Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, FCI fareleri olarak bilinen transgenik floresan ubiquitination hücre döngüsü farelerinin subventriküler zonundan izole edilen, sıralanmış nöral kök hücrelerin ve onların progeny'lerinin hücre döngüsü ilerlemesini takip etmektir. Bu işlem, ilk olarak transgenik yetişkin fare beyinlerinin subventriküler zonunun diseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, nöronal dokunun papayin işlemi kullanılarak tek hücre süspansiyonuna ayrılmasıdır.

Ardından, durgun nöral kök hücreleri, aktive olmuş nöral kök hücreleri, transit amplifikasyon hücreleri ile immatür ve göç eden nöroblastları tanımlamak amacıyla subventriküler zonun farklı nörojenik hücre popülasyonları antikorlar kullanılarak işaretlenir. Son adım, hücreleri poli-D-lizin kaplı plakalara ekmeden önce FACS kullanarak doğrudan taze kültür ortamına ayırmaktır. Nihayetinde, çeşitli transgenik hücreler hücre döngüleri sırasında farklı zaman noktalarında floresan yaydığı için, ekilen hücrelerin hücre döngüsü ilerlemesini incelemek amacıyla sürekli zaman ayarlı video mikroskopisi kullanılır.

Hücre ayıklama tekniğinin Fuji teknolojisi ile birleştirilmesi, subventriküler zonun farklı hücre popülasyonlarının görselleştirilmesine ve izole edilmesine olanak tanıyarak yetişkin hareketli beynindeki özelliklerin ve dinamiklerin incelenmesini sağlar. Bu yöntem, yaşlanma ve beyin patolojileri bağlamındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Deneyden bir gün önce, kuyucukların tabanını kaplamak için steril siyah duvarlı 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna yaklaşık 200 µL 10 µg/mL poly-D-lysine çözeltisi ekleyin; plakayı kapatın ve ertesi güne kadar 37 °C'de inkübe edin.

Poly D lizin çözeltisini uzaklaştırın ve plakayı laminer akış altındaki çeker ocakta en az iki saat kurumaya bırakmadan önce kuyucukları steril distile su ile üç kez durulayın. Hemen kullanılmayacaksa, kurutulmuş kaplanmış plakayı dört derece santigrat sıcaklıkta yedi güne kadar saklayın.

Ardından, Papain disosyasyon çözeltisini hazırlayın ve karışımı 0.2 mikronluk bir filtreden geçirerek sterilize edin. Çözeltiyi kullanmadan önce 37 °C'ye kadar ön ısıtmaya tabi tutun. Ayrıca, steril TM F 12 medyumuna mililitre başına 0.7 miligram inhibütör tip iki tripsin ekleyerek bir proteaz inhibitör çözeltisi hazırlayın.

Çözeltiyi 0,2 mikronluk bir filtre kullanarak süzün ve kullanmadan önce 37 derece santigrat sıcaklığa kadar ön ısıtmaya tabi tutun. Yetişkin bir fucci red fare beyninden yeni diseke edilmiş subventriküler zonu, PBS içinde %0,6 glukoz içeren bir Petri kabına yerleştirin ve büyük parçalar kalmayana kadar dokuyu inceyine getirin. Ardından her şeyi 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 200 xg hızda santrifüjleyin.

Doku pelletlendikten sonra, süpernatantı ve resuspansiyonu atın. Dokuyu, 0,01 mg/mL DNase I ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış bir mililitre papain içinde süspanse edin. Karışımı 37 °C'deki bir su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, 200 ×g'de beş dakika daha santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Enzimatik sindirimi durdurmak için bir mililitre Ön Isıtılmış OVO MOID çözeltisi ekleyin. Daha sonra, parçalanmış dokuyu pipetleme işlemi sırasında mekanik olarak tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için bir P 1000 mikropipet ucu kullanarak nazikçe 20 kez yukarı aşağı pipetleyin.

Hücrelerin ekstra strese girmesine neden olacak hava kabarcıklarının karışıma girmesinden kaçının. Hücre süspansiyonunu, yeni bir 15 mililitrelik tüp içerisindeki steril 20 mikronluk bir filtreden geçirin. Hücre kaybını önlemek için hücre filtresini 0.15%BSA içeren iki mililitre PBS ile yıkayın.

Ardından hücre süspansiyonunu 10 dakikayla 200 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın. Her fareden elde edilen hücreleri öncelikle %0,15 BSA içeren 100 µL PBS içinde süspanse ederek faktör boyamasını gerçekleştirin.

Eşlik eden metin protokolünde açıklandığı üzere, dört kontrolün her birini hazırlamak için farelerden birinden alınan hücrelerin onda birini kullanın. Burada listelenen primer antikorları hücre ayırma için kullanılan tüplerin her birine ekleyin ve karışımları dört derece Celsius'da, karanlıkta 20 minutes boyunca inkübe edin. Primer antikorlarla inkübasyonun ardından, hücreleri %0.15 BS, A içeren 1 ml PBS ile yıkayın ve ardından hücreleri 200 ×g'de 10 minutes boyunca santrifüj edin.

Hücreleri, beyin başına 0,15% BSA içeren 200 µL PBS içinde yeniden süspande edin ve uygun hücre ayıklama tüplerine aktarın. Hücre ayıklama tüplerini buza yerleştirin ve canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için, hücre ayıklama işleminden hemen önce hücrelere 2 µg/mL konsantrasyonda Hoechst 33258 boyası gibi bir canlılık boyası ekleyin.

Ardından, negatif kontrol tüpündeki hücreleri akım sitometresinden geçirin ve yan saçılım (side scatter) ile ileri saçılım (forward scatter) parametrelerini kullanarak hücreleri seçin. Yalnızca negatif fraksiyona ait kancaları (hooks) kapılayarak ölü hücreleri ve negatif fraksiyona sahip puls seçimini yaparak dubletleri hariç tutun. Tek renk kontrollerini çalıştırın ve gerekirse fotomultiplier tüp voltajlarını ayarlayın.

Yazılımın kompanzasyon penceresinde renk kompanzasyonu gerçekleştirin. Üç floresan eksi bir kontrolünü çalıştırın ve sıralama kapılarını (gates) çizin. Tüm kapılar ayarlandıktan sonra, işaretli hücreleri doğrudan 100 µL kültür ortamına sıralayın.

Yeni ayrıştırılmış hücreleri, kuyuk başına 1000 ila 3000 hücre yoğunluğunda olacak şekilde, 300 µL kültür medyumu ile birlikte polilizin kaplı 96 kuyucuklu plakalara ekleyin. Kültür plakalarını 37 °C ve %5 karbondioksit altında en az bir saat inkübe edin.

Hücre yapışmasını sağlamak için, entegre sıcaklık kontrollü hazneyi %5 karbon dioksit atmosferi altında 37 °C'ye önceden ısıtarak konfokal lazer tarama mikroskobunu görüntüleme için hazırlayın. 96 kuyucuklu plakayı önceden ısıtılmış mikroskop haznesinin içine yerleştirin ve ilk kuyucuğu odaklayın. Ardından görüntüleme yazılımını açın ve ana pencerede sağ tıklayarak acquire acquisition controls ve DEAC acquisition seçeneklerini belirleyin.

TI pedini açmak ve ardından plan A PO VC 20 XDIC objektifini seçmek için, görüntüleme kontrollerine (acquire acquisition controls) tıklayın ve ardından zaman atlamalı çekim (time-lapse) seçeneklerini açın. Her kuyucuğun merkezini bir sahne konumu olarak ayarlayın ve geniş görüntü seçeneğini yedi çarpı yedi milimetre kare olarak belirleyin. Her birinin merkezi etrafında bir mozaik görüntü gözlemleyin.

Büyük mozaik görüntü için örtüşmeyi %5 olarak ayarlayın ve resimlerin 24 saat boyunca her 20 dakikada bir çekileceği şekilde frekansı belirleyin. Ayarlar kısmından, menü çubuğunda listelenen her bir floresan için fotomultiplier tüp voltaj seviyesini seçin. Görüntüleri, 512 x 512 piksel formatında yüksek hızlı bir rezonans tarayıcı kullanarak elde etmeyi seçin ve hücreleri görselleştirmek için DIC kullanın.

Ardından, veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin. Veri toplama işlemine başlamak için ND toplama penceresindeki "run now" butonunu seçin. Her şeyin düzgün çalıştığından emin olmak için bilgisayar başındaki işlemleri en az bir döngü boyunca takip edin.

Zaman atlamalı video mikroskobisi kullanarak G1 fazını kırmızı floresans ile takip etmek için Fuji red fareler kullanılmıştır. İzole hücreler ilk büyüme fazında kırmızı floresan rengindedir; sentez, ikinci büyüme fazı ve mitoz sırasında ise renk listemizde yer alan renkleri alırlar. Lex pozitif eeg FR pozitif ve eeg.

Genç erişkin ve orta yaşlı farelerden elde edilen FR pozitif hücreler ekildi ve mikroskopi aracılığıyla takip edildi. S ve G2/M evre süreleri, gerek genç gerekse orta yaşlı farelerde, Lex pozitif EGFR pozitif ve EGF-R pozitif hücreler arasında herhangi bir fark göstermedi. Bununla birlikte, ilk bölünmeden kırmızı floresan sönerkenye kadar olan sonraki büyüme evresinin süresinin, G1 evre süresindeki artış nedeniyle daha yaşlı hücrelerde daha uzun olduğu tespit edildi.

Ekimden beş gün sonra elde edilen nörosferler, yaşlı farelerden alınan Lex pozitif EGFR pozitif hücrelerde daha küçüktür. 12 fare ile çalışıldığında, tüm protokol dissection ve fiksasyon hazırlığı için üç saati, hücre ayıklama için ise başka bir üç saati geçmemelidir. Aynı günde çok fazla fare ile çalışmanın, hücre ayıklama süresini artıracağını ve bunun sonucunda hücre ölümünde veya hücre farklılaşmasında artışa yol açabileceğini unutmayın.