AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Bu prosedürün genel amacı, plazmasitoid dendritik hücrelerin veya PDC'lerin gelişimini incelemek için bu hücreleri üretmenin etkili bir yöntemini sunmaktır. Bu yöntem, PDC gelişiminin nasıl düzenlendiği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, az sayıda öncül hücre kullanarak büyük miktarlarda PDC'nin verimli bir şekilde üretilmesine olanak tanımasıdır.

Bu tekniğin uygulamaları, sistemik lupus, atetoz ve sedef hastalığı gibi PDC ile ilişkili otoimmün hastalıkların tedavisine yöneliktir. Prosedürün bugün gösterilmesi, laboratuvardan gelen başarılı bir öğrenci için faydalı olacaktır. Kemik iliği hücresi hasadından bir gün önce, AC6 stromal hücre hattı hücrelerini 12 kuyucuklu plakların her bir kuyucuğuna 5,9 x 10⁴ hücre/kuyucuk olacak şekilde ekleyin ve plakları 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, AC6 hücrelerini 3000 rad ile gama ışınlayın ve kültür ortamını 1 mL komplet ortam ile değiştirin.

Ardından, uygun sayıda yetişkin wild type C 57 black six fareyi bir diseksiyon tepsisine yerleştirin ve hayvanları %70 ethanol ile sterilize edin. Daha sonra tepsiyi yarı steril bir davlumbaza taşıyın ve her hayvanın orta abdomen bölgesine insizyonlar yaparak, femur ve tibiaları serbest bırakmak için alt ekstremiteler de dahil olmak üzere distal kısımlardaki deriyi çıkarın; diz eklemlerinin üzerinden femuru ve altından tibiaları kesin ve kemikler toplandıkça kasları kemiklerden ayırmak için makas kullanın. Kemikleri 5 mL complete RPMI içeren 6 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve Petri kabını steril bir kültür davlumbazına aktarın.

Şimdi, 27 gauge iğne takılmış üç mililitrelik bir şırıngayı komple RPMI ile doldurun ve her bir kemiğin her iki ucunu makasla kesin. İğneyi her bir kemiğin içine yerleştirin ve her iki uçtan birer kez nazikçe komple RPMI enjekte ederek iliği dışarı atın. Ardından, iğneyi çıkararak, tek hücre süspansiyonu oluşturmak için hücreleri kültür kabı içerisinde üç ila beş kez nazikçe aspire edin ve boşaltın.

Hücreler santrifüjle çöktürüldükten sonra, eritrositleri bir mililitre CK tamponu ile lize edin ve reaksiyonu 10 hacim tam RPMI ile durdurun. Bir dakika sonra, ölü hücre kümelerinin ve kalıntıların çökmesi için beş dakika bekleyin ve ardından süpernatantı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri tekrar santrifüjle çöktürdükten sonra, ortak lenfoid progenitörleri veya CLP'leri akış sitometrisi ile analiz etmek için toplam kemik iliği hücrelerini 100 µL FACS tamponu içinde süspande ederiz.

Ardından, hücreleri bir ila iki dakika boyunca anti CD 16 to 32 ile FC bloklayın ve bunu hücrelerin uygun antikor kokteyli ile eş zamanlı boyanmasıyla takip edin. Buz üzerinde 15 dakika bekledikten sonra, hücreleri üç mililitre fax tamponu ile yıkayın ve pelletlemiş hücreleri 300 µL taze fax tamponu içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 40 µm'lik bir süzgeçten filtreleyin ve uygun filtreler ile voltajları kullanarak hücreleri hemen bir akış sitometresinde sıralayın.

İlgili hücreler, sekiz mililitre komplet RPMI içeren 15 mililitrelik bir tüpe toplanır. Yüksek düzeyde zenginleştirilmiş bir PDCM popülasyonu oluşturmak için, hasat edilen kemik iliği hücrelerinden doğru CLP popülasyonunun ayıklanması, Z altı feeder sistemi ile in vitro kültürleri için kritik öneme sahiptir. Ayıklama işleminin sonunda, hücreleri santrifüjle çöktürün ve CLP hücre peletini, mililitre başına yaklaşık 5 x 10⁴ hücre yoğunluğu elde edecek kadar komplet RPMI ile yeniden süspanse edin.

Ardından, AC six feeder hücrelerini içeren 12 kuyucuklu plakaya kuyucuk başına 500 hücre ekleyin ve ko-kültürleri 100 nanograms per milliliter FL three ligand ile destekleyin; ardından hücreleri 37 degrees Celsius ve %5carbon dioxide ortamında, mikroskop altında dendritik hücre veya DC gelişimini periyodik olarak görsel olarak izleyerek inkübe edin. 12. günde, ko-kültür süpernatantındaki hücreleri hasat edin ve her kuyucuğu yarım milliliter tam RPMI medium ile bir kez yıkayarak elde edilen süpernatant ve yıkama sıvılarını birleştirin. Daha sonra her kuyucuğa yarım milliliter taze medium ekleyin ve yapışkan hücreleri ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Ayrılan hücreleri yüzen hücrelerle birleştirin ve elde edilen hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Pelleti 50 µL faks tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Ardından hücreleri sayın ve FC bloklamadan sonra CD 11 C, CD 11 b ve B iki 20 ekspresyonu için boyayın.

Az önce gösterildiği gibi, ko-kültür hücreleri daha sonra konvansiyonel CD 11 C pozitif, CD 11 B pozitif, B20 negatif ve plazmasitoid CD 11 C pozitif, CD 11 B negatif, B20 pozitif DC popülasyonlarının varlığı açısından analiz edilebilir; toplamda 4-6 × 10⁷ kemik iliği hücresi, tipik olarak 6-8 haftalık wild-type C57BL/6 fareden femur ve tibiadan izole edilir ve tek bir C57BL/6 fareden yaygın olarak 5 × 10⁴ CLP elde edilir. Az önce gösterilen akış sitometrisi ile sıralamadan sonra, AC6 feeder hücreleri ile ko-kültürün 3. ila 4. günlerinde, yuvarlak şekilli Plazmasitoid DC'lerin cobblestone area forming hücrelerin üzerinde askıda göründüğü cobblestone area forming hücreler ortaya çıkmaya başlar.

Sekizinci güne gelindiğinde, plazmasitoid DC sayısı 12 ile 14. günler civarında zirveye ulaşır; bu noktadan itibaren hücreler tam gelişimlerini tamamlayarak apoptoza girmeye başlar ve sayıları kademeli olarak azalır. Konvansiyonel DC kolonileri daha geç, altıncı ile sekizinci günler arasında ortaya çıkar ve daha büyük, iğ şeklinde bir morfolojiye sahip olup aderen özellik gösterirler. Akış sitometrisi analizi, ko-kültürlerin %91'inin CD11c pozitif, CD11b negatif, B220 pozitif plazmasitoid DC ve %6'sının CD11c pozitif, CD11b pozitif, B220 negatif konvansiyonel DC olduğunu göstererek, bu yöntemle orijinal CLP popülasyonuna kıyasla plazmasitoid DC sayısında 100 katlık bir artış olduğunu ortaya koymaktadır.

Bu prosedürü uygularken, geliştirme sonrası CLP eklemeden önce C6 hücresinin iyi durumda olduğundan ve C yoğunluğunun doğru olduğundan emin olmak önemlidir. Bu teknik, DC biyolojisi alanındaki araştırmacıların, farklı öncüllerden DC gelişimini incelemek için az sayıda projektör kullanma kısıtlamasını aşmalarının yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, C6 BEAT sistemi kullanarak CLP'den in vitro olarak PC'lerin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.