Name: AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Keşfedin fare plazmasitoid dendritik hücre üretimi için AC-6 besleyici hücre sistemi kullanarak ortak lenfoid progenitörlerin in vitro kültürünü. Bu yöntem otoimmün hastalık araştırmalarında verimli hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Dr teşekkür ederiz. Belirteçlerin temin Markus Manz ve Irving Weissman. Biz de sırasıyla Tıp ve NTU hastanenin Ulusal Tayvan Üniversitesi Koleji&#39;nde Akış Sitometrik Analizi ve Birinci Hücre Sıralama Çekirdek Tesisi ve İkinci Çekirdek Laboratuvarı tarafından sağlanan hizmeti kabul. Bu çalışma Bilim ve Teknoloji, Tayvan Bakanlığı tarafından desteklenen (EN 102-2320-B-002-030-My3) ve Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüleri, Tayvan (IHUK-EX102-10256SI ve IHUK-EX103-10256SI).

C57BL / 6 vahşi tip fare, National Laboratory Animal Center (NLAC), Tayvan &#39;den satın alınmıştır. Tüm fareler yetiştirilir ve belirli bir patojen içermeyen koşullar altında tutuldu. Protokoller ve hayvan kullanımı prosedürleri gözden ve Tıp Ulusal Tayvan Üniversitesi Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (İzni No: 20120075) tarafından onaylanmıştır. Ayrıca, araştırmacılar deneyler yaparken hayvanlarda ağrı, acı veya sıkıntı potansiyelini azaltmak için her türlü çabayı. Eldiven yukarıda açıklandığı Tüm işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. AC-6 Besleyici hücreler hazırlanması 1. Not: AC-6.21 (AC-6 kısaca) (I. Weissman, Stanford Üniversitesi tarafından temin edilmiştir) stromal hücre hattı 18 RPMI içinde muhafaza edilmelidir 15% ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. Besleyici hücreler olarak hizmet etmek, AC-6 hücreleri-γ ışınlanmış 3000 rad (30Gy) onların çoğalmasını önlemek için ko-kültür bir gün önce ile vardır. Not inciOnların geçit sayısı 20 üzerinde ise ac-6 hücre bakım sırasında kalabalık bırakılırsa kendi farklılaşma destekleyen yeteneğini kaybetmek eğilimindedir ya. <ol><li> Yıkama AC-6 hücreleri, bir sefer 1 mL Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile aspirasyon ile DPBS çıkarın. AC-6 37 o C&#39;de 3-5 dakika boyunca 0.8 ml tripsin çözeltisi (% 0.05 tripsin ve DPBS içinde 0.5 mM EDTA), sonra% 5 CO2 ve hücreler kültür ortamı 10 hacim için ile seyreltilmesi, reaksiyonu durdurmak Treat tek bir hücre süspansiyonu yapmak. </li><li> 5.9x10 tohum AC-6 hücre 4 hücre / kuyu içine 12-kuyu plakaları ve% 5, 37 o C&#39;de inkübe CO 2 O / N. Not: AC-6 hücrelerinin yoğunluğu cdc nesil lehine olacak bir alt yoğunluğu gibi çok önemlidir. 5.9x10 yoğunluğunda Tohum de AC-6 CLPs gelen pDC&#39;lerde türetilmesi için optimal olan bir sonraki gün, birleşik duruma ulaştılar sağlayacak / 4 hücreleri. </li><li> Γ-ışınlama ile 3000 rad (30 Gy) AC-6 hücreleri ışın tedavisi. Not: Ac-6 ışın tedavisi için kullanılan doz, çoğalan hücreler önlemek ve henüz CLPs DC&#39;lerin farklılaşması için gereken sitokinleri ve hücre-hücre teması sağlamak için yeterince uzun bir canlı tutmak için optimize edilmiştir. </li><li> Kültür ortamı basınçla (% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS, 50 ug / ml gentamisin ve 50 uM β-mersaptoetanol ile RPMI) tam RPMI 1 ml ile değiştirin. </li></ol> Fare 2. İzole BM Hücreleri <ol><li> CO 2 boğulma ve servikal dislokasyon ile fareler Kurban. Bir diseksiyon tepsiye yerleştirin fareler ve% 70 etanol ile sterilize edin. Orta karın bir kesi yapın ve alt ekstremite cilt kapsayan dahil farenin distalinde cilt kaldırın. </li><li> Yarı steril kaput fareler parçalara ayır. Femur ve fibula bırakın, diz ekleminin altında yukarıda femur ve fibula klibi. Makas kullanarak kemiklerden kasları ayırın ve RPMI tamamlamak ml 5 içeren 6 cm&#39;lik petri kemikleri yerleştirin. </li><li> Bir steril kültür kaputu taşıyın. Tam RPMI ile 27G iğnesi bağlı bir 3 ml şırınga doldurun. Makas kullanarak kemiklerin iki ucunu kesti ve yavaşça her iki ucundan bir kez tam RPMI enjekte edilerek kemiklerin dışarı iliği temizlemesini 27G iğne takın. </li><li> Hücreler yukarı ve aşağı 3-5 kez iğne olmadan şırınga kullanılarak kültür çanak nazik pipetleme tek bir hücre süspansiyonu hazırlayın. </li><li> 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri ve süpernatantı süzün. </li><li> 1 ml tampon maddesi ACK (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM EDTA) 1 dakika için inkübe edilmesi ve tam RPMI 10 hacim ile inceltilerek reaksiyon durdurularak ile lizleyin kırmızı kan hücreleri. Hücreler yerçekimi tarafından ölü hücre kümeleri ve doku artıkları aşağı pelet için 5 dakika bekletin. Not: Bu nedeni canlı hücrelerin yerleşme hücre kaybına neden olacak gibi en fazla 5 dk durmayın. </li><li> Yeni bir tüp bırakarak enkaz yavaş yavaş decant hücre içeren süpernatantOrijinal tüp arkasında. </li><li> Daha sonra, pelet hücreleri çıkarmak ve süpernatant atmak için 500 xg&#39;de 5 dakika santrifüj. </li><li> Toplam dengeleme hücrelerin tekrar FACS tampon maddesi (1x PBS +% 2 FBS + 1 mM EDTA) ul 100 (tipik olarak 4-6 x 10 7 BM hücreleri bir fareden elde edilir). </li></ol> 3. FACS Analizi ve CLPs sıralanması <ol><li> Fc reseptörleri bloke etmek için 1-2 dakika için, anti-CD16 / 32 (hibridom üstte yüzen klonu 2.4G2, 50 ul / tepkime veya 1-2 ug / reaksiyonu) FACS tampon maddesi içinde hücrelere (adım 2.9) ekleyin. Not: Anti-CD16 / 32, aynı zamanda granülositler, monositler ve B lenfositleri içeren Fc reseptörlerini eksprese eden hücrelere antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek üzere ilave edilir Fc blok olarak adlandırılır. </li><li> Aynı zamanda ortam ışığını kaçınarak, buz üzerinde 15 dakika süre ile (4x10 7 hücreleri için) Aşağıdaki fluoresan boya-etiketli antikorlar ile hücreleri boyayan. Antikorlar: PE-konjuge soy belirteçleri, anti-CD3 içeren (0.2 ug her biri) (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD 19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), ve anti-MHC-II (Nimr-4), 0,2 ug anti-c-Kit PerCP Cy5.5- (2B8), 1 ug anti-Sca-1-FITC (D7), 0.4 ug anti-M-CSFR-APC (AFS98) ve 0,2 ug anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li> 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca 3 ml FACS tamponla hücreleri ve santrifüj yıkayın. </li><li> 300 ul FACS hücreler 40 mcM hücre süzgecinden tampon ve filtre hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Kalan hücrelerin kurtarmak ve aynı hücre süzgeci kullanılarak tüp ayırma steril FACS nüfuz etmeye ek bir 100 ul FACS tamponu ile tüp yıkayın. </li><li> Sinyal tespiti için uygun filtre ve voltajlar kullanılarak boyanması hemen sonra akım sitometri analizi yapın. PE- ve PE-Cy7-labelded antikorları ve 633 nm las algılamak için 561 nm lazer, FITC-, PerCP-Cy5.5 etiketli antikorları tespit etmek için 488 nm lazer kullanıner APC-etiketli antikor tespit etmek için. </li><li> C-kit int Sca-1 int M-CSFR - - IL-7Rα + (adım 3.2 lekeli gibi) hücre sıralayıcı kullanılarak sırala dışarı CLPs aşağıdaki belirteçler lin göre. Bir yastıkta tam RPMI 8 ml içeren 15 ml tüp sıralanır hücreleri toplayın. </li><li> Çalışmasının sonunda hücre sıralayıcı ile gösterildiği gibi kriteri hücrelerinin mutlak sayısı kaydedilir. Tipik haliyle, 5x10 4 CLPs bir fare BM&#39;lerine elde edilebilir. </li></ol> 4. Coculture CLPs ve AC-6 <ol><li> , 500 x g&#39;de 10 dakika boyunca aşama 3,7 kriteri hücreleri Santrifüj süpernatantı çıkarın ve 5x10 4 hücre / ml civarında bir hücre yoğunluğuna elde etmek için yeterli tam RPMI hücre pelletini. Tohum 500 hücre / çukur olarak aşama 1.4&#39;te hazırlanan besleyici hücreleri ihtiva eden 12 oyuklu plaka. </li><li> Her bir oyuğa 100 ng FL 19 ml / (hu-Flt3L-Ig M. Manz, Üniversite tarafından sağlanan bir ekspresyon sistemi kullanılarak in-house olarak üretilmiştirty Hastanesi Zürich, İsviçre) ve 37 o C, mikroskop altında DC gelişme periyodik görsel izleme ile% 5 CO 2 inkübe. Not: Piyasada mevcut rekombinant insan FL veya fare FL DC gelişimini desteklemek için hu-Flt3L-Ig için bir yedek olarak kullanılabilir. </li><li> 12. günde süpernatan hücreleri toplamak ve elde edilen süpernatantlar birleştiren tam RPMI ortamına 0.5 ml ile bir kez kuyu yıkayın. Bir hücre kazıyıcı ile yapışık hücrelere 0.5 mL taze orta ekleyin ve hurda. </li><li> 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca hücre içeren her iki parçadan orta ve santrifüj birleştirin. </li><li> 50 ul FACS tampon Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri. 50 ul anti-CD16 / 32 hibridom süpernatant ekleyin ve Fc reseptörleri bloke etmek için 1-2 dakika inkübe edilir. </li><li> Numaralandırmak ve müteakip antikorlar (0,05 ug her biri), anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC, anti-B220 ve-PE tüm hücreleri leke. </li><li> Tarif olarak yıkayın ve santrifüj hücreleriadım 3.3, d. </li><li> CD11c + 100 ul FACS tamponu kapısı hücrelerinin yeniden süspanse ve CDCS (CD11c + CD11b + B220 -) için analiz ve pDC&#39;lerde (CD11c + CD11b - B220 +) 17. </li></ol>

<ol><li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li>
<li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell+lineage%3A+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).</li>
<li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Function+of+Dendritic+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Development and Function of Dendritic Cell Subsets.</a> Immunity. 40, 642-656 (2014).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+professional+type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).</li>
<li>Merad, M., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell homeostasis.</a> Blood. 113, 3418-3427 (2009).</li>
<li>Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+expression+of+the+transcription+factor+e2-2+maintains+the+cell+fate+of+mature+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells.</a> Immunity. 33, 905-916 (2010).</li>
<li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3%2B+lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3%2B+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).</li>
<li>Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+potentials+of+early+lymphoid+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.</a> Blood. 97, 3333-3341 (2001).</li>
<li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).</li>
<li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+differentiation%3A+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121, 11-19 (2013).</li>
<li>Shigematsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+activate+lymphoid-specific+genetic+programs+irrespective+of+their+cellular+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin.</a> Immunity. 21, 43-53 (2004).</li>
<li>Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells%3A+recent+progress+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li>
<li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li>
<li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li>
<li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines%3A+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li>
<li>Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217(2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada CLPs küçük bir sayı, özellikle bir in vitro kültür DClerin sağlam oluşturulması için bir sistem ve PDC tarif eder. Bu kültür sisteminin benzersiz besleyici olarak AC-6 hücreleri, stromal hücre çizgisi, kullanımına bağlıdır. Bu yaklaşım, IL-7, SCF, M-CSF ve FL 20 gibi yalnızca sitokinleri sağladığı gösterilmiştir, ancak, aynı zamanda, gerekli hücre-hücre teması 21 DC gelişimini desteklemek. AC-6 hücreler, birkaç progenitörlerin 8,16,22 in vitro DC gelişme çalışıla...

Dendritik hücreler (DC) bağışıklık tepkilerini 1 kontrolünde önemli bir rol oynamaktadır profesyonel antijen sunan hücrelerdir. DH&#39;ler, heterojen olsa da, genel olarak iki popülasyon olarak sınıflandırılabilir, konvansiyonel DCler (CDCS) ve plazmasitoid DCler (PDC) 2,3. Lenfoid organlara ek olarak, CDCS ve PDC aynı zamanda, akciğer, bağırsak, deri 2 dahil olmak üzere dokuların bulunurlar. CDCS ve pDC&#39;lerde morfolojisi dendrit gibi projeksiyonlar ve daha plazma hücre benzeri olma pDC&#39;lerde şeklini gösteren CDCS ile farklıdır. Buna ek olarak, ortak bir fare DC markör, CD11c, daha çok pDC&#39;lerde göre daha CDCS üzerinde ifade edilir. PDC 2 için, MHC sınıf II yüksek seviyeleri ve kostimülatör moleküller, her ikisi de CD24 + CDCS, - CDCS ve CD11b - Ayrıca, CDCS daha CD11b + CD24 ayrılabilir. Olgun PDC, diğer yandan, selektif Siglec-H ve BST2 4 ifade ettiği gösterilmiştir. Functionally, CDCS PDC olduğundan daha sunan hücrelerin iyi antijen; Ancak, PDC Ben virüs enfeksiyonu veya enflamatuar stimülasyon 5 üzerine interferon türü geniş bir miktarda üretebilir. Her iki CDCS ve PDC kısa ömürlü olduğu ve bu nedenle, sürekli kemik iliği (BM) 6,7 içindeki progenitörlerinden doldurulan olmalıdır. Öldürücü ışınlanmış farelere sık miyeloid progenitör (cmps) ve ortak lenfoid progenitörleri (CLPs) adoptif nakli CDCS ve PDC her iki soy 8-10 elde edilebileceğini göstermektedir. Ancak, RAG1 / 2 ifade ve IgH lokus 11,12 olarak yeniden düzenlenmiş DJ kesimleri sahip pDC&#39;lerde bir alt kümesi vardır. Bu hücreler, aynı zamanda B220 işaretleyicinin ifadesi, bir nükleik asit-algılama reseptörleri (TLR7 / TLR9) ve transkripsiyon faktörlerinin (SPIB ve Bcl11a) 13 de dahil olmak üzere B limfositleri üzerinde, moleküler benzerlikler, lenfoid imzaları olduğuna inanılmaktadır tüm sahiptir. Bu nedenle, CLPs nedeniyle soy benzerlik pDC&#39;lerde in vitro nesil için iyi seçimler olabilir. İnsanlarda ve farelerde hem CDCS ve pDC&#39;lerde sıklığı çok düşük olsa da 6 DH&#39;ler, özellikle de CDCS (örneğin, GM-CSF ya da 11,14 Flt3 ligandı gibi sitokinlerin mevcudiyetinde BM ya da progenitörlerinden in vitro üretilebilir FL ) besleyici içermeyen sistemler kullanılarak 11,15,16. Ancak ne yazık ki, bu FL 11,15,16 kullanılarak in vitro pDC&#39;lerde sayıda üretilmesi mümkün değildir. Daha önce PDC verimli AC-6 besleme sistemi 17 kullanarak CLPs in vitro olarak üretilebilir olduğunu gösterdi. Kültür sisteminde AC-6 stromal hücre çizgisi kullanılarak avantajı, hücre-hücre temas ve CLPs gelen pDC&#39;lerde çok sayıda üretilmesini destekleyen sitokinlerin salgılanmasını sağlamasıdır. Bu sistem ile, üretim oldukça sağlamdır olmasına rağmen, aşağıda anlatılan prosedürlerin dikkat çoğaltma i gereklidirn emri pDC&#39;lerde verimli nesil sağlamak.

<table><tbody><tr><td>Anti-fare Ly6g / Ly6c (PE), klon RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>astar işaretleyici</td></tr><tr><td>Anti-fare NK1.1 (PE), klon PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-fare&nbsp; CD11b (PE), klonM1/70 Biolegend</td><td></td><td>101208</td><td>astar işaretleyici</td></tr><tr><td>Anti-fare CD19 (PE), klon eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>astar işaretleyici</td></tr><tr><td>Anti-fare B220 (PE), klon RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>astar işaretleyici/FACS</td></tr><tr><td>Anti-fare CD3 (PE), klon 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>astar işaretleyici</td></tr><tr><td>Anti-fare CD8a (PE), klon 53-6.7</td><td>Biyoefsane</td><td>100707</td><td>astar işaretleyici</td></tr><tr><td>Anti-fare MHC-II (PE), klon NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>astar işaretleyici</td></tr><tr><td>Anti-fare Ter119 (PE), klon TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>astar işaretleyici</td></tr><tr><td>Anti-fare Thy1.1 (PE), klon HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>astar işaretleyici</td></tr><tr><td>Anti-fare M-CSFR (APC), klon AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-fare c-Kit (PerCP/Cy5.5), klon 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-fare Sca-1 (FITC), klon D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-fare IL-7Ra (PE/Cy7), klon A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td></td></tr><tr><td>FACS Anti-fare CD11c (PerCP/Cy5.5), klon N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-fare CD11b (FITC), klon M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td></td></tr><tr><td>FACS FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Hücre sıralayıcı</td></tr><tr><td>FACS sıralama tüpü&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo FlowJo</td><td>LLC</td><td></td><td>Akış analizi yazılımı</td></tr></tbody></table>

ac-6 besleyici sistemi kullanılarak ortak lenfoid progenitörlerin dan fare plazmositoid dendritik hücreler İn vitro nesil

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) I enfeksiyona veya enflamatuar yanıtlar sırasmda yanıt olarak aktive olmuş (IFN-I) üreten hücreler interferon güçlü bir tipidir. Ne yazık ki, pDC fonksiyonunun çalışma lenfoid organlarda düşük frekansta tarafından engellenmektedir, in vitro DC nesil için mevcut yöntemler ağırlıklı pDC&#39;lerde üzerinde CDCS üretimini tercih. İşte biz verimli in vitro ortak lenfoid atalarıdır (CLPs) den PDC oluşturmak için benzersiz bir yaklaşım sunuyoruz. Spesifik olarak, iletişim kuralı, kemik iliğinden CLPs arındırmak ve Flt3 ligand mevcudiyetinde γ-ışınlanmış AC-6 besleyici hücreler ile coculturing ile PDC oluşturmak için nasıl ayrıntıları açıklanan. Bu kültür sisteminin benzersiz özelliği CLPs AC-6 hücreleri altında göç ve Arnavut kaldırımlı alan oluşturan hücreler, PDC genişletilmesi için kritik bir adım haline olmasıdır. Morfolojik olarak farklı DCler, yani PDC ve CDCS 7, bir bileşim ile yaklaşık 2 hafta sonra elde edildiOptimal koşullarda% 0-90 PDC. Tipik olarak, bu yöntemle üretilen pDC&#39;lerde sayısı kabaca tohumlu CLPs sayısı 100 mislidir. Bu nedenle, bu sağlam bu hücrelerin gelişimi ve fonksiyonu içine daha ileri çalışmalar kolaylaştırmak için gereklidir pDC&#39;lerde sayıda üretmek için hangi yeni bir sistemdir.

4-6x10 7 BM hücrelerinin toplam tipik haliyle femur ve bir 6-8 hafta yaşında, vahşi tipli C57BL / 6 fare tibya izole edilmiştir. CLPs sıralamak için, toplam BM hücrelerinin soy belirteçleri (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 ve MHC-II), anti karşı PE-konjuge antikor ile boyanır c-Kit PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC, anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analiz edilir ve bir hücre sınıflandıncısı ile kriteri. CLP için sıralama strateji Şekil 1 &#39;de gö...

Bu çalışmada, Flt3 ligandı varlığında ortak lenfoid progenitörleri AC-6 besleyici hücrelerle birlikte kültürleyerek verimli bir şekilde pDC üretebilen bir in vitro kültür sistemi sunuyoruz.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Bu prosedürün genel amacı, plazmasitoid dendritik hücrelerin veya PDC'lerin gelişimini incelemek için bu hücreleri üretmenin etkili bir yöntemini sunmaktır. Bu yöntem, PDC gelişiminin nasıl düzenlendiği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, az sayıda öncül hücre kullanarak büyük miktarlarda PDC'nin verimli bir şekilde üretilmesine olanak tanımasıdır.Bu tekniğin uygulamaları, sistemik lupus, atetoz ve sedef hastalığı gibi PDC ile ilişkili otoimmün hastalıkların tedavisine yöneliktir. Prosedürün bugün gösterilmesi, laboratuvardan gelen başarılı bir öğrenci için faydalı olacaktır. Kemik iliği hücresi hasadından bir gün önce, AC6 stromal hücre hattı hücrelerini 12 kuyucuklu plakların her bir kuyucuğuna 5,9 x 10⁴ hücre/kuyucuk olacak şekilde ekleyin ve plakları 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, AC6 hücrelerini 3000 rad ile gama ışınlayın ve kültür ortamını 1 mL komplet ortam ile değiştirin.Ardından, uygun sayıda yetişkin wild type C 57 black six fareyi bir diseksiyon tepsisine yerleştirin ve hayvanları %70 ethanol ile sterilize edin. Daha sonra tepsiyi yarı steril bir davlumbaza

in-vitro-generation-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-from-common

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Dendritik hücreler tarafından ikincil lenfoid organlara Antijen sunumu T hücre aracılı adaptif immün yanıt başlatılması için çok önemlidir. Burada kemik iliği kültürü elde edilen fare dendritik hücreler, aktivasyon, 2-foton görüntüleme için etiketleme göstermektedir.

Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Bu videoda, yetişkin bir farenin kemik iliğinden dendritik hücrelerin (T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücreler) üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

Kaynak: Cruz-Adalia, A., ve diğerleri. T Hücreleri, Dendritik Hücrelerden Transenfeksiyon Yoluyla Bakterileri Yakalar. J. Vis. Uzm. (2016).Bu video, antijene özgü T hücresi-dendritik hücre etkileşimleri yoluyla bakteriyel transenfeksiyonu göstermektedir. Ovalbümin peptidi sunan bakteri ile enfekte dendritik hücreler, doğrudan veya bir zarla ayrılmış T hücreleri ile inkübe edilir. Doğrudan temas, immünolojik sinaps oluşumuna izin vererek bakteri transferini sağlarken, zar etkileşimi engeller.

İmmünolojik Sinaps Oluşumu Yoluyla T Hücrelerinin İn Vitro Bakteriyel Transenfeksiyonu

Bu videoda, yaygın lenfoid progenitör hücrelerden (CLP'ler) plazmositoid dendritik hücreler (pDC'ler) oluşturmak için bir in vitro test gösterilmektedir. Saflaştırılmış CLP'lerin Fms benzeri tirozin kinaz-3 ligandı (FL) varlığında γ ışınlanmış besleyici hücrelerle birlikte kültürlenmesi üzerine, CLP'ler, varlığı akış sitometrisi kullanılarak doğrulanan yapışmayan pDC'lere farklılaşır.

Ortak Lenfoid Progenitörlerden Plazmasitoid Dendritik Hücrelerin İn Vitro Üretimi

Bu video, insan monositlerinden olgunlaşmamış, olgun ve tolerojenik dendritik hücrelerin veya DC'lerin oluşumunu göstermektedir. Monositlerin büyüme faktörleri ve sitokinlerle inkübasyonu, olgunlaşmamış DC'lerin üretimine yol açar. İmmün düzenleyici moleküllere yanıt olarak, olgunlaşmamış DC'ler tolerojenik ve olgun DC'lere farklılaşır.

Monositlerden Olgunlaşmamış, Olgun ve Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi

Tümör immünoterapide kullanım için otolog dendritik hücreler, çok sayıda (DC'ler) oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan yöntem tarif edilmektedir. Gibi bir yöntem monositlerden DC'ler ayırt etmek için, IL-4 ve GM-CSF kullanır. Bu hastaya geri enjekte edilmeden önce olgunlaşmamış DC'lerin olgun ve daha sonra antijen ile yüklenir için uyarılır.

İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması

Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Olgunlaşmamış dendritik hücreler, bağışıklık ve tolerans arasındaki dengeyi düzenlemek için seçici olarak tolerojenik veya olgun dendritik hücrelere farklılaştırılabilir. Bu çalışma, metabolik fenotiplerde farklılık gösteren olgunlaşmamış monosit türevli dendritik hücrelerden (moDC'ler), in vitro tolerojenik ve olgun moDC'lerden üretmek için bir araç sunmaktadır.

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Keşfedin fare plazmasitoid dendritik hücre üretimi için AC-6 besleyici hücre sistemi kullanarak ortak lenfoid progenitörlerin in vitro kültürünü. Bu yöntem otoimmün hastalık araştırmalarında verimli hücre elde edilmesini sağlar.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Daha fazla video keşfet