Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, FCI fareleri olarak bilinen transgenik floresan ubikitinasyon hücre döngüsünün subventriküler bölgesinden izole edilen sıralanmış nöral kök hücrelerin ve bunların soylarının hücre döngüsü ilerlemesini takip etmektir. Bu, önce transgenik yetişkin fare beyinlerinin subventriküler bölgesinin diseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, bir papaya tedavisi kullanarak nöronal dokuyu tek hücreli bir süspansiyona ayırmaktır.

Daha sonra, subventriküler bölgenin farklı nörojenik hücre popülasyonları, hareketsiz nöral kök hücreleri, aktive edilmiş nöral kök hücreleri, transit amplifiye edici hücreleri ve olgunlaşmamış ve göç eden nöroblastı tanımlamak için antikorlar kullanılarak etiketlenir. Son adım, hücreleri poli D lizin kaplı plakalar üzerine kaplamadan önce doğrudan taze kültür ortamına ayırmak için gerçekleri kullanmaktır. Sonuç olarak, çeşitli transgenik hücreler hücre döngüleri sırasında farklı zaman noktalarında floresan olarak kaplanmış hücrelerin hücre döngüsü ilerlemesini incelemek için sürekli hızlandırılmış video mikroskobu kullanılır.

Hücre sıralama tekniğinin Fuji teknolojisi ile birleştirilmesi, farklı hücre popülasyonlarının subventriküler bölgeden görselleştirilmesine ve izole edilmesine olanak tanıyarak yetişkin hareket beynindeki özelliklerin ve dinamiklerin incelenmesini sağlar. Bu yöntem, yaşlanma ve beyin patolojileri bağlamında temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir: Deneyden bir gün önce. Kuyuların tabanını kaplamak için steril siyah duvarlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna mililitre başına 10 mikrogramlık bir poli D lizin çözeltisinin yaklaşık 200 mikrolitresinde, ertesi gün plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede örtün ve inkübe edin.

Poli D lizin çözeltisini çıkarın ve plakanın en az iki saat boyunca laminer akış altında davlumbazda kurumasına izin vermeden önce kuyuları steril damıtılmış su ile üç kez durulayın. Hemen kullanılmazsa. Kurutulmuş kaplamalı plakayı yedi güne kadar dört santigrat derecede saklayın.

Daha sonra Papain ayrışma solüsyonunu hazırlayın ve karışımı 0,2 mikronluk bir filtreden geçirerek sterilize edin. Çözeltiyi kullanmadan önce 37 santigrat dereceye ısıtın. Ayrıca, TM F 12 orta sterile inhibitör tip ikide mililitre tripsin başına 0.7 miligram ekleyerek bir proteaz inhibitör çözeltisi hazırlayın.

Çözeltiyi 0,2 mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyin ve kullanmadan önce çözeltiyi 37 santigrat dereceye ısıtın. Yetişkin bir fucci kırmızı fare beyninden yeni kesilmiş subventriküler bölgeyi, PBS'de% 0.6 Glikoz içeren bir Petri kabına yerleştirin, dokuyu büyük parçalar kalmayana kadar kıyın. Sonra her şeyi 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin.

Doku peletlendikten sonra, snat ve resüsü atın. Dokuyu, mililitre DNA başına 0.01 miligram ile desteklenmiş bir mililitre ön ısıtma papain içinde askıya alın. Bir. Karışımı 37 santigrat derecede bir su banyosunda 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra beş dakika boyunca 200 kez G'de tekrar santrifüjleyin ve çalıntıyı atın. Enzimatik sindirimi durdurmak için bir mililitre Prewarm OVO MOID solüsyonu ekleyin. Ardından, pipetleme sırasında kıyılmış dokuyu mekanik olarak tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için 20 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetlemek için bir P 1000 mikro pipet ucu kullanın.

Karışıma hücrelerde ekstra strese neden olacak herhangi bir hava kabarcığı eklemekten kaçının. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik yeni bir tüpte 20 mikronluk steril bir filtreden geçirin. Hücre kaybını önlemek için hücre filtresini %0,15 BSA içeren iki mililitre PBS ile yıkayın.

Daha sonra hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Önce her fareden hücreleri %0,15 BSA içeren 100 mikrolitre PBS'ye süspanse ederek gerçek boyamayı gerçekleştirin.

Dört kontrolün her birini ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlamak için farelerden birinden alınan hücrelerin 10'da birini kullanın. Burada listelenen birincil antikorları, hücre sıralaması için kullanılan tüplerin her birine ekleyin ve karışımları karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Birincil antikorlarla inkübasyondan sonra, hücreleri% 0.15 BS, A içeren bir mililitre PBS ile yıkayın ve daha sonra hücreleri 10 dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin.

Hücreleri, beyin başına% 0.15 BSA içeren 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve bunları uygun etkilere aktarın. Sıralama tüpleri. Hücre ayırma tüplerini buzun üzerine yerleştirin ve canlıyı ölü hücrelerden ayırt etmek için hücre ayıklamasından hemen önce hücrelere mililitrede iki mikrogramda kancalı 3 3 2 5 8 lekesi gibi hayati bir boya ekleyin.

Ardından, negatif kontrol tüpündeki hücreleri gerçekler boyunca çalıştırın ve yan saçılma ve ileri saçılma parametrelerini kullanarak hücreleri seçin. Sadece kancaları negatif fraksiyona geçirerek ölü hücreleri hariç tutun ve negatif fraksiyonlu darbeyi seçerek çiftleri hariç tutun. Tek renk kontrollerini çalıştırın ve gerekirse fotoğraf çarpanı tüp voltajlarını ayarlayın.

Yazılımın kompanzasyon penceresinde renk telafisi gerçekleştirin. Üç floresan eksi bir kontrolünü çalıştırın ve sıralama kapılarını çizin. Tüm kapılar kurulduktan sonra, etiketli hücreleri doğrudan 100 mikrolitre kültüre ayırın.

Orta plaka, taze sıralanmış hücreleri, kuyu başına 1000 ila 3000 hücre yoğunluğunda, poli de lisin kaplı üzerine yerleştirin. 300 mikrolitre kültür ortamı içeren 96 kuyulu plaka. Kültür plakalarını en az bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Hücre yapışmasına izin vermek için, bağlı sıcaklık kontrollü odayı %5'lik bir karbondioksit atmosferi altında 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtarak görüntüleme için bir konfokal lazer tarama mikroskobu hazırlayın. 96 kuyulu plakayı ön ısıtma mikroskop odasının içine yerleştirin ve ilk kuyuyu odağa getirin. Ardından görüntüleme yazılımını açın ve edinme kontrollerini ve DEAC edinmeyi seçmek için ana pencereye sağ tıklayın.

TI pedini açmak ve daha sonra A PO VC 20 XDIC hedef planını seçmek için, edinme kontrollerini al'a tıklayın ve ardından hızlandırılmış seçenekleri açın. Her bir bölmenin merkezini bir sahne konumu olarak ayarlayın ve büyük görüntü seçeneğini yediye yedi milimetre kare olarak seçin. Her birinin merkezinde bir mozaik görüntü gözlemleyin.

Büyük mozaik görüntünün üst üste binmesini %5'e ayarlayın ve sıklığı, resimlerin 24 saat boyunca her 20 dakikada bir çekileceği şekilde ayarlayın. Bir artı ayarları altında, menü çubuğunda listelenen her floresan için fotoğraf çarpanı tüp voltaj seviyesini seçin. Beş adet 12 x beş 12 piksel Biçiminde yüksek hızlı bir rezonans tarayıcı kullanarak görüntü elde etmek için seçin ve hücreleri görselleştirmek için DIC'yi kullanın.

Ardından veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin. Alımı başlatmak için ND alım penceresindeki şimdi çalıştır düğmesini seçin. Her şeyin düzgün çalıştığından emin olmak için en az bir döngü boyunca bilgisayar çalışmasını takip edin.

Fuji kırmızı fareleri, hızlandırılmış video mikroskobu kullanılarak kırmızı floresan ile G'nin bir fazını takip etmek için kullanıldı. İzole edilen hücreler ilk büyüme aşamasında kırmızı floresan, sentez sırasında renk listemiz, ikinci büyüme aşaması ve mitozdur. Lex pozitif, eeg, FR pozitif ve eeg.

Genç yetişkin ve orta yaşlı farelerden alınan FR pozitif hücreler kaplandı ve mikroskopi ile izlendi. S ve G iki M faz uzunluğu, genç veya orta yaşlı farelerde Lex pozitif, EGFR pozitif ve EG FFR pozitif hücreler arasında fark göstermedi. Bununla birlikte, ilk bölünmeden kırmızı floresan kapanana kadar bir sonraki büyüme fazının uzunluğunun, G'nin bir faz uzunluğundaki artışa bağlı olarak eski hücrelerde daha uzun olduğu bulundu.

Kaplamadan beş gün sonra elde edilen nöroküreler, yaşlı farelerden elde edilen Lex pozitif EGFR pozitif hücrelerde daha küçüktür. Protokolün tamamı, 12 fare ile çalışırken diseksiyon ve faks hazırlığı için üç saati ve hücre sıralaması için üç saati geçmemelidir. Aynı gün çok fazla fare ile çalışmamızın, hücre sıralama süresinin artmasına ve muhtemelen hücre ölümünün veya hücre farklılaşmasının artmasına neden olacağını unutmayın.