Facilitates assay readiness via rapid (<3 min) pure-culture identification, improving screening throughput and scalability.
- Reproducibility Value: Ensures cross-lab comparability through standardized spectral matching and validated database reliance.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical continuity by validating rare pathogens in clinically relevant infection models.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions when score thresholds (2.000–2.300) confirm secure species identification.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment when pathogen presence correlates with host response in immunocompromised models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, where accurate pathogen identification informs mechanistic studies and lead compound assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by confirming rare bacterial agents in infection models, reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Delivers assay-ready, validated biological systems with quantitative outputs for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides score-based readouts (e.g., MALDI Biotyper classification) that enable objective condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through pathogen validation in disease-relevant systems, only when supported by source material.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable diagnostic capability across multiple rare pathogen projects, reducing redundant validation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of false pathogen assignments, and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of pathogen identification across laboratories.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in antimicrobial programs, capital efficiency via rapid diagnostics, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization of antimicrobial candidates using confirmed pathogen identities in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires microbiological expertise for bacterial transfer, matrix overlay, and result interpretation.
- Dependent on MALDI-TOF MS instrumentation with updated taxonomic databases (e.g., Bruker Taxonomy) for accurate spectral matching.
- Necessitates standardized sample preparation protocols to ensure dry matrix and smear, preventing analyzer contamination.
- Requires fallback to 16S rRNA sequencing or biochemical profiling when MALDI-TOF scores fall below 1.700 for non-reliable identification.
- Involves safety protocols for handling hazardous matrix solutions (e.g., formic acid, acetonitrile) under fume hood with PPE.
