Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu prosedürün genel amacı, besleyici içermeyen koşullarda insan periferik T hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler veya IPC'ler üretmektir. Bu yöntem, IPS hücrelerinin klinik kullanıma nasıl uygulanabileceği de dahil olmak üzere rejeneratif tıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, IPS hücrelerinin, patojenite riskini azaltan olası hasar refaktörü dahil edilmeden tedavi edilebilmesidir.

Bu tekniğin anlamı, bu invaziv hücre örneklemesi ile birlikte gelişmekte olan IPS hücrelerinin tanımlanmamış patojenlere maruz kalma riskini azaltması nedeniyle klinik olarak ilgili IPS hücre bazlı tedavileri genişletir. Dolayısıyla bu yöntem, IPS hizmeti klinik tedavisi hakkında fikir verebilir. Hastalık modelleme koşulları gibi diğer alanlara da uygulanabilir.

10 mililitre heparinize tam kanı 10 mililitre DPBS pipeti ile seyrelterek aktive edilmiş insan T hücrelerini hazırlamaya başlayın. 50 mililitrelik konik bir tüpe 15 mililitre fol çözeltisi. Solüsyonun üzerine tabaka oluşturmak için tüpün iç duvarı boyunca akan seyreltilmiş kanı yavaşça pipetleyin.

Arayüzü bozmamaya dikkat edin. Tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, bir alt şeffaf katman, mononükleer hücreler içeren ince beyaz bir katman ve bir üst sütlü plazma katmanı dahil olmak üzere üç katmanı gözlemleyin.

Mononükleer hücre katmanını, herhangi bir uygun delik çözeltisi aktarmadan 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın. Ardından, toplam hacmi 10 mililitreye getirmek için DPBS ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı atın, hücreleri 10 mililitre DPBS ile yıkayın, tüpü beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra hücrelere bir mililitre KBM 5 0 2 ortamı ekleyin ve hücre kültürü kabını hazırlamak için bir hemo sitometre kullanarak sayın, altı oyuklu bir plakanın kuyularını mililitre başına 10 mikrogram anti-insan CD üç antikor çözeltisi ile kaplayın. Plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte en az 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, antikor çözeltisini sekiz plakadan çıkarın ve bir kez PBS tohumu ile yıkayın, mononükleer hücreleri, iki mililitre KBM 5 0 2 ortamının toplam hacminde santimetre kare başına 2.5 kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda yıkayın, kaplanmış altı kuyucuklu plakalarda hücreleri üç ila yedi gün inkübe edin, bu noktada T hücresi üç ila yedi gün sonra uyum sağlamalıdır. Aktive edilmiş T hücrelerini bir ortamla 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. SNAT'ı çıkarın ve bir mililitre taze KBM 5 0 2 orta ekleyin.

Hücreleri ve plakayı 1.5 kez 10 ila altı hücreye iki mililitre KBM 5 0 2 ortamında, bir anti CD üç antikor kaplı altı kuyucuklu plakanın her bir oyuğuna sayın, daha sonra OC üç SOX iki, KLF dört ve C-M-Y-C-H ve L sendi virüsü çözeltileri, her bir mühendislik Sendai virüsünde buz üzerinde ayrı ayrı ve 10'luk bir enfeksiyon çokluğu. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin. Daha sonra enfekte olmuş hücreleri bir pipetle toplayın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve iki mililitre taze KBM 5 0 2 orta ekleyin. Altı oyuklu bir plakanın kuyucuklarındaki hücreleri değiştirin ve bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat inkübe edin.

Hücreleri geri çekmek için, önce bazal membran matris çözeltisini gece boyunca dört santigrat derecede çözün, düşünce çözeltisinin 0.2 mililitresini 10 mililitre DMM F 12 orta plakada, beş mililitre bazal membran matris çözeltisinde 100 milimetrelik tabaklara çözün. Hücreleri tohumlamadan önce matrisin tabağı kaplamasına izin vermek için plakaları en az 30 dakika oda sıcaklığında bırakın. Bu arada, SAI virüsü ile enfekte olmuş T hücrelerini 15 litrelik konik bir tüpte toplayın ve beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra damağı bir mililitre taze KBM 5 0 2 besiyerinde yeniden süspanse edin ve 30 dakikalık inkübasyon süresinden sonra bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın. Bazal membran matris çözeltisini iki plakadan çıkarın, daha sonra bir kez 10 ila beşinci hücrelere ve ayrı ayrı bir kez 10 ila altı hücreye, 10 mililitre taze MTESR ortamına, ipsc için besleyici hücresiz bir kültür ortamına yeniden süspanse edin. Her hücre süspansiyonunu ayrı bir 100 milimetrelik plakaya pipetleyin.

Plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Ortamı 20 ila 30 gün sonra her gün değiştirmek. Embriyonik kök hücre kolonilerine benzeyen koloniler ortaya çıkmalıdır.

Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her bir oyukta bir mililitre bazal membran matris çözeltisini inkübe ederek IPSC genişlemesi için altı duvar plakası hazırlayın. Bu arada, IPSC kolonilerini içeren kültür plakalarını stereo mikroskop altında görüntüleyin ve tek tek kolonileri 20 mikrolitrelik bir pipetle kazıyarak izole edin. Her koloniyi bir kuyuya ve 20 mikrolitre M-T-E-S-R ortamı içeren 96 duvar plakasına aktarın.

Kolonileri aktardıktan sonra, her oyuğa 200 mikrolitre M-T-E-S-R ortamı ekleyin ve koloniyi bozmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Altı kuyucuklu plakalardan bazal membran matris çözeltisini çıkardıktan sonra, hücreleri tek bir koloniden her bir oyuğa aktarın, daha sonra iki mililitre M-T-E-S-R ortamı ekleyin, hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin ve besiyerini besleyici serbest kültür ve serum serbest ortam kullanarak her gün değiştirin, ipsc insan periferik T hücrelerinden üretildi. İmmünofloresan boyama, nano T üç dört SSEA dört, TRA bir 60 ve TRA 180 1 dahil olmak üzere tipik pluripotent hücre belirteçlerinin ekspresyonunu ortaya çıkardı.

Bu türetilmiş IPSE hatlarında. Bu prosedürü denerken, tüm önemli sterilite ve biyo güvenlik hususlarını göz önünde bulundurarak tüm adımları gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir.