Kolon Kök Hücre Mutasyonların Kantitasyonu

Bu prosedürün genel amacı, kolonik kök hücrelerdeki glukoz altı fosfat dehydrogenaz veya G six PD genindeki fenotipik somatik mutasyonları nicel olarak belirlemektir. Genotoksik olduğu düşünülen ajanlarla hayvanların tedavi edilmesinin ardından bu işlem; öncelikle hayvanların ajanla tedavi edilmesi, G six PD mutasyonu taşıyan bir kök hücrenin progenilerinin bir kripti tamamen doldurması için uygun süre beklenmesi, hayvanın sakrifiye edilmesi, kolonun çıkarılıp "Swiss roll" (İsviçre rulosu) şeklinde form verilmesi ve dokunun sıvı azot içinde dondurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, bir kriyostat kullanarak kolondan lamlar üzerine yedi mikron kalınlığında dondurulmuş kesitler hazırlamaktır.

Doku 37 °C'ye kadar ısıtılır ve ardından doku kesitlerinin etrafında doku boyaması için kuyucuklar oluşturulur. Son adım, doku kesitlerinin G6PD boyama karışımı ile inkübe edilmesi ve ardından kesitlerin bir ışık mikroskobu altında analiz edilmesidir; G6PD aktivitesi olan hücreler maviye boyanırken, fenotipik mutasyonlara sahip olanlar beyazımsı görünür. Nihayetinde, mutasyona uğramış kriptlerin kantifikasyonu, mutasyon frekansını belirlemek için kullanılır.

Bu teknik, kolon karsinojenezindeki kritik hücre popülasyonu olan kök hücrelerdeki glukoz altı fosfat dehidrogenaz somatik mutasyonlarını ölçer. Somatik kök hücre mutasyonlarının belirlenmesiyle, mutasyon sıklığının tedavi edilen hayvanlardaki kolon kanseri vakalarıyla ilişkilendirilmesi mümkündür. Bu yöntem kolondaki kök hücre mutasyonlarına dair öngörüler sağlayabilse de, diğer model organizmalara veya organ sistemlerine de uygulanabilir.

Bir kök hücre nişi belirlenebilirse, bu yönteme yeni başlayan bireyler genellikle MBT çözeltisinin hazırlanmasında zorluk çekeceklerdir. Çözünür hale getirme. MBT çözeltisi, ayrıntılı talimatlara dikkatle uyulmasını gerektirir. Histolojik boyama çözeltisini hazırlamaya başlamak için 50 mL'lik bir tüpe 2 mL pH 7.4 fosfat tamponu ve 35 mL optimal kesme sıcaklığı veya OCT ortamı ekleyin ve pH kağıdı kullanarak karıştırmak için kuvvetlice çalkalayın.

Çözeltinin pH değerinin yaklaşık 7.4 olduğu onaylanmıştır. Ardından, metin protokolünde belirtildiği şekilde, fosfat tamponunda çözünmüş glukoz altı fosfat, ATP ve magnezyum klorür çözeltisi eklenmiş ve çözeltinin pH değerinin yaklaşık 7.4 seviyesinde kaldığı yeniden onaylanmıştır. M-M-P-M-S çözeltisi eklenmiş ve kuvvetlice karıştırılmıştır.

Bu işlem sonucunda berrak, koyu kırmızı bir homojenat elde edilmelidir; ışığa maruz kalımı en aza indirmek için çözeltiyi folyo ile sarın. Çözelti bulanıklaşırsa atılmalıdır. Bu sırada bir yağ banyosu ısıtılmaktadır. Ayrı olarak, iki mililitrelik O-ring kapaklı bir tüp içerisinde 0,4 mililitre dimetilformamid, 0,4 mililitre susuz etanol ve MBT karıştırılarak beş milimolar nitro blue to teraz oleum veya MBT çözeltisi hazırlayın; tüpü gevşekçe kapatın ve MBT çözünene kadar yağ banyosunda kuvvetli bir şekilde kaynatın.

Ardından, MBT çözeltisinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve ardından bunu OCT reaksiyon karışımına ekleyin. Çözelti, zamanla başlangıçtaki turuncu kırmızı renkten koyu kırmızıya veya mor renge dönebilir. Metin protokolünde belirtildiği üzere hayvanlar tedavi edildikten ve dondurulmuş kesitler hazırlandıktan sonra, tabanına silikon gres uygulanmış ve birbirine yapıştırılmış iki çelik pul kullanarak doku boyama için kuyucuklar oluşturun ve çözeltinin yerleştirileceği orta kısmı kesin.

Dondurulmuş doku lamlarını, 37 °C sıcaklıktaki nemli bir odada 10 dakika boyunca ön ısıtmaya tabi tutun. Ardından, doku kesitlerini çevreleyecek şekilde lam üzerine kuyucuklar yerleştirin; her bir doku kesiti kuyucuğuna önceden hazırlanmış G6PD boyama karışımından yaklaşık 0,5 mL ekleyin ve 45 ila 50 dakika boyunca inkübe edin. Lamları sıcak odadan çıkarın ve paslanmaz çelik kuyucukları dikkatlice lamlardan kaldırın.

Slaytları uzun kenarı üzerine yerleştirin ve reaksiyon karışımını süzün, ardından 100 millimolar fosfat tamponu ile 30 ila 60 dakikalık bir yıkama işlemi uygulayın. G six PD boyama çözeltisinin son kalıntılarını gidermek için, kalıntı fosfat tamponunu temizlemek amacıyla slaytları deiyonize su ile beş ila 10 dakika boyunca durulayın. Son olarak, slayt üzerine damla damla fluoro gel ekleyerek dokuyu mühürleyin ve daha sonraki analizler için görüntüler elde etmek amacıyla 30 dakika boyunca kurutun.

Lamı bir ışık mikroskobuna yerleştirin ve 4x büyütmeye ayarlayın. Ardından, incelenen toplam kript sayısını tahmin etmek için boyanmış doku kesitinin fotoğraflarını 5,0 megapiksellik bir kamera ile çekin. Her fare için, yüzey alanı en küçük olan seviyeden bir kesit seçin ve bunu 10x büyütmede görüntüleyin.

Mutant kriptlerin sayısını belirleyin. Aşağıdaki kriterlere göre, kriptin tamamı mavi renkten yoksundur. Kriptin dış yapısı bozulmamıştır.

Mutantlar yan yana bulunan yedi mikronluk kesitlerde gözlemlenir ve iki gözlemci aynı kripti mutant olarak tanımlar. Bu kesitteki kript sayısını görsel olarak sayın ve her kolon için taranan seviye sayısıyla çarpın. DNA hasarı yapan ajan azoksimetan ile tedavi edilen farelerde gözlemlenen mutant kript örnekleri burada görülebilir; solda bir mutant kriptin dikey veya yukarıdan aşağıya görünümünü görüyorsunuz.

Sağda yatay veya yan görünüm yer alırken, bir kriptin mutant olarak kabul edilmesi için kript içindeki tüm hücrelerin kalmış olması gerekir. Az miktarda beyazlık içeren beyaz kriptler, goblet hücrelerinin mukus üretiminden kaynaklanmaktadır. Mutasyon frekansı, gözlemlenen mutant sayısının, taranan toplam kript sayısına bölünmesiyle hesaplanır.

Kontrol farelerinin kolonlarında, 1 x 10⁻⁵'ten düşük bir mutasyon frekansını temsil eden Crip'ler gözlemlenirken, azoksimetan uygulanan farelerde kök hücre mutasyon frekansı 4,44 x 10⁻⁴ olarak görülmüştür. Bu prosedürün ardından, kimyasal ajanın mutasyon için nasıl yanlış kodlama yaptığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, glukoz-6-fosfat dehidrogenaz mutasyonlarının tipinin genetik analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, potansiyel mutajenik ve karsinojenik bileşiklerle tedavi edilen farelerde somatik kök hücre mutasyonlarının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.